韓琦，梁如宇，張李玲，張魯中，吳紅，楊宇民△，李貴才△

(1.南通大學(xué)神經(jīng)再生江蘇省和教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南通 226001;2.南通大學(xué)神經(jīng)再生協(xié)同創(chuàng)新中心，南通 226001;3.南通大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南通 226001)

1 引 言

周圍神經(jīng)損傷是一種嚴(yán)重影響患者正常生活和健康的疾病[1]。修復(fù)周圍神經(jīng)損傷的金標(biāo)準(zhǔn)是自體移植[2]，但其組織供應(yīng)來(lái)源有限。目前，隨著組織工程和生物材料的發(fā)展，具有良好生物相容性、可降解性、安全無(wú)毒的各類生物材料支架正逐漸應(yīng)用于周圍神經(jīng)損傷的治療中[3]，如膠原、殼聚糖、聚丙交酯膜[4]和聚己內(nèi)酯微納纖維[5]等。

水凝膠是以水為分散介質(zhì)而形成的凝膠，其吸水性、保水性、穩(wěn)定性、柔軟性高，生物相容性好，可作為組織工程材料，用于模擬人體組織[6]，對(duì)于組織的修復(fù)和再生起介導(dǎo)作用[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)水凝膠支架對(duì)周圍神經(jīng)再生具有重要影響，黃銳等[9]用全氟三丁胺(PFTBA)水凝膠聯(lián)合神經(jīng)導(dǎo)管修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損，發(fā)現(xiàn)PFTBA水凝膠能很好地促進(jìn)周圍神經(jīng)的修復(fù)與再生。為了提高水凝膠的力學(xué)性能[10]，Li等[11]制備出一種氧化石墨烯(GO)/聚丙烯酰胺(PAM)復(fù)合水凝膠，并證明水凝膠的疏水性和力學(xué)性能隨著GO濃度的增加而增加，同時(shí)在PAM水凝膠中添加適當(dāng)濃度的GO，可以有效促進(jìn)雪旺細(xì)胞生長(zhǎng)。

微模塑技術(shù)可在生物材料表面產(chǎn)生規(guī)整的微/納米結(jié)構(gòu)，用于模擬細(xì)胞生長(zhǎng)的物理微環(huán)境。高均超等[12]制備了圖案化的聚二甲基硅氧烷(PDMS)軟模板，軟模板上的圖案與硅片硬模板上完全一致。徐盼舉等[13]利用微模塑技術(shù)制作出了一種圖案規(guī)整的氧化石墨烯陣列，并證明該氧化石墨烯陣列具有促進(jìn)PC12細(xì)胞粘附、增殖的作用。微拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)能夠調(diào)控細(xì)胞取向性生長(zhǎng)，但目前多數(shù)研究?jī)H評(píng)價(jià)了單一微米級(jí)或納米級(jí)尺寸的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞行為的影響，鮮有構(gòu)建兼具微米和納米復(fù)合拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)用于調(diào)控細(xì)胞的研究。

本研究聯(lián)合采用溶膠凝膠技術(shù)及微模塑技術(shù)構(gòu)建了表面具有微圖形結(jié)構(gòu)的絲素/殼聚糖/沙蒿籽膠(SF/CS/AS)水凝膠，殼聚糖具有良好的降解性能和抗菌性[14]，但殼聚糖水凝膠力學(xué)強(qiáng)度差[15]；絲素蛋白[16]具有良好力學(xué)性能，且可降解性和生物相容性高[17]；沙蒿籽膠是黏度較高的一種多糖類物質(zhì)，在生物醫(yī)學(xué)中可以作為增稠劑、穩(wěn)定劑和乳化劑等。因此，構(gòu)建SF/CS/AS水凝膠可以優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)[17-18]，進(jìn)一步提高自身的力學(xué)性能、生物相容性、成膜性，作為生物材料可以更好地應(yīng)用到組織工程當(dāng)中。本研究首先對(duì)該凝膠的表面形貌、力學(xué)性能進(jìn)行了評(píng)價(jià)，進(jìn)一步對(duì)成纖維細(xì)胞和雪旺細(xì)胞進(jìn)行了生物學(xué)評(píng)價(jià)，表明具有微/納拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的復(fù)合水凝膠可以促進(jìn)雪旺細(xì)胞的黏附、遷移，期望該研究能夠?yàn)橹車窠?jīng)損傷移植物的選擇和制備提供一定依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)試劑和設(shè)備

家蠶絲素(南通仙基達(dá)繭絲制品有限公司)；殼聚糖(江蘇南通興成生物制品廠)；沙蒿籽膠(寧夏綠洲草業(yè)有限公司)；NaOH(西隴化工股份有限公司)；生理鹽水(Gibco公司)；無(wú)水乙醇(永華化學(xué)科技有限公司)；Na2CO3(西隴化工股份有限公司)；化鋰(上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司)；CH3COOH(Dow Corning公司)；PBS緩沖液(Corning公司)；NaH2PO4·12H2O(西隴科學(xué)股份有限公司)；NaH2PO4·2H2O(西隴科學(xué)股份有限公司)；甲苯胺藍(lán)(Sigma-Aldrich公司)；羅丹明(Sigma-Aldrich公司)；4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(Sigma-Aldrich公司)；HCHO溶液(西隴科學(xué)股份有限公司)；DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Gibco公司)；胎牛血清(Gibco公司)；生理鹽水(Gibco公司)；胰酶(Gibco公司)；膠原酶(Gibco公司)；細(xì)胞表面抗原重組蛋白(Thy，Gibco公司)；多聚賴氨酸(PLL，Gibco公司)。

電子分析天平(shimadzu公司，日本)；磁力攪拌機(jī)(鞏義市英裕予華儀器廠)；超聲震蕩儀(張家港市科宇信超聲有限公司)；光學(xué)顯微鏡(德國(guó)Leica公司)；紫外超凈臺(tái)(上海醫(yī)療器械有限公司)

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1實(shí)驗(yàn)試劑配制 文獻(xiàn)[19]中的方法配制絲素蛋白溶液。配制殼聚糖溶液時(shí)，先配制2%的CH3COOH溶液，再用電子分析天平分別稱取5、2.5、1 g殼聚糖粉末倒入燒杯，加入配好的乙酸溶液，在磁力攪拌機(jī)上攪拌1 d，得到5%、2.5%、1%殼聚糖溶液，裝入試劑瓶中，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。最后配制沙蒿籽膠(AS)溶液，分別稱取0.1、0.2、0.4 gSA粉末溶于10 mL雙蒸水中，充分混勻后，制得1%、2%、4%SA溶液。

2.2.2SF/CS/AS共混膠的制備 將絲素溶液、殼聚糖溶液、沙蒿籽膠粉末按照：10%絲素溶液0.1 mL、2.5%殼聚糖溶液5 mL、沙蒿籽膠粉末100 mg；10%絲素溶液0.5 mL、2.5%殼聚糖溶液5 mL、沙蒿籽膠粉末100 mg；10%絲素溶液0.1 mL、1%殼聚糖溶液5 mL、沙蒿籽膠粉末100 mg；10%絲素溶液0.5 mL、1%殼聚糖溶液5 mL、沙蒿籽膠粉末100 mg配制四組共混膠溶液，依次加入10 mL離心管中并做好相應(yīng)標(biāo)記(分別為A、B、C、D)，放入超聲震蕩儀超聲15 min，并用玻璃棒攪拌，使之充分混勻。

2.3 圖案化共混膠膜的制備與處理

2.3.1圖案化共混膠膜的制備 分別取A、B、C、D組的共混膠50 μL滴在干凈的小圓玻片上，將洗凈的PDMS印章有圖案的一面壓在液滴上，并使液滴完全覆蓋圖案，見(jiàn)圖1。在通風(fēng)干燥實(shí)驗(yàn)臺(tái)上自然風(fēng)干3 d后，將印章與玻片剝離，可得完整的圖案化共混膠膜。再將此膜在4%NaOH溶液下浸泡30 min進(jìn)行脫酸處理，用去離子水洗至pH中性，放入冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 圖案化共混膠膜制備過(guò)程

2.3.2共混膠膜光鏡拍照 將圖案化共混膠膜在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，包括凹槽寬度的各種差異，并利用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行拍照觀察。通過(guò)放大20倍并拍照記錄，可以看出該圖案含有好幾種不同寬度的凹槽，且寬窄交替排列。

2.4 細(xì)胞毒性檢測(cè)

2.4.1成纖維細(xì)胞的接種 首先對(duì)材料進(jìn)行消毒和滅菌，每組設(shè)置三個(gè)平行樣放置于24孔板中，標(biāo)記，在孔板中加入1 mL酒精浸泡30 min后用PBS簡(jiǎn)單清洗3次，再將孔板放入紫外超凈臺(tái)下照射30 min。將成纖維細(xì)胞稀釋為2×104cells/mL，每孔分別種1 mL細(xì)胞液，放入培養(yǎng)箱，培養(yǎng)1、3、5 d后移除細(xì)胞液，加4%的HCHO固定。

2.4.2甲苯胺藍(lán)染色 選出在共混膠膜上培養(yǎng)1 d的成纖維細(xì)胞，用PBS清洗3～5遍，每個(gè)玻片上加入200 μL的甲苯胺藍(lán)染液，置于常溫下染色15～20 min，用PBS洗滌3～5次，然后放置于光學(xué)顯微鏡下拍照。利用ImageTool圖像處理軟件統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)量，并用Origin軟件做出統(tǒng)計(jì)圖。

2.4.3DAPI染色 在24孔板中培養(yǎng)了1、3、5 d的成纖維細(xì)胞用PBS清洗后，向每個(gè)玻片上加入20 μL的DAPI染液(5 μg/mL)，玻片染色30 min，用PBS清洗3遍后，用熒光顯微鏡觀察，整個(gè)過(guò)程避光處理。

2.4.4羅丹明染色 向每個(gè)玻片上均勻加入20 μL羅丹明染液(5 μg/mL)，染色30 min后，吸取PBS 1 mL加入孔板中，清洗玻片3遍，熒光顯微鏡觀察并拍照，整個(gè)過(guò)程要進(jìn)行避光，避免熒光強(qiáng)度減弱。

2.5 雪旺細(xì)胞的粘附、鋪展研究

2.5.1雪旺細(xì)胞的接種 將制作好的圖案化玻片以及無(wú)圖案化(2.5%CS+100 mgAS)對(duì)照組正面朝上放進(jìn)滅菌后的24孔板中，雪旺細(xì)胞(RSC96)的接種同成纖維細(xì)胞，見(jiàn)2.4.1節(jié)。培養(yǎng)板每孔分別種1 mL細(xì)胞液，培養(yǎng)1 d后加4%的HCHO固定。

2.5.2雪旺細(xì)胞的甲苯胺藍(lán)染色 用4%HCHO固定培養(yǎng)1 d的雪旺細(xì)胞，然后PBS清洗3～5次，對(duì)玻片進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色，染色方法見(jiàn)2.4.2節(jié)。然后在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行拍照記錄。利用Image軟件和Origin軟件分析細(xì)胞存活、增殖以及生長(zhǎng)形態(tài)。

2.6 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0進(jìn)行分析，組間樣品比較采用One-way ANOVA,P<0.05為顯著性差異，數(shù)據(jù)表示為mean±SD。

3 結(jié)果與討論

3.1 圖案化共混膠膜光鏡拍照

首先對(duì)樣品采用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行拍照觀察，通過(guò)放大20倍得到的圖片(見(jiàn)圖2)，可以看出該圖案含有10種不同寬度的凹槽，且寬窄交替排列。將微圖案在顯微鏡下拍照后，利用ImageJ軟件對(duì)凹槽的寬度進(jìn)行測(cè)量，根據(jù)凹槽寬度的差異，將該微拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分為9個(gè)區(qū)域，編號(hào)I—IX區(qū)。第I區(qū)凹槽寬度為20 μm，第II區(qū)凹槽寬度主要為5 μm，第III區(qū)凹槽寬度為9 μm，第IV區(qū)凹槽寬度較大，由33 μm和16 μm組成，第V區(qū)凹槽寬度由16 μm和3 μm組成，第VI區(qū)凹槽寬度為16 μm和9 μm，第VII區(qū)凹槽寬度則由40 μm和30 μm組成，第VIII區(qū)凹槽寬度為30 μm和5 μm，第IX區(qū)凹槽寬度則由30 μm和9 μm組成。結(jié)果表明，本研究成功地將PDMS印章通過(guò)微模型法在玻片表面制作了具有微/納復(fù)合的圖案化結(jié)構(gòu)。

圖2 20倍光鏡下微/納米圖案化共混膠膜結(jié)構(gòu)(單位長(zhǎng)度：100 μm)

3.2 細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果分析

3.2.1成纖維細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色 將培養(yǎng)1 d后的成纖維細(xì)胞TBO染色后，在顯微鏡下觀察。由圖3可知，對(duì)于無(wú)微圖案的空白組，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)比較雜亂。而對(duì)于有微/納米條紋圖案的實(shí)驗(yàn)組，成纖維細(xì)胞沿條紋微圖案生長(zhǎng)明顯，特別是在CS濃度為5%的微圖案上，細(xì)胞的取向性生長(zhǎng)更為明顯，而CS濃度為2.5%的微圖案上，細(xì)胞沿條紋微圖案生長(zhǎng)的趨勢(shì)要比5%CS的樣品弱。同時(shí)可以看出，生長(zhǎng)于較小的條紋凹槽寬度的細(xì)胞取向性更好，大部分細(xì)胞能呈長(zhǎng)梭形沿條紋生長(zhǎng)。

圖3 成纖維細(xì)胞的TBO染色圖(單位長(zhǎng)度：100 μm)

通過(guò)ImageTool軟件對(duì)20倍光鏡照片進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。由圖4可知，培養(yǎng)1 d后，在CS濃度為2.5%和5%的微圖案膜上細(xì)胞數(shù)量無(wú)顯著差異，且有圖案和無(wú)圖案的共混膠膜上細(xì)胞數(shù)量差異也不大。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，成纖維細(xì)胞在復(fù)合水凝膠制作的微圖案膜上數(shù)量較多且生長(zhǎng)良好，說(shuō)明該材料經(jīng)脫酸處理后，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，其可以用于研究對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)行為的調(diào)控。

3.2.2成纖維細(xì)胞熒光染色 對(duì)接種有成纖維細(xì)胞的微圖形共混膠膜分別培養(yǎng)1、3、5 d，染色后利用ImageJ軟件進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，見(jiàn)圖5。由圖5可知，在同一個(gè)CS濃度下，細(xì)胞數(shù)量隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加而增多。并且在相同時(shí)間點(diǎn)，CS濃度為5%的微圖案上的細(xì)胞數(shù)量比濃度2.5%的微圖案多，但數(shù)目相差不大。

注：2.5*：2.5%CS+100 mg AS無(wú)圖案；5%*：5%CS+100 mg AS無(wú)圖案；2.5%：2.5%CS+100 mg AS有圖案；5%：5%CS+100 mg AS有圖案。

圖5 第1、3、5 d成纖維細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)圖

利用羅丹明以及染料DAPI分別對(duì)培養(yǎng)1、3、5 d的成纖維細(xì)胞染色后，用熒光顯微鏡對(duì)同一位置的細(xì)胞核和細(xì)胞骨架，在20倍物鏡下進(jìn)行拍照，利用PS軟件將細(xì)胞核與細(xì)胞骨架合成得到圖6。利用合成圖，能夠看出細(xì)胞在微圖案上有較明顯的取向性生長(zhǎng)，即有沿著微圖案條紋生長(zhǎng)的趨勢(shì)，且CS濃度為5%的微圖案上的細(xì)胞沿著條紋凹槽生長(zhǎng)趨勢(shì)更加明顯，這和甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果相符。

圖6 成纖維細(xì)胞的熒光染色圖(紅光圖為羅丹明染色圖，藍(lán)光圖為DAPI染色圖,單位長(zhǎng)度：100 μm)

3.3 雪旺細(xì)胞粘附和鋪展研究

通過(guò)對(duì)接種有雪旺細(xì)胞的4組圖案化以及無(wú)圖案共混膠膜培養(yǎng)1 d后，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)量，由圖7可知，4組圖案化共混膠膜上的都有較多細(xì)胞生長(zhǎng)，說(shuō)明雪旺細(xì)胞能夠很好地粘附于該材料上，且B組細(xì)胞數(shù)量最多，而C組細(xì)胞數(shù)量最少。由圖8可知，四組帶有微/納拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的共混膠膜上的細(xì)胞均能夠沿凹槽生長(zhǎng)，且通過(guò)放大40倍的照片能夠看出，D組對(duì)于雪旺細(xì)胞生長(zhǎng)取向的引導(dǎo)作用更強(qiáng)，而對(duì)照組E組對(duì)雪旺細(xì)胞取向性無(wú)誘導(dǎo)作用。細(xì)胞在微圖案上的鋪展具有一定的取向性，這對(duì)于長(zhǎng)距離的受損神經(jīng)修復(fù)有促進(jìn)作用，與Turunen等[20]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。

圖7 A、B、C、D、E五組培養(yǎng)1d后雪旺細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計(jì)圖

圖8 A、B、C、D、E五組培養(yǎng)1d后雪旺細(xì)胞光鏡圖(左圖紅色框?yàn)樗x區(qū)域，右圖為該區(qū)域40倍放大圖)

微圖案共混膠膜上的微/納拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)并非單一尺寸，而是由9種不同尺寸組合而成，已將9個(gè)區(qū)域分為Ⅰ—Ⅸ區(qū)，對(duì)9個(gè)區(qū)域上的雪旺細(xì)胞進(jìn)行取向角分析。圖9中，在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ區(qū)上的取向角低于10°，說(shuō)明細(xì)胞幾乎是沿著凹槽生長(zhǎng)的。這是因?yàn)棰?、Ⅱ、Ⅲ區(qū)上的凹槽只有一種尺寸，且凹槽尺寸較小，窄條紋限制細(xì)胞的垂直擴(kuò)散，使得細(xì)胞沿著條紋方向水平生長(zhǎng)，故對(duì)雪旺細(xì)胞的生長(zhǎng)能夠起很好地引導(dǎo)作用。而Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ區(qū)的細(xì)胞取向角高于20°，這是因?yàn)檫@三個(gè)區(qū)域均為兩種較大尺寸的混合凹槽，故對(duì)細(xì)胞的取向性引導(dǎo)作用不強(qiáng)。而Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ區(qū)上的細(xì)胞取向角介于10至20之間，且Ⅴ與Ⅶ、Ⅸ區(qū)域凹槽的尺寸為一大一小兩種尺寸混合組成。

圖9 雪旺細(xì)胞在I—IX區(qū)上的取向角統(tǒng)計(jì)圖

關(guān)于微圖案調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)行為的研究已經(jīng)有大量報(bào)道。不同于前人使用單一微圖案拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，本研究采用復(fù)合型的微/納米結(jié)構(gòu)，即在一個(gè)基底平面上含有包括微米級(jí)和納米級(jí)等9個(gè)區(qū)域，10種不同尺寸的凹槽，更好地模擬了人或動(dòng)物體內(nèi)的生理組織結(jié)構(gòu)。通過(guò)細(xì)胞評(píng)價(jià)可以發(fā)現(xiàn)，本研究所涉及的微/納米復(fù)合結(jié)構(gòu)能夠促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞軸突再生，對(duì)細(xì)胞的附著、遷移、生長(zhǎng)和分化均有一定積極作用。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)聯(lián)合采用溶膠凝膠技術(shù)及微模塑技術(shù)，成功構(gòu)建了表面具有復(fù)合微拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的SF/CS/SA復(fù)合水凝膠，該復(fù)合水凝膠無(wú)細(xì)胞毒性，雪旺細(xì)胞能夠在具有微圖形結(jié)構(gòu)的復(fù)合水凝膠膜上很好生長(zhǎng)，并且該微/納拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對(duì)雪旺細(xì)胞的生長(zhǎng)取向具有很好地調(diào)控作用。該研究的開(kāi)展將為微納拓?fù)浠斯ど窠?jīng)移植物修復(fù)周圍神經(jīng)損傷提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對(duì)于開(kāi)發(fā)組織工程的神經(jīng)移植物具有十分重要的指導(dǎo)意義。