劉 超，李 坤，白曉軒，楊宇純，薛艷紅，劉士平

（三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院，中國(guó)輕工業(yè)功能酵母重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北宜昌 443002）

近年來，寡肽類抗生素在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)和飼料添加劑等領(lǐng)域正在發(fā)揮越來越大的作用[1?4]，如環(huán)孢霉素等。與傳統(tǒng)的抗生素相比，寡肽結(jié)構(gòu)多樣、廣譜高效、分子量小、穩(wěn)定性好、溶解度高且不易引起耐藥性，受到了科學(xué)家的廣泛關(guān)注[5?8]。

寡肽類天然產(chǎn)物在生物體中有兩種合成途徑，即核糖體途徑和非核糖體途徑[9]。前者是指通過依賴核糖體的翻譯途徑來合成，通過該途徑合成的寡肽是一種初生代謝產(chǎn)物，在其基因組中一般會(huì)存在編碼目標(biāo)寡肽的氨基酸重復(fù)序列[10?12]，其結(jié)構(gòu)組分一般是20 種天然的氨基酸，如羊毛肽、硫肽和半乳糖肽[13]；而后者是由一種不依賴于翻譯途徑的非核糖體肽合成酶（non-ribosomal peptide synthetase,NRPS）所催化，通過該途徑合成的寡肽是一種次級(jí)代謝產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)中大都含有許多非天然的氨基酸[14?16]，如環(huán)肽素等[17]。為了方便研究寡肽合成的NRPS基因簇，科學(xué)家們根據(jù)非核糖體肽的結(jié)構(gòu)和NRPS的序列及催化特點(diǎn)，開發(fā)出一系列預(yù)測(cè)軟件[18]，如antiSMASH、fungiSMASH、NRPS predictor、Norine等，為解析寡肽生物合成途徑提供了有利條件[19?21]。特別是隨著轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（RNA-Seq）的應(yīng)用[22?23]，人們可以方便地從表達(dá)水平上確定候選的合成基因簇[24?25]，如劉偉等[26]在2018 年利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，篩選出了銀杏類黃酮生物合成途徑的關(guān)鍵基因，并分析了各基因的表達(dá)特征，確定了銀杏黃酮醇類物質(zhì)合成的限速酶基因。

在前期工作中，從三峽地區(qū)的疏花水柏枝（Myricaria laxiflora）的內(nèi)生草酸青霉SG-4（CCTCC M2015270）中，發(fā)現(xiàn)了一種新線性五肽“三峽肽素”，結(jié)構(gòu)是：O-Me-BABA-N-Me-L-Thr-D-Thr-N-Me-LVal-L-Ser，其中BABA是β-氨基丁酸，能抑制柑橘致腐菌，對(duì)人體安全，是一種潛在的保鮮劑[27?28]。為了揭示三峽肽素在草酸青霉中的合成機(jī)制，本研究在完成不同草酸青霉菌株的轉(zhuǎn)錄組分析的基礎(chǔ)上，測(cè)定了SG-4 在不同培養(yǎng)條件下的轉(zhuǎn)錄組序列，為剖析三峽肽素的合成機(jī)理提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

土豆、葡萄糖 科密歐化學(xué)試劑有限公司；瓊脂 金燕海洋生物股份有限公司；色譜級(jí)乙腈 美國(guó)天地有限公司；真菌RNA提取試劑盒 美國(guó)Omega Bio-Tek公 司；Goldenstar? RT6 cDNA Synthesis Kit Ver.2、T3 Super PCR Mix北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司。

BS-224s電子天平 德國(guó)賽多利斯；SW-CJ-2FD型雙人實(shí)驗(yàn)操作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備廠；XPX-9052 MBE數(shù)顯培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；ZQZY-85BN全自動(dòng)控溫?fù)u床 上海知楚儀器有限公司；Master-s15 和泰純水儀 上海和泰儀器有限公司；MyCyclerTM Thermal PCR儀 美國(guó)BIO-RAD公司；GDS-8000 凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)UVP公司；Allegra 64R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)BECKMAN公司；DYCP-31DN水平電泳儀 北京市六一儀器廠；YM30F不銹鋼智能型立式電熱蒸汽消毒器 上海三申醫(yī)療器械有限公司；SPD-16 島津高效液相色譜儀紫外-可見光檢測(cè)器 島津儀器蘇州有限公司；C8液相柱，YMC-Triart C8（250 mm×4.6 mm）日本YMC公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)菌株及培養(yǎng)條件 草酸青霉（P.oxalicum）SG-4 為來源于三峽河岸帶植物疏花水柏枝（M.laxiflora）的內(nèi)生真菌，菌株保藏于4 ℃的PDA固體培養(yǎng)基斜面。

PDA固體培養(yǎng)基：土豆200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，水1000 mL，pH自然，121 ℃滅菌20 min。

草酸青霉SG-4 經(jīng)活化培養(yǎng)以后，采用無菌操作取 1 環(huán)孢子分別接種于裝有PDA液體培養(yǎng)基的三角搖瓶中，培養(yǎng)條件為28 ℃、120 r/min。

1.2.2 菌體量測(cè)量和三峽肽素含量檢測(cè) 將SG-4接種至200 mL PDA液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件按1.2.1 中進(jìn)行，培養(yǎng)2～9 d，每天獲取菌絲和發(fā)酵液，菌絲烘干后稱量，記錄2～7 d的菌體量；發(fā)酵液使用等體積無水乙醇混勻沉淀24 h，將上清液旋蒸凍干獲得粗提物，使用純水將粗提物配制成5 mg/mL的溶液，按照楊宇純等[27]檢測(cè)方法，記錄2～9 d的三峽肽素出峰的峰面積。

具體檢測(cè)方法如下：利用C8色譜柱及高效液相色譜設(shè)備進(jìn)行分析。流速1 mL/min，柱箱溫度為35 ℃，流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為純水。梯度洗脫：0～20 min 90%～0% B。進(jìn)樣量為80 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，記錄5～6 min出峰的峰面積。

1.2.3 SG-4 在不同培養(yǎng)條件下三峽肽素含量檢測(cè)將SG-4 分別接種至200 mL和300 mL的PDA液體培養(yǎng)基中，其中200 mL分別培養(yǎng)4 d和7 d，300 mL培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)條件及三峽肽素檢測(cè)按照1.2.1 和1.2.2 中進(jìn)行。

1.2.4 RNA提取及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 離心獲取200 mL培養(yǎng)4、7 d及300 mL培養(yǎng)7 d的菌絲體，液氮研磨后采用OMEGA試劑盒提取總RNA，提取方法按試劑盒操作方法進(jìn)行，使用Agilent 2100 和NanoDrop對(duì)RNA濃度、OD值（OD260nm/280nm和 OD260nm/230nm）、28S/18S、RIN/RQN值進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)結(jié)果對(duì)RNA進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估。將質(zhì)量檢測(cè)合格的RNA樣品使用BGISEQ-500 進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，操作簡(jiǎn)述如下：先用帶有OligodT的磁珠富集有polyA尾巴的mRNA，再用DNA探針雜交rRNA，利用RNase H選擇性消化DNA/RNA雜交鏈，再用DNase I消化掉DNA探針，純化后即得到所需RNA。然后將RNA片段化，用隨機(jī)的N6 引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步形成雙鏈DNA。將雙鏈DNA末端補(bǔ)平并進(jìn)行5’端磷酸化，3'端形成突出一個(gè)“A”的粘末端，再連接一個(gè)3'端有凸出“T”的鼓泡狀的接頭。然后連接產(chǎn)物通過特異的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和上機(jī)測(cè)序。

1.2.5 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)使用過濾軟件SOAPnuke進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，使用Trimmomatic進(jìn)行過濾，得到clean reads；使用Bowtie2 軟件將clean reads比對(duì)到參考基因序列上。根據(jù)比對(duì)結(jié)果，利用RSEM軟件進(jìn)行定量分析，并以FPKM計(jì)算基因的表達(dá)水平。差異表達(dá)分析重點(diǎn)在于找出樣本之間差異表達(dá)的基因，并對(duì)這些基因進(jìn)行深入挖掘分析。在分析中，差異表達(dá)基因默認(rèn)定義為 FDR≤0.001 且倍數(shù)差異在1 倍以上的基因。篩選獲得的差異表達(dá)基因，根據(jù)GO和KEGG注釋結(jié)果進(jìn)行分類，同時(shí)使用R軟件中的phyper函數(shù)進(jìn)行富集分析。同時(shí)將檢測(cè)到的基因進(jìn)行NR和NT注釋，明確基因所在物種以及基因功能。

1.2.6 RT-PCR驗(yàn)證 使用Oligo 7 軟件設(shè)計(jì)引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒Goldenstar? RT6 cDNA Synthesis Kit Ver.2 將所提RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，添加引物進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證，所用的引物序列見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)中所用的引物序列Table 1 Primer sequences in the experiment

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理軟件使用Graph Pad Prism 8。

2 結(jié)果與分析

2.1 草酸青霉SG-4 不同培養(yǎng)條件下生產(chǎn)能力比較

為了明確三峽肽素的合成特點(diǎn)，分析了SG-4 菌體生長(zhǎng)規(guī)律和合成三峽肽素的時(shí)期，結(jié)果顯示，菌體的生長(zhǎng)在第6 d質(zhì)量達(dá)到最大（圖1A），而三峽肽素在第4 d開始累積，第8 d達(dá)到最大值（圖1B），而在300 mL培養(yǎng)下，SG-4 不產(chǎn)三峽肽素（圖2A，箭頭標(biāo)記處），暗示三峽肽素生物合成的基因受培養(yǎng)時(shí)間和裝夜量的影響，這為研究三峽肽素合成機(jī)制提供了線索。由于基因表達(dá)與物質(zhì)合成呈相關(guān)性[28]，因此，三峽肽素在不同培養(yǎng)條件下的含量差異與其控制合成的基因表達(dá)量相對(duì)應(yīng)，所以選取SG-4 在200 mL分別培養(yǎng)4、7 d以及300 mL培養(yǎng)7 d的菌絲提取RNA進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，通過對(duì)差異基因分析，挖掘三峽肽素合成基因簇。

圖1 SG-4 的生長(zhǎng)（A）和三峽肽素的生產(chǎn)曲線（B）Fig.1 Growth curve (A) of SG-4 and production curve of sanxiapeptide (B)

圖2 三峽肽素在不同培養(yǎng)條件下液相檢測(cè)Fig.2 Determination of sanxiapeptide in different culture conditions by liquid chromatography

2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量分析

將測(cè)序的原始數(shù)據(jù)（raw reads）中的低質(zhì)量、接頭污染以及未知堿基含量過高的數(shù)據(jù)過濾后，平均每個(gè)菌株產(chǎn)生了4278 萬條凈序列（clean reads），平均容量達(dá)6.42 Gb，高質(zhì)量數(shù)據(jù)高達(dá)97.19%。使用Bowtie 2 軟件將獲得的clean reads比對(duì)到參考基因序列上，平均比對(duì)率達(dá)到93.88%（表2），上述結(jié)果表明，此次測(cè)序的質(zhì)量有保證，結(jié)果可靠；同時(shí)使用Trinity對(duì)clean reads進(jìn)行組裝，然后使用Tgicl對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行聚類去冗余得到Unigene，獲得的All-Unigene為 22731 條，將 Unigene與 NR (RefSeq non-redundant proteins) 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)本樣品SG-4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的Unigene與草酸青霉114-2 的Unigene相似數(shù)目最多，高達(dá)85.08%（表3），其它占比則非常少。

表2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序概況Table 2 A survey of transcriptome sequencing

表3 NR物種注釋Table 3 NR Species notes

2.3 差異表達(dá)基因分析

由于三峽肽素含量差異會(huì)體現(xiàn)在基因表達(dá)差異上，因此按照差異的倍數(shù)（|log2（FoldChange）|）和錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）來篩選差異表達(dá)基因[29]，分析中將同時(shí)滿足|log2（FoldChange）|≥1 且 FDR ≤0.001 的轉(zhuǎn)錄本確定為差異表達(dá)基因[30?31]。三個(gè)轉(zhuǎn)錄組中的表達(dá)發(fā)生顯著變化的基因數(shù)見表4。

表4 差異表達(dá)的基因數(shù)Table 4 Number of genes differentially expressed

上述結(jié)果表明，高產(chǎn)（S7-2）相較于低產(chǎn)（S4-2）和不產(chǎn)（S7-3），其差異表達(dá)的基因占比相近，且明顯集中在上調(diào)基因中，這表明在它們之間，五肽調(diào)控存在一定的共性，同時(shí)與三峽肽素含量差異也呈現(xiàn)一致性；而高產(chǎn)和低產(chǎn)相較于不產(chǎn)，其差異基因均達(dá)到了27%以上，特別是低產(chǎn)和不產(chǎn)之間，差異基因顯著存在于下調(diào)基因，這表明在它們之間，五肽合成調(diào)控存在差異性。由于控制三峽肽素合成的基因簇相同，因此S7-2 與S4-2、S7-3 差異基因會(huì)趨于一致，且呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，所以在后期的比較中，重點(diǎn)關(guān)注在S4-2 對(duì)S7-2 ∩ S7-2 對(duì)S7-3 中的3312 個(gè)基因，特別是上調(diào)基因（圖3）。

圖3 在S4-2 對(duì)S7-2（A）S4-2 對(duì) S7-3（B）中的差異表達(dá)基因Fig.3 Differentially expressed genes in S4-2 vs S7-2 (A)and S4-2 vs S7-3 (B)

2.4 差異表達(dá)基因的功能注釋

對(duì)于差異表達(dá)的基因分別采用GO（Gene Ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes）分類富集分析了其可能的功能及所參與的細(xì)胞代謝過程。GO分類表明上述3312 個(gè)基因，主要參與細(xì)胞進(jìn)程、代謝過程、細(xì)胞膜、催化活性以及連接相關(guān)等生物學(xué)過程中（圖4A）。而KEGG分類表明差異集中在運(yùn)輸和分解代謝、翻譯、碳水化合物代謝以及氨基酸代謝等過程中（圖4B）。GO富集表明差異基因主要在細(xì)胞膜成分、碳水化合物代謝以及單加氧酶活性等過程中（圖4C），KEGG富集表明差異基因主要集中在抗生素合成、糖酵解和糖異生過程以及氨基酸合成等途徑（圖4D）。

圖4 差異基因表達(dá)分析Fig.4 Differential gene expression analyses

2.5 NRPS基因家族表達(dá)分析

在此之前，本課題組通過對(duì)不同草酸青霉菌株（114-2、SG-4、SJ-3、114-2 來源于山東大學(xué)微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，SG-4 和SJ-3 菌株均系三峽河岸帶植物疏花水柏枝的內(nèi)生真菌；相同培養(yǎng)條件下，114-2 不產(chǎn)三峽肽素，而SJ-3 產(chǎn)量高于SG-4）進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析[32]，篩選出7 個(gè)可能的NRPS基因簇（表5），結(jié)合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，預(yù)測(cè)三峽肽素合成基因簇為PDE_01071（Non-ribosomal peptide synthetase,NRPS基因簇）；因此，對(duì)此次轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行NR和NT注釋，注釋結(jié)果與預(yù)測(cè)基因簇PDE_01071 進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果如下表，其中Unigene5452_All包含PDE_01066 和PDE_01067 兩個(gè)基因的部分CDS序列；同時(shí)，也對(duì)上述3312 個(gè)差異基因進(jìn)行了比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其中有21 個(gè)差異基因與PDE_01071 基因簇一致，且在S7-2 中均為上調(diào)基因（表6）；而且RT-PCR結(jié)果與測(cè)序表達(dá)結(jié)果完全一致（圖5A），為了保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，也對(duì)另外6 個(gè)可能的NRPS基因簇進(jìn)行了表達(dá)驗(yàn)證（圖5B），RT-PCR結(jié)果表明6 個(gè)基因表達(dá)結(jié)果和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)不一致，因此將這6 個(gè)基因排除，該結(jié)果進(jìn)一步說明PDE_01071基因簇可能參與草酸青霉中三峽肽素的合成。

圖5 RT-PCR驗(yàn)證表達(dá)結(jié)果Fig.5 RT-PCR to verify the expression

表5 7 個(gè)可能的NRPS基因在不同培養(yǎng)條件下的表達(dá)量Table 5 Expression levels of the 7 possible NRPS genes under different culture conditions

表6 差異基因與基因簇PDE_01071 比對(duì)Table 6 Comparison of differential genes with gene cluster PDE_01071

3 結(jié)論

通過分析SG-4 菌體生長(zhǎng)規(guī)律和合成三峽肽素的時(shí)期，表明菌體的生長(zhǎng)在第6 d質(zhì)量達(dá)到最大，而三峽肽素在第4 d開始累積，第8 d達(dá)到最大值，因此三峽肽素合成特點(diǎn)符合次生代謝途徑，同時(shí)通過對(duì)草酸青霉基因組序列進(jìn)行檢索，并未找到Ser、Thr、Val的重復(fù)編碼序列，所以三峽肽素合成途徑符合NRPS途徑；由于三峽肽素含量與其控制合成的基因表達(dá)相關(guān)，所以草酸青霉SG-4 在不同培養(yǎng)條件下的含量差異與基因表達(dá)差異會(huì)趨于一致，因此本研究基于BGISEQ-500 測(cè)序平臺(tái)，分析比較了草酸青霉SG-4 在不同培養(yǎng)條件下無參轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行了分析，將可能的合成基因鎖定在3312 個(gè)差異基因中；由于此前完成了不同草酸青霉（114-2、SG-4、SJ-3）轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及分析，分析結(jié)果認(rèn)為NRPS基因簇PDE_01071 可能參與三峽肽素的合成，因此將3312 個(gè)基因同此基因簇進(jìn)行NR及NT比對(duì)，比對(duì)結(jié)果表明：3312 個(gè)差異基因中有21 個(gè)基因與基因簇PDE_01071 基因一致，而這21 個(gè)基因均為上調(diào)基因，且集中在高產(chǎn)樣本S7-2 中，這更進(jìn)一步驗(yàn)證了此前的猜想，而所有這些嘗試為明確其生物合成機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。后面的工作中，需對(duì)基因簇成員進(jìn)行針對(duì)性敲除，在明確酶活性和基因功能的基礎(chǔ)上，對(duì)其合成機(jī)理進(jìn)行解析。