夏國燈，嚴(yán) 成, ，李林柯，李 坪，段旻燕，吳映川

（1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽 621010；2.麗江程玫生物科技有限公司，云南麗江 674100；3.麗江程海沁香玫瑰莊園有限公司，云南麗江 674100）

酵素是以動(dòng)植物、菌類等為原料，利用現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)發(fā)酵得到的含有特定生物活性成分的產(chǎn)品，其主要成分為酶、菌催化類以及抗氧化活性物質(zhì)。其具有抗氧化[1]、促進(jìn)新陳代謝、解酒護(hù)肝、預(yù)防心血管疾病[2]、抗糖尿[3]、預(yù)防衰老以及神經(jīng)退行疾病[4]等功能。酵素是一種很特殊的復(fù)雜性蛋白質(zhì)，在人體內(nèi)擔(dān)任新陳代謝各種化學(xué)變化最重要的媒介體[5]。酵素存在于所有活細(xì)胞中，它啟動(dòng)了細(xì)胞的活力，使細(xì)胞展現(xiàn)出種種生命現(xiàn)象。但人體自身只能制造補(bǔ)充部分酵素，其余大部分需要依靠食物不斷補(bǔ)充，近些年來，隨著食用酵素產(chǎn)品被越來越多的被人們認(rèn)知，各種食用酵素產(chǎn)品層出不窮。但目前關(guān)于酵素的研究以及在市場(chǎng)上出現(xiàn)的酵素產(chǎn)品，以果蔬為原料制作的為主，很少有關(guān)于花卉酵素的研究。

玫瑰，又被稱為刺玫花、穿心玫瑰、徘徊花、赤薔薇等，是世界名花之一，屬薔薇科植物[6]。我國是玫瑰花的故鄉(xiāng)，玫瑰花在我國的發(fā)展歷史悠久，廣泛分布于北京、山東、甘肅、云南、四川等地，是我國重要特產(chǎn)經(jīng)濟(jì)植物[7?8]。玫瑰花中含有豐富的花色苷、黃酮、多酚、多糖等活性物質(zhì)，具有排毒養(yǎng)顏、行氣活血、抗氧化、抗菌、抗病毒、利膽解毒之功效[9]。目前，我國的玫瑰花主要應(yīng)用于精油的提取[10?12]、玫瑰花醬的制作、玫瑰花餅干的制作、玫瑰花茶的制作等。在目前已有玫瑰花酵素的工藝研究中，大多以酵母菌復(fù)合其他菌種為發(fā)酵菌種，多以SOD酶活力為單一指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化，且多以專利形式出現(xiàn)[13?14]。針對(duì)玫瑰花酵素科學(xué)性、系統(tǒng)性的研究以論文形式的鮮有報(bào)道。

本試驗(yàn)以玫瑰花為原材料，應(yīng)用現(xiàn)代微生物發(fā)酵技術(shù)，選用乳酸菌對(duì)玫瑰花進(jìn)行發(fā)酵，研制出玫瑰花酵素，促進(jìn)玫瑰花深加工產(chǎn)品發(fā)展，豐富我國酵素的市場(chǎng)，為工業(yè)化生產(chǎn)提供一些數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玫瑰花（法國墨紅）云南麗江程玫生物技術(shù)有限公司；安琪牌果蔬酵素發(fā)酵劑（麥芽糊精、植物乳桿菌N13、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）、瑞士乳桿菌（Lactobacillushelveticus）、腸膜明串珠菌膜亞種（L.mesenteroidessub sp.mesenteroides）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus））湖北安琪酵母股份有限公司；白糖、乳糖 食品級(jí)市售；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、抗壞血酸、2,4,6-三（2-吡啶基）三嗪（TPTZ2,4,6-tris（2-pyridyl）-s-triazine）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical）、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 均為色譜純，上海源葉生物科技有限公司；2,2-聯(lián)氮基-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二氨鹽（ABTS，2,2’-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）、福林酚、碳酸鈉、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁、鄰苯三酚、鹽酸、乙二胺四乙酸二鈉、過硫酸鉀 均為分析純，購于阿拉丁。

HH-8 型數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州市金壇華特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；UV 5800PC型紫外分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；PH-030 型干燥/培二用箱上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；THZ-82A型數(shù)顯氣浴恒溫振蕩器 常州普天儀器制造有限公司；UV1901型紫外可見分光光度計(jì) 四川億科實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；PHS-25 型pH計(jì) 上海越平科學(xué)儀器制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

1.2.2 操作要點(diǎn)

1.2.2.1 玫瑰花預(yù)處理 將玫瑰花用無菌水沖洗干凈后，晾干水分，用沸水燙漂2 min后，取出晾干水分。

1.2.2.2 玫瑰花發(fā)酵基質(zhì)制備及發(fā)酵 分別稱取預(yù)處理過的玫瑰花14 g、白糖17.8 g、乳糖4 g、量取無菌水150 mL到滅菌發(fā)酵罐，采用食品級(jí)碳酸鈣調(diào)整發(fā)酵基質(zhì)pH 5.4，密封。發(fā)酵基質(zhì)放入80 ℃水浴鍋中，密封后巴氏殺菌30 min。在發(fā)酵基質(zhì)溫度降到33 ℃條件下接種1 g發(fā)酵劑到玫瑰花發(fā)酵基質(zhì)中發(fā)酵72 h。待發(fā)酵結(jié)束后濾除玫瑰花花瓣，即得玫瑰花酵素液。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 主要選擇發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、接種量、初始pH四個(gè)工藝參數(shù)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，具體方法如下：

1.2.3.1 發(fā)酵溫度的確定 玫瑰花14 g，乳糖4 g，白糖17.80 g，無菌水150 mL，接種量為1 g，初始pH 4.4，分別在27、30、33、36、39 ℃條件下發(fā)酵72 h。研究其對(duì)玫瑰花酵素液中SOD酶活力以及多酚含量的影響。

1.2.3.2 發(fā)酵時(shí)間的確定 玫瑰花14 g，乳糖4 g，白糖17.80 g，無菌水150 mL，接種量為1 g，初始pH 4.4，發(fā)酵溫度33 ℃，分別發(fā)酵24、48、72、96、120 h。研究其對(duì)玫瑰花酵素液中SOD酶活力以及多酚含量的影響。

1.2.3.3 接種量的確定 玫瑰花14 g，乳糖4 g，白糖17.8 g，無菌水150 mL，初始pH 4.4，發(fā)酵溫度33 ℃，接種量分別為0.4、0.7、1、1.3、1.6 g發(fā)酵72 h。研究其對(duì)玫瑰花酵素液中SOD酶活力以及多酚含量的影響。

1.2.3.4 初始pH的確定 玫瑰花14 g，乳糖4 g，白糖17.80 g，無菌水150 mL，接種量為1 g，發(fā)酵溫度33 ℃，分別在初始pH為2.4、3.4、4.4、5.4、6.4條件下發(fā)酵72 h。研究其對(duì)玫瑰花酵素液中SOD酶活力以及多酚含量的影響。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)玫瑰花酵素發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、接種量、初始pH這4 個(gè)因素進(jìn)行四因素三水平Box-Benhnken Design試驗(yàn)，以玫瑰花酵素SOD酶活力以及多酚含量的綜合評(píng)分（綜合評(píng)分=（SOD酶活力+總酚含量分值）／2，其中SOD酶活力最大為100 分，按線性分配相應(yīng)分值；多酚含量最大值為100 分，按線性分配相應(yīng)分值）為響應(yīng)值，以得到玫瑰花酵素的最佳發(fā)酵工藝，響應(yīng)面試驗(yàn)各因素水平如表1 所示。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and level of Box-Behnken experiment design

1.2.5 指標(biāo)測(cè)定

1.2.5.1 SOD酶活力的測(cè)定 參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.171-2003。

1.2.5.2 總酚含量的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[15]的方法略作改動(dòng)，測(cè)定總酚含量。準(zhǔn)確移取25 μL樣品于50 mL比色管中，加入25 mL蒸餾水和2.5 mL福林酚，搖勻靜置3 min后加入飽和碳酸鈉溶液10 mL，用蒸餾水定容，靜置30 min。于765 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以沒食子酸質(zhì)量濃度對(duì)吸光度作標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到回歸方程：Y=68.714X+0.011（X為沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度，單位為mg/mL；Y為吸光度，R2=0.9991）總酚含量以每毫升樣品中總酚類化合物相當(dāng)于沒食子酸的質(zhì)量表示（mg/mL）。

1.2.5.3 黃酮測(cè)定 采用亞硝酸鈉法測(cè)定黃酮含量[16]。取樣品50 μL于25 mL比色管中，加入1 mL 5%NaNO2溶液，混勻，在室溫下靜置6 min，加入1 mL 10%AlNO3溶液，搖勻靜置6 min后加入8 mL 4%NaOH溶液，用60% 乙醇定容至刻度線，混勻，室溫下反應(yīng)15 min，在510 nm處測(cè)得吸光度值。根據(jù)蘆丁濃度和吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=11.012x?0.0021，（式中y為吸光度的大小，x為標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁溶液的濃度，單位為mg/mL，R2=0.999）總黃酮含量以每毫升樣品中黃酮類化合物相當(dāng)于蘆丁的質(zhì)量表示（mg/mL）。

1.2.5.4 花色苷含量測(cè)定 采用消光系數(shù)法[17]對(duì)玫瑰花酵素中花色苷進(jìn)行測(cè)定。將發(fā)酵得到的玫瑰花酵素用紫外分光光度計(jì)在400～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，以蒸餾水為參比，確定玫瑰花酵素花色苷的最大吸收波長(zhǎng)。根據(jù)式（1）計(jì)算玫瑰花酵素中花色苷含量：

式中：C（mg/100 mL）：玫瑰花酵素花色苷含量；A:最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度值；V1：定容體積（mL）×稀釋倍數(shù)；V2：樣品體積（mL）；98.2：花色苷平均消光系數(shù)。

1.2.5.5 可滴定酸測(cè)定（以乳酸計(jì)）參考GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》。

1.2.5.6 pH測(cè)定 采用pH計(jì)測(cè)定。

1.2.6 抗氧化活性測(cè)定

1.2.6.1 對(duì)DPPH自由基清除作用的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[18?19]方法略作改動(dòng)。加入3.2 mL 0.10 mmol·L?1的DPPH工作液于試管中，加入蒸餾水稀釋的玫瑰花酵素溶液0.8 mL，玫瑰花酵素體積分?jǐn)?shù)分別為：0、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%、0.35%、0.4%、0.45%，混勻后，于25 ℃避光反應(yīng)30 min，在517 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度。按式（2）計(jì)算DPPH自由基清除率（%）。

式中：A0：DPPH溶液的吸光度；A1：玫瑰花酵素+DPPH溶液的吸光度。

1.2.6.2 對(duì)ABTS自由基清除作用的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[20?21]方法略作改動(dòng)。取3 mL ABTS+·工作液于試管中，加入蒸餾水稀釋的玫瑰花酵素溶液0.3 mL，玫瑰花酵素體積分?jǐn)?shù)分別為：0、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%、0.35%、0.4%、0.45%，將其充分混勻后，在25 ℃下避光反應(yīng)10 min，在732 nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品的吸光度。按式（3）計(jì)算ABTS自由基清除率（%）。

式中：A2：空白（蒸餾水）+ABTS溶液的吸光度；A3：玫瑰花酵素+ABTS溶液的吸光度。

1.2.6.3 總抗氧化的測(cè)定 參照方敏[22]李加興[23]等的方法略作改動(dòng)。取蒸餾水稀釋的玫瑰花酵素溶液0.1 mL于25 mL比色管中，玫瑰花酵素體積分?jǐn)?shù)分別為：0、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%、0.35%、0.4%、0.45%，與6 mL FRAP溶液混合，在37 ℃水浴30 min，然后在593 nm處測(cè)定吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每次試驗(yàn)均進(jìn)行3 次重復(fù)操作，試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理、統(tǒng)計(jì)分析和圖標(biāo)繪制采用Excel、Design-Expert 8.06、SPSS 20 和Origin軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵溫度對(duì)SOD酶活力及總酚含量的影響 如圖1 所示，隨著發(fā)酵溫度的不斷上升，SOD酶活力以及總酚含量呈先上升后下降的趨勢(shì)，在33 ℃均達(dá)到最高，SOD酶活力為90.87 U/mL，總酚含量為5.97 mg/mL。當(dāng)溫度>33 ℃時(shí)，SOD酶活力與總酚含量均呈現(xiàn)大幅下降趨勢(shì)。這可能是由于發(fā)酵溫度較低時(shí)，代謝物SOD酶及總酚含量較低，發(fā)酵速度慢；隨著發(fā)酵溫度繼續(xù)增加，乳酸菌內(nèi)酶的活性受到高溫的抑制，因此減緩其新陳代謝[24]，使SOD酶活力及總酚合成率下降。發(fā)酵溫度對(duì)玫瑰花酵素SOD酶活力以及總酚含量的影響具有顯著性（P<0.05）。因此，選擇33 ℃為最佳的發(fā)酵溫度。

圖1 發(fā)酵溫度對(duì)酵素SOD酶活力以及總酚含量的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on enzyme SOD activity and total phenol content

2.1.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)SOD酶活力和總酚含量的影響 如圖2 所示，在一定時(shí)間范圍內(nèi)隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，SOD酶活力與總酚含量增加，在48 h時(shí)SOD酶活力最高，且總酚含量最大。之后再延長(zhǎng)時(shí)間，SOD酶活力與總酚含量均呈下降趨勢(shì)。SOD酶活力下降的原因可能是在48 h內(nèi)乳酸菌處于生長(zhǎng)代謝旺盛期，48 h后隨著乳酸菌的密度增高和衰老轉(zhuǎn)而消耗營養(yǎng)產(chǎn)物，使得次級(jí)代謝產(chǎn)物減少，SOD酶活力降低[25]。延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間可能加速了總酚的氧化分解，導(dǎo)致48 h后總酚含量的下降。發(fā)酵時(shí)間對(duì)玫瑰花酵素SOD酶活力以及總酚含量的影響是顯著的（P<0.05）。因此，選擇48 h為最佳發(fā)酵時(shí)間。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)玫瑰花酵素SOD酶活力以及總酚含量的影響Fig.2 Effect of fermentation time on the activity of fermented rose SOD and total phenol content

2.1.3 接種量對(duì)SOD酶活力與總酚含量的影響 如圖3 所示，隨著接種量的增加，SOD酶活力先增加后減少，總酚含量呈逐漸減少的趨勢(shì)。當(dāng)接種量為0.7 g時(shí)，SOD酶活力達(dá)到最大值，為93.91 U/mL，總酚含量為5.31 mg/mL。當(dāng)接種量>0.7 g時(shí)，SOD酶活力逐漸降低。這可能是由于接種量過大，菌體正常代謝消耗的營養(yǎng)物質(zhì)過多，導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)物減少[26]。接種量對(duì)玫瑰花酵素SOD酶活力與總酚含量的影響具有顯著性（P<0.05）。綜合考慮，選擇接種量0.4～1 g進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

圖3 接種量對(duì)玫瑰花酵素SOD酶活力與總酚含量的影響Fig.3 Effect of inoculum on the activity of fermented rose SOD and total phenol content

2.1.4 初始pH對(duì)SOD酶活力以及總酚含量的影響 如圖4 所示，隨著初始pH的增加，SOD酶活力與總酚含量呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)初始pH為4.4 時(shí)，SOD酶活力與總酚含量均達(dá)到最大值，此時(shí)總酚含量為5.97 mg/mL，SOD酶活力為90.87 U/mL。當(dāng)初始pH大于4.4 時(shí)，隨著pH的增加，總酚含量和SOD酶活力都呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢(shì)。這可能是由于初始pH逐漸增加，抑制乳酸菌的生長(zhǎng)代謝，活菌數(shù)逐漸減少，導(dǎo)致產(chǎn)酶能力降低[27]。初始pH對(duì)玫瑰花酵素SOD酶活力以及總酚含量的影響是顯著的（P<0.05）。因此，選擇pH4.4 為最佳發(fā)酵初始pH進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖4 初始pH對(duì)酵素SOD酶活力及總酚含量的影響Fig.4 The effect of initial pH on enzyme SOD activity and total phenol content

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 根據(jù)單因素結(jié)果，進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Box-Behnken design and results

利用Design expert軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到二次多項(xiàng)回歸模型方程:

響應(yīng)面二次多項(xiàng)回歸方程的方差分析結(jié)果如表3 所示，該模型的F=19.25，P<0.0001，表明該模型極顯著；回歸系數(shù)R2=0.9506，表明建立的該模型可以較好地?cái)M合試驗(yàn)的真實(shí)情況，自變量與響應(yīng)值之間關(guān)系顯著，該二次方程模型可以用來分析和預(yù)測(cè)玫瑰花酵素的最佳發(fā)酵工藝。由ABCD的F值可知，各因素對(duì)玫瑰花酵素綜合品質(zhì)影響的程度為：B>C>D>A，即發(fā)酵時(shí)間>接種量>初始pH>發(fā)酵溫度。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

2.2.2 響應(yīng)面交互分析 為直觀反映各因素及其交互作用對(duì)SOD酶活力和總酚含量綜合評(píng)分的影響結(jié)果，對(duì)回歸方程繪制三維響應(yīng)面圖及其等高線，見圖5。

圖5 各因素交互作用對(duì)SOD酶活力和總酚含量的綜合評(píng)分影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.5 Response surface and contour map of the influence of the interaction of various factors on the comprehensive score of SOD enzyme activity and total phenol content

由圖5 可知，發(fā)酵溫度與初始pH,發(fā)酵時(shí)間和接種量，接種量和初始pH之間的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響顯著或極顯著，其他因素兩兩交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響不顯著。由圖5a可知，等高線接近圓形，因此確定發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度交互作用不顯著。由圖5b可知，隨著發(fā)酵溫度的增加，綜合評(píng)分逐漸增加。當(dāng)發(fā)酵溫度超過33 ℃時(shí)，綜合評(píng)分開始下降。

但隨著發(fā)酵溫度和接種量的改變，綜合評(píng)分的波動(dòng)相對(duì)較為平穩(wěn)，由此可知，發(fā)酵溫度與接種量之間的交互作用不顯著。由圖5c可知，3D圖像呈是向上凸曲面。初始pH一定時(shí)，隨著發(fā)酵溫度的升高，綜合評(píng)分呈先上升后下降的趨勢(shì)；發(fā)酵溫度一定時(shí)，隨著初始pH的增加，綜合評(píng)分先增加，且增大趨勢(shì)越來越不明顯，而后減小，從等高線疏密度可知，發(fā)酵溫度對(duì)綜合評(píng)分的影響大于初始pH對(duì)綜合評(píng)分的影響。兩者之間交互作用顯著。由圖5d可知，發(fā)酵時(shí)間和接種量之間交互作用顯著，綜合評(píng)分在發(fā)酵時(shí)間32～72 h、接種量在0.4～1 g之間有最大值。由圖5e可知，發(fā)酵時(shí)間和初始pH之間的交互作用不顯著。由圖5f可知，接種量和初始pH交互作用極顯著。

2.2.3 最佳發(fā)酵工藝條件的驗(yàn)證 由響應(yīng)面軟件優(yōu)化玫瑰花酵素發(fā)酵工藝條件為：發(fā)酵時(shí)間67.81 h，初始pH 5.32，接種量1 g，發(fā)酵溫度31.27 ℃，該條件下綜合評(píng)分為94.88。綜合考慮，調(diào)整發(fā)酵工藝參數(shù)為：發(fā)酵時(shí)間68 h，初始pH 5.4，接種量1 g，發(fā)酵溫度32 ℃。采取該最佳條件進(jìn)行發(fā)酵所得的酵素綜合評(píng)分為93.20，即SOD酶活力為（132.07±2.31）U/mL，多酚含量為（6.28±0.29）mg/mL，與理論值無顯著差異（P>0.05），表明可利用此模型對(duì)玫瑰花酵素發(fā)酵工藝條件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

2.3 發(fā)酵前后理化指標(biāo)對(duì)比

對(duì)SOD酶活力、總酚含量、黃酮含量的檢測(cè)結(jié)果如表4 所示。玫瑰花酵素發(fā)酵結(jié)束時(shí)SOD酶活力達(dá)到132.07 U/mL，比發(fā)酵前的SOD酶活力提升了4.40 倍。玫瑰花中本身含有黃酮類多酚類物質(zhì)，是天然的抗氧化活性物質(zhì)[28]，玫瑰花中的單聚體酚類物質(zhì)經(jīng)益生菌的轉(zhuǎn)化與利用，含量均有所提升。經(jīng)過發(fā)酵，玫瑰花酵素中總酚含量達(dá)到6.28 mg/mL，與發(fā)酵之前相比，總酚含量提升了45.71%，黃酮含量提升了25.45%。且隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，微生物發(fā)酵產(chǎn)生乳酸、有機(jī)酸等代謝產(chǎn)物，使反應(yīng)體系走向成熟，pH從5.40 下降至4.19。

表4 發(fā)酵前后理化指標(biāo)對(duì)比Table 4 Comparison of physical and chemical indexes before and after fermentation

2.4 玫瑰花酵素抗氧化活性

2.4.1 DPPH自由基清除能力 DPPH法以氮為中心，是一種靈敏、快速、簡(jiǎn)便的評(píng)價(jià)物質(zhì)抗氧化活性的方法[29]。由圖6 可知，玫瑰花酵素原液在發(fā)酵前后具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力，且隨著體積分?jǐn)?shù)的增加，DPPH自由基清除率逐漸增加。在相同體積分?jǐn)?shù)下，發(fā)酵后的DPPH自由基清除率>發(fā)酵前>8 mg/mLVc。這表明，通過發(fā)酵，玫瑰花酵素DPPH自由基清除能力得到顯著提升。這可能是與發(fā)酵后，玫瑰花酵素總酚、黃酮等活性物質(zhì)提升有關(guān)[30]。發(fā)酵前后玫瑰酵素液以及8 mg/mLVc對(duì)DPPH自由基清除的半抑制體積分?jǐn)?shù)分別為0.70%、0.30%、1.50%。

圖6 DPPH自由基清除率能力的比較Fig.6 Comparison of DPPH free radical scavenging ability

2.4.2 ABTS自由基清除能力 ABTS經(jīng)活性氧氧化后會(huì)生成一種穩(wěn)定的藍(lán)綠色陽離子自由基—ABTS+·，自由基產(chǎn)生過多或清除過慢，會(huì)對(duì)生物體產(chǎn)生損害，加速機(jī)體的衰老以及誘發(fā)各種疾病[31]?？寡趸锏拇嬖跁?huì)抑制ABTS+·的產(chǎn)生，顏色會(huì)隨之變淺，在最大波長(zhǎng)734 nm處吸光度值如果減小，表明ABTS+·被清除。如圖7 所示，隨著體積分?jǐn)?shù)的增加，玫瑰花酵素液在發(fā)酵前后同Vc一樣對(duì)ABTS+·清除率逐漸增強(qiáng)。且在相同體積分?jǐn)?shù)下對(duì)ABTS+·的清除率表現(xiàn)為發(fā)酵后的玫瑰酵素液最強(qiáng)，其次是發(fā)酵前的玫瑰酵素液，最弱的是8 mg/mLVc。發(fā)酵前后玫瑰酵素液以及8 mg/mLVc對(duì)ABTS自由基清除的半抑制體積分?jǐn)?shù)分別為0.40%、0.20%、6.80%。

圖7 ABTS自由基清除率能力比較Fig.7 ABTS free radical scavenging ability comparison

2.4.3 總抗氧化能力 FRAP法即鐵離子抗氧化能力法。在酸性條件下，抗氧化物還原Fe3+-TPTZ產(chǎn)生藍(lán)紫色的復(fù)合物—Fe2+-TPTZ，通過測(cè)定此復(fù)合物在最大波長(zhǎng)593 nm處的吸光度，可對(duì)抗氧化能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。吸光度越大，則表明抗氧化能力越強(qiáng)[32]。由圖8 可知，在相同體積分?jǐn)?shù)下，玫瑰花酵素發(fā)酵前和發(fā)酵后的總抗氧化能力遠(yuǎn)高于8 mg/mLVc。且玫瑰花酵素液發(fā)酵后的總抗氧化能力大于發(fā)酵前的玫瑰花酵素液。

圖8 總抗氧化能力比較Fig.8 Comparison of total antioxidant capacity

3 結(jié)論

本文采用響應(yīng)面法對(duì)玫瑰花酵素的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)探究玫瑰花酵素的抗氧化活性。優(yōu)化得到玫瑰花酵素的最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度32 ℃、發(fā)酵時(shí)間68 h，接種量1 g，初始pH5.4。在該條件下得到的玫瑰花酵素SOD酶活力達(dá)到132.07 U/mL，比發(fā)酵前的SOD酶活力提升了4.40 倍，總酚含量達(dá)6.28 mg/mL，與發(fā)酵之前相比提升了45.71%，黃酮含量為3.48 mg/mL，提升了25.45%。此外，該酵素的ABTS自由基清除率、DPPH自由基清除率以及總抗氧化能力較高，且玫瑰花酵素發(fā)酵后的抗氧化能力明顯優(yōu)于發(fā)酵前。說明通過益生菌發(fā)酵，可以制備總酚含量與SOD酶活力較高且具有較好抗氧化活性的玫瑰花酵素產(chǎn)品。玫瑰花酵素的研究豐富了以果蔬為主要原料的酵素市場(chǎng)，為玫瑰花資源利用開辟了新途徑。今后的研究中，還可以利用不同的益生菌進(jìn)行發(fā)酵，深入探索玫瑰花酵素的發(fā)酵過程酶活性、抗氧化活性以及活性成分的變化，為工業(yè)化提供理論依據(jù)。