周海旭，蘇同超，李 姝，冉軍艦，李 波，高 晗，余夢(mèng)薇，薛靜麗，李婧瑜，李曉晴，李忠海,2,

（1.河南科技學(xué)院食品學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003；2.中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南長沙 410004）

樟樹主要生長于中國長江以南地區(qū)，因其可作為中藥而具有極高的開發(fā)價(jià)值[1]。樟樹葉含有多種天然活性成分，例如多酚[2]、黃酮[3]、生物堿[4]、木脂素[4?5]等。其中木脂素是由兩分子C6C3組成的苯丙素及其衍生物組成[6]。目前已從樟樹葉中提取得到的木脂素有芝麻素、（+）-diasesamin[3]，新芝麻脂素[4]，maculation[5]等。研究表明木脂素具有抗氧化[7]、抗癌[8]、抑菌[9]、抗病毒[10]、保護(hù)肝臟[11?12]、抗炎[13?14]等功效。在實(shí)際生活中，樟葉凋落后經(jīng)常被當(dāng)成垃圾丟棄或進(jìn)行焚燒處理，這不僅造成資源的浪費(fèi)，而且還造成環(huán)境的污染。

現(xiàn)有的文獻(xiàn)表明木脂素的提取方法主要有加熱回流法[15]、微波提取技術(shù)[1]、超聲波提取技術(shù)[6]、超臨界提取技術(shù)[16]等。超聲波提取法利用其空穴效應(yīng)、熱效應(yīng)和機(jī)械作用來提高天然產(chǎn)物得率[17]，具有耗時(shí)短、操作簡單的優(yōu)點(diǎn)[18]。與本團(tuán)隊(duì)已研究的微波法[1]相比，超聲波技術(shù)具有高效、便捷的優(yōu)勢(shì)。響應(yīng)面分析技術(shù)采用多元二次回歸方程來擬合影響因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，是有效優(yōu)化工藝條件的方法，可精確表述各個(gè)因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系[19?20]。

因此本研究擬用超聲波提取法輔助提取樟樹葉中的木脂素，并利用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝以獲得樟葉木脂素的最優(yōu)值。在此基礎(chǔ)上，通過HPLC分析純化后樟樹葉木脂素的純度；同時(shí)利用對(duì)DPPH自由基、羥基自由基的清除效果研究樟樹葉木脂素的抗氧化活性；以肝癌細(xì)胞（HepG2）、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）為研究對(duì)象分析樟葉木脂素的細(xì)胞毒性作用，以期將樟葉變廢為寶，為樟葉木脂素應(yīng)用于食品行業(yè)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樟葉 采自校園內(nèi)小葉樟葉樹種；五味子酯甲標(biāo)準(zhǔn)樣品 純度≥98%，上海金穗生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）合肥博美生物公司；芝麻素標(biāo)準(zhǔn)品、松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品純度≥98%，Sigma公司；肝癌細(xì)胞（HepG2 cells ATCC HB-8065）、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC cells ATCC CRL-1730）索萊寶生物科技有限公司；胎牛血清（FBS）BI公司；1640 培養(yǎng)基、雙抗（antianti）、0.25%胰酶（1×）Gibco公司；MTS試劑盒美國貝博生物；其他試劑 均為分析純。

SHB-Ⅲ循環(huán)水式旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；JY92-11 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；UV3700 紫外可見分光光度儀 日本島津公司；S111CO2培養(yǎng)箱 Thermo公司；TC20 細(xì)胞計(jì)數(shù)儀 BIO-RAD公司；DW-HL388?80℃超低溫冰箱 中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司；RT-6000 酶標(biāo)儀 深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司；ICX41 倒置顯微鏡 舜宇光學(xué)科技（集團(tuán)）有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程 樟樹葉→風(fēng)干→粉碎→超聲波輔助提取（3 次）→常溫下浸提提?。?5 ℃，2 h）→離心（4000 r/min,15 min）→濃縮→冷凍干燥（?40 ℃，48 h）→粗木脂素

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 以料液比、超聲時(shí)間、乙醇濃度、浸提時(shí)間為因素，考察各因素對(duì)木脂素提取量的影響。

1.2.2.1 料液比對(duì)樟樹葉木脂素提取量的影響 以超聲波功率300 W，超聲時(shí)間20 min，乙醇濃度60%，浸提時(shí)間60 min為固定條件，考察液料比（g/mL）分別為1:5、1:10、1:15、1:20、1:25 對(duì)樟葉木脂素提取量的影響。

1.2.2.2 超聲時(shí)間對(duì)樟樹葉木脂素提取量的影響以超聲波功率300 W，1.2.3.1 中最優(yōu)料液比，乙醇濃度60%，浸提時(shí)間60 min為固定條件考察超聲時(shí)間為2、3、4、5、6 min時(shí)對(duì)樟樹葉中木脂素提取量的影響。

1.2.2.3 乙醇濃度對(duì)樟樹葉木脂素提取量的影響以超聲波功率300 W，1.2.3.1 中最優(yōu)料液比，1.2.3.2中最優(yōu)超聲時(shí)間，浸提時(shí)間60 min為固定條件，考察乙醇濃度為50%、60%、70%、80%、90%、100%時(shí)對(duì)樟樹葉中木脂素提取量的影響。

1.2.2.4 浸提時(shí)間對(duì)樟樹葉木脂素提取量的影響以超聲波功率300 W，1.2.3.1 中最優(yōu)料液比，1.2.3.2中最優(yōu)超聲時(shí)間，1.2.3.3 中最優(yōu)乙醇濃度為固定條件，分別考察浸提時(shí)間為40、60、80、100、120 min時(shí)對(duì)樟樹葉中木脂素提取量的影響。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以木脂素提取量為指標(biāo)，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)原理進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化超聲波提取技術(shù)提取樟樹葉木脂素工藝條件，響應(yīng)面試驗(yàn)中各因素及水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiment design

1.2.4 木脂素提取量的測定 標(biāo)準(zhǔn)曲線制定：按照周海旭等[1]的測定方法進(jìn)行測定。最終得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.0088X+0.1328，R2=0.9992，其中：X為標(biāo)準(zhǔn)液的濃度（mg/L），Y為吸光度值。

樣品測定：稱取樟樹葉粉末1.0 g，置于50 mL的燒杯中，加入95%乙醇溶液20 mL，超聲輔助提取5 min（300 W），冷卻至室溫，常溫下浸提2 h，真空過濾后離心10 min，取上清液備用[21]。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線制定方法測定樣品中木脂素的濃度，并參照李應(yīng)洪等[22]的計(jì)算方法進(jìn)行木脂素提取量的計(jì)算。計(jì)算公式如式（1）所示:

其中：y—樟樹葉中木脂素提取量，mg/g；c—樟樹葉中木脂素濃度，mg/L；v—樣品體積，L；m—樟樹葉粉末質(zhì)量，g。

1.2.5 木脂素的純化及純度的計(jì)算 按照響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)所得到的最優(yōu)組合進(jìn)行多次提取，收集提取液進(jìn)行濃縮后得到深綠色的膏狀物質(zhì)。按照本團(tuán)隊(duì)前期研究的方法[21]進(jìn)行萃取、分離、純化，高效液相法進(jìn)行純度鑒定。純度計(jì)算公式如式（2）所示：

1.2.6 樟葉木脂素的抗氧化活性研究

1.2.6.1 清除DPPH自由基的能力 參考Lu等[23]的方法并進(jìn)行稍微修改。將處理好的樣品用無水乙醇溶解，VC溶液作為陽性對(duì)照。向DPPH乙醇溶液（3.5 mL，30 mg/L）中分別加入濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的提取液0.5 mL，于517 nm處測定吸光值（X1）；向3.5 mL無水乙醇溶液中分別加入0.5 mL相同濃度的樣品溶液并測定吸光度（X2）；向DPPH乙醇溶液（3.5 mL，30 mg/L）中加入0.5 mL無水乙醇溶液并測定其吸光值（X0），此為空白組。

通過式（3）計(jì)算DPPH·清除率：

其中：X1—樣品在DPPH溶液中的吸光值；X2—樣品在無水乙醇溶液中的吸光值；X0—空白組吸光值。

1.2.6.2 清除·OH的能力 參考牛廣財(cái)?shù)萚24]的方法并進(jìn)行稍微修改。向1 mL濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的樣品溶液中依次加入5 mmol/L鄰二氮菲0.6 mL，pH7.4 磷酸鹽緩沖液0.4 mL，0.01 mol/L FeSO4溶液0.3 mL，0.02 mol/LEDTA溶 液0.3 mL，蒸餾水0.6 mL，0.1%H2O20.8 mL于37 ℃下反應(yīng)1 h，冷卻后于511 nm處測定吸光值A(chǔ)1（樣品）。同樣操作不加入樣品液和H2O2測定吸光值A(chǔ)2（未損傷）；同樣操作不加入樣品液測定損傷吸光度值A(chǔ)0（損傷）通過以下公式計(jì)算清除率。VC溶液作為陽性對(duì)照。通過式（4）計(jì)算·OH清除率：

1.2.7 MTS法測定木脂素的細(xì)胞毒性作用 利用MTS法檢測純化后樟葉木脂素對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC毒性作用。參照Ma等[25]方法進(jìn)行測定。HepG2 和HUVEC細(xì)胞經(jīng)過活化培養(yǎng)后，調(diào)整其細(xì)胞濃度分別為9×104、6×104個(gè)/mL。分別取100 μL于96 孔板中并于37 ℃下培養(yǎng)5 h。吸走舊培基，將含有不同終濃度樣品溶液的培養(yǎng)基（0、50、100、200、300、400 μg/mL）加入到96 孔板中并進(jìn)行培養(yǎng)。顯微鏡下觀察經(jīng)樣品處理后HepG2 和HUVEC細(xì)胞的狀態(tài)以確定培養(yǎng)時(shí)間。每個(gè)濃度重復(fù)3 次。培養(yǎng)完全后，避光下向各孔中加入 10 μL的MTS溶液并培養(yǎng)2 h。之后在490 nm處測定各孔的吸光度（OD值）。

細(xì)胞生長存活率的計(jì)算方法如式（5）所示：

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并通過Origin 8.0 作圖；響應(yīng)面試驗(yàn)通過Design expert 8.0.5 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 料液比對(duì)樟葉木脂素提取量的影響 樟葉木脂素提取過程中主要受到擴(kuò)散作用的影響，溶劑的量越大，則擴(kuò)散速率越大[26]。由圖1 可知，料液比在1:5～1:20 g/mL范圍內(nèi)，木脂素提取量隨著料液比的變化，木脂素提取量由6.89 mg/g增加到23.67 mg/g，當(dāng)達(dá)到1:20 g/mL，木脂素提取量達(dá)到最大值，繼續(xù)改變料液比值，木脂素提取量降低，因此確定最適料液比為1:20 g/mL。

圖1 料液比對(duì)木脂素提取量的影響Fig.1 Effect of solid-to-liquid ratio on the yield of lignans

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)樟葉木脂素提取量的影響 從圖2可以看出，當(dāng)超聲時(shí)間2～3 min時(shí)，木脂素提取量不斷增加，由27.69 mg/g增加到34.39 mg/g；當(dāng)超聲時(shí)間超過3 min，木脂素提取量增加的幅度比較緩慢。這是因?yàn)槌暡ㄆ茐恼翗淙~細(xì)胞，可以促進(jìn)木脂素的提取。但當(dāng)超聲時(shí)間大于3 min，木脂素提取量增加平緩。超聲時(shí)間太久，整個(gè)系統(tǒng)的溫度會(huì)逐漸升高，并且超聲時(shí)間延長會(huì)使部分木脂素被超聲剪切力降解或者高頻運(yùn)動(dòng)產(chǎn)熱降解，這將不利于木脂素的提取[27]。因此確定最適超聲時(shí)間為3 min。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)木脂素提取量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on the yield of lignans

2.1.3 乙醇濃度對(duì)樟葉木脂素提取量的影響 木脂素類物質(zhì)屬于中等極性物質(zhì)，根據(jù)相似相溶的原理，提取液濃度的極性不能太小。從圖3 中可以看出，當(dāng)乙醇由50%到60%時(shí)，木脂素提取量由19.82 mg/g增加到31.54 mg/g。當(dāng)乙醇濃度大于60%以后，木脂素提取量有所降低。因此確定最適乙醇濃度為60%。

圖3 乙醇濃度對(duì)木脂素提取量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on the yield of lignans

2.1.4 浸提時(shí)間對(duì)樟葉木脂素提取量的影響 從圖4中可以看出，在40～80 min內(nèi)，隨著提取時(shí)間的增加，木脂素提取量由31.63 mg/g增加到37.94 mg/g；當(dāng)提取時(shí)間超過80 min，隨著提取時(shí)間的增加，木脂素提取量呈降低趨勢(shì)，這可能是因?yàn)樘崛r(shí)間過長導(dǎo)致木脂素在空氣中暴露時(shí)間長，部分木脂素被氧化[28]，所以確定最適提取時(shí)間為80 min最合適。

圖4 提取時(shí)間對(duì)木脂素提取量的影響Fig.4 Effect of extraction time on the yield of lignans

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以考察的單因素為自變量，以木脂素提取量為響應(yīng)值，利用響應(yīng)面試驗(yàn)進(jìn)行分析，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

2.2.2 響應(yīng)面回歸模型的建立 通過響應(yīng)面相關(guān)軟件對(duì)表2 中的提取量進(jìn)行擬合回歸，得到以下方程：

表2 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)方案及結(jié)果Table 2 The program and result of Box-Benhnken experiment design

Y=44.48+1.52A?1.02B+0.036C?1.60D+1.37AB?0.87AC?3.18AD+1.05BC?0.73BD?2.30CD?2.97A2?4.94B2?5.01C2?3.26 D2

2.2.3 響應(yīng)曲面分析 表3 中回歸模型的P<0.0001，表明該模型極為顯著，失擬項(xiàng)（P>0.05）不顯著，表明方程可以很好地分析數(shù)據(jù)[1]。因此可以利用該數(shù)學(xué)模型計(jì)算粗樟葉木脂素提取量[29]。R2=0.9861，說明木脂素提取量的變化中有98.61%來自于所選試驗(yàn)因素，因此該回歸方程可以很好地描述各試驗(yàn)因素與提取量之間的變化關(guān)系R2adj=0.9653，說明該模型能解釋96.53%響應(yīng)值的變化[30]。

由表3 可知，回歸方程中一次項(xiàng)A、B、D，二次項(xiàng)影響因素的P值均小于0.01，說明其對(duì)木脂素提取量的影響極為顯著；交互項(xiàng)因素影響P值均小于0.01，說明各個(gè)因素對(duì)木脂素提取量均具有極顯著性的影響且它們之間并非簡單的線性關(guān)系。F值表示各個(gè)變量對(duì)木脂素提取量的影響程度，F(xiàn)值越大，表明該因素的影響程度越大[31]。由表3 中F值大小可知，浸提時(shí)間對(duì)樟葉木脂素提取量的影響程度最大，乙醇濃度對(duì)樟葉木脂素提取量的影響程度最小。由圖5 可知，因素之間交互作用對(duì)木脂素提取量呈現(xiàn)的曲面圖均比較陡峭，說明了它們對(duì)木脂素提取量影響均比較顯著。

圖5 料液比、超聲時(shí)間、乙醇濃度、浸提時(shí)間相互作用對(duì)樟葉木脂素提取量影響的曲面圖Fig.5 Response surface of the effect of the liquid-to-solid ratio,ultrasonic time,ethanol concentration,extraction time on the yield of lignans

表3 木脂素提取量的方差分析結(jié)果Table 3 ANOVA analysis of the yield of lignans

對(duì)回歸方程中的自變量求一階偏導(dǎo)從而得到四組二元一次方程[32]。對(duì)此方程組求解，得到A，B，C，D的 值分別為1:22.35 g/mL，3.09 min，63%，78.4 min，在此條件下木脂素提取量45.39 mg/g。為了方便實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行各個(gè)變量最終取值為料液比1:22 g/mL，超聲時(shí)間3 min，乙醇濃度60%，提取時(shí)間78 min。

利用所選取的最優(yōu)條件來驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷目煽啃?。在最?yōu)條件下進(jìn)行5 次試驗(yàn)，木脂素提取量的平均值為45.31 mg/g，這與樟葉木脂素提取量理論值45.39 mg/g基本相同，相對(duì)誤差為0.16%，證明了該模型可以用來預(yù)測樟樹葉中木脂素的提取量。

2.3 樟葉木脂素純度分析

粗木脂素經(jīng)過AB-8 大孔樹脂、硅膠柱色譜純化。運(yùn)用紫外色譜、紅外光譜、質(zhì)譜、核磁共振等方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定[21]，最終得到松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷（圖6）、芝麻素（圖7）。

采用外標(biāo)法對(duì)松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷的純度進(jìn)行判定。由圖6A中可以看出在0.2～1.0 mg/mL范圍內(nèi)隨著樣品濃度的增加，峰值也逐漸增加。峰高與標(biāo)準(zhǔn)品之間存在線性關(guān)系，其線性回歸方程：y=108.73x?0.124,R2=0.999，其中x表示標(biāo)準(zhǔn)品的濃度（mg/mL）。圖6B表示樣品中松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷峰高為82.9 mV。根據(jù)回歸方程可得松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷純度為90.14%。

圖6 不同標(biāo)準(zhǔn)品濃度（A）和樟葉中松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷（B）的液相圖Fig.6 HPLC chromatograms of different concentrations of standard sample (A) and the pinoresinol-β-D-glucoside from Cinnamomum camphora leaves (B)

由圖7A中可以看出0.2～1.0 mg/mL濃度范圍內(nèi)隨著標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度的增加，峰值也逐漸增加。內(nèi)嵌圖表明峰高與標(biāo)準(zhǔn)品存在線性關(guān)系，回歸方程為y=90.70x+3.16，R2=0.996。圖7B表示樣品中芝麻素峰高為104.6 mV。根據(jù)回歸方程可以求出芝麻素的純度為94.84%。

圖7 不同標(biāo)準(zhǔn)品濃度（A）和樟葉中芝麻素（B）的液相色譜圖Fig.7 HPLC chromatograms of different concentrations of standard sample (A) and the sesamin from Cinnamomum camphora leaves (B)

2.4 樟葉木脂素的抗氧化性研究

2.4.1 清除DPPH自由基的作用 DPPH法是一種被國內(nèi)外廣泛應(yīng)用于評(píng)價(jià)天然物質(zhì)抗氧化效果的方法。DPPH清除自由基的原理是指在含氫天然抗氧化物質(zhì)存在下，DPPH將被還原為DPPH-H，從而導(dǎo)致試劑的顏色發(fā)生褪色[33]。研究表明，多糖屬于氫供體物質(zhì)，可與自由基反應(yīng)以生成更穩(wěn)定的產(chǎn)物[34]。從圖8 可知在濃度0.2～1.0 mg/mL范圍內(nèi)隨著脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷、芝麻素、VC濃度的增加，DPPH自由基清除率也在增加。由圖可知，VC對(duì)DPPH自由基的清除效果優(yōu)于木脂素，并且清除DPPH自由基的IC50小于0.2 mg/mL；松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷清除自由基的線性方程為y=51.84x+34.19，R2=0.906，經(jīng)計(jì)算松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷清除DPPH自由基的IC50為0.31 mg/mL；芝麻素清除自由基的線性方程為y=50.84x+21.99，R2=0.994，經(jīng)計(jì)算芝麻素清除DPPH自由基的IC50為0.55 mg/mL。由此可知樟葉木脂素具有良好的清除DPPH自由基能力；從IC50值可知清除DPPH自由基的能力為VC>松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷>芝麻素。

圖8 芝麻素和松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷對(duì)DPPH自由基清除作用Fig.8 Effect of sesamin and pinoresinol-β-D -glucoside on DPPH free radical

2.4.2 清除羥基自由基的作用 由圖9 可知，VC和木脂素物質(zhì)對(duì)羥基自由基具有強(qiáng)烈的清除效果。VC清除羥基自由基的線性方程為y=95.45x?1.34，R2=0.966，經(jīng)該方程計(jì)算VC的IC50為0.54 mg/mL；松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷清除羥基自由基的線性方程為y=86.31x?11.76，R2=0.984，經(jīng)計(jì)算松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷清除羥基自由基的IC50為0.71 mg/mL；芝麻素清除自由基的線性方程為y=67.31x?12.96，R2=0.974，經(jīng)計(jì)算芝麻素清除羥基自由基的IC50為0.94 mg/mL。根據(jù)IC50值的大小可以看出VC清除羥基自由基的能力最強(qiáng)，其次是松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷，最后是芝麻素。松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷與芝麻素清除羥基自由基的差異可能是因?yàn)閮烧叻肿咏Y(jié)構(gòu)存在差異。例如羥基數(shù)量越多，抗氧化性能越強(qiáng)；葡萄糖苷配基的數(shù)量多，抗氧化性能越強(qiáng)[35]。

圖9 芝麻素和松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷對(duì)羥基自由基清除作用Fig.9 Effect of sesamin and pinoresinol-β-D -glucoside on ·OH radical

2.5 細(xì)胞毒性作用

采用MTS法檢測松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷、芝麻素對(duì)肝癌細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞生長抑制作用，結(jié)果如圖10、圖11 所示。由圖10 可知，隨著松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷、芝麻素濃度的不斷增加，HepG2 細(xì)胞存活率逐漸減少。兩者濃度在0～400 μg/mL范圍內(nèi)，芝麻素對(duì)肝癌細(xì)胞的生長抑制作用強(qiáng)于松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷。由圖11 可知芝麻素對(duì)HUVEC的毒性作用大于松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷。因此，如果將芝麻素應(yīng)用于食品當(dāng)中，它不僅對(duì)肝癌細(xì)胞有作用還對(duì)人體的正常細(xì)胞HUVEC有毒性作用；而松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷對(duì)HUVEC毒性作用則相對(duì)小些。這主要跟芝麻素和松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷影響細(xì)胞周期及凋亡過程中的相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)有關(guān)。楊永丹[36]研究芝麻素對(duì)肝癌細(xì)胞的影響，結(jié)果表明芝麻素可以影響細(xì)胞周期蛋白Cyclin A和Cyclin B的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，增強(qiáng)抑癌基因p53、p21 和促凋亡因子Bax的表達(dá)量。

圖10 芝麻素與松脂素-β-D-葡萄糖苷對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2 的影響Fig.10 Effect of sesamin and pinoresinol-β-D-glucoside on HepG2 cells

圖11 芝麻素與松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC的影響Fig.11 Effect of sesamin and pinoresinol-β-D-glucoside on HUVEC cells

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)條件得到樟葉木脂素的超聲輔助提取最優(yōu)工藝條件：料液比1:22 g/mL、超聲時(shí)間3 min、乙醇濃度60%、提取時(shí)間78 min條件下，木脂素提取量45.31 mg/g。經(jīng)驗(yàn)證，實(shí)際值與預(yù)測值之間的相對(duì)誤差僅為0.16%，表明了該模型具有較高實(shí)用性。粗提物經(jīng)過分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定后確定出兩種木脂素類物質(zhì)即芝麻素、松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷。利用高效液相色譜法確定芝麻素、松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷的純度分別為94.84%和90.14%。對(duì)所得的木脂素進(jìn)行抗氧化活性研究表明了芝麻素、松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷對(duì)DPPH自由基和羥基自由基有較好的清除效果，且清除效果隨著濃度的增加而增加；MTS實(shí)驗(yàn)表明芝麻素、松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷均對(duì)HepG2、HUVEC有不同程度的抑制作用，其中芝麻素對(duì)肝癌細(xì)胞的毒性作用強(qiáng)于松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷，這可能與兩者之間的結(jié)構(gòu)有關(guān)系，需要進(jìn)一步的研究。芝麻素、松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷對(duì)肝癌的毒性作用機(jī)理需要深入研究。