鄧梓坤 肖欽佩 鄭遠(yuǎn)航 馮瑞軍 盛智梅 張寶剛

肺癌是造成我國患者死亡的主要原因之一，其中，肺腺癌（lung adenocarcinoma, LUAD）患者的數(shù)量近年來增長迅速，已經(jīng)在肺癌發(fā)病率中占據(jù)第一位[1,2]，嚴(yán)重威脅患者的身體健康。LUAD侵襲和轉(zhuǎn)移是引起患者死亡的主要原因[3,4]，大多數(shù)患者患有非小細(xì)胞肺癌（non‐small cell lung cancer, NSCLC），且為晚期。組織學(xué)上可分為LUAD和鱗狀細(xì)胞癌，LUAD是最常見的亞型，占所有NSCLC的50%以上[5]。由于LUAD患病率逐年增高，因此探究LUAD侵襲和轉(zhuǎn)移分子機(jī)制是提高LUAD患者生存質(zhì)量的關(guān)鍵。前期研究[6,7]表明，膜聯(lián)蛋白A2（annexin II, ANXA2）在多種癌癥的發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵作用，ANXA2的磷酸化程度升高被認(rèn)為促進(jìn)癌癥的轉(zhuǎn)移與侵襲。前期試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，在LUAD患者癌組織中，ANXA2的表達(dá)水平顯著升高，但其表達(dá)水平升高機(jī)制鮮有相關(guān)報(bào)道。趨化因子18（chemokine ligand 18, CCL18）是來源于TAMs分泌的一種癌癥細(xì)胞因子[7,8]，相關(guān)研究表明，ANXA2受控于CCL18與細(xì)胞表面受體Nir1相結(jié)合[9‐11]，CCL18與受體結(jié)合后通過多種途徑影響癌癥的發(fā)展，其中最為顯著的是發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移[12]。肌動(dòng)蛋白是一類形成微絲的球狀多功能蛋白質(zhì)，F(xiàn)‐肌動(dòng)蛋白（F‐actin）聚合成為G‐肌動(dòng)蛋白是細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的基礎(chǔ)，即當(dāng)癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力發(fā)生變化時(shí)，F(xiàn)‐actin聚合會(huì)隨之變化[13]并受上游AKT通路影響[14]，本研究運(yùn)用轉(zhuǎn)染技術(shù)，降低ANXA2表達(dá)后，用蛋白質(zhì)印跡檢測ANXA2蛋白表達(dá)水平。通過體外實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染ANXA2‐siRNA和ANXA2過表達(dá)載體后A549細(xì)胞侵襲能力的改變，并采用F‐actin聚合實(shí)驗(yàn)檢測F‐actin的變化，進(jìn)而探究CCL18通過何種機(jī)制影響ANXA2及癌癥的侵襲及轉(zhuǎn)移。

1 材料與方法

1.1 患者和標(biāo)本 2016年1月1日‐2019年12月31日濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科獲得的患者組織標(biāo)本。這些組織標(biāo)本由14例浸潤性LUAD及其癌旁組織的樣本組成。浸潤性LUAD與其相應(yīng)的癌旁組織之間的距離>5 cm。患者的平均年齡為47.3歲（范圍：35歲‐76歲）。

1.2 材料 LUAD細(xì)胞株A549購自美國ATCC細(xì)胞庫。細(xì)胞裂解液、胰蛋白酶、蛋白Marker，質(zhì)粒中量抽提試劑盒，反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自TaKara公司。RPMI‐1640培養(yǎng)基以及胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）購自美國Hyclone公司?？笰NXA2抗體、抗p‐ANXA2抗體、抗AKT抗體、抗p‐AKT‐Ser473抗體、抗p‐AKT‐Thr308抗體、抗cofilin抗體、抗p‐cofilin抗體、抗LIMK抗體、抗p‐LIMK抗體以及抗β‐actin抗體均購自Cell Signaling公司。Transwell小室購自BD公司。Lipofectamine 2000 Reagent購自Invitrogen公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) A549細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素和鏈霉素的RPMI‐1640培養(yǎng)基中。于5%CO2、37oC細(xì)胞孵育箱中傳代培養(yǎng)。待細(xì)胞生長處于對(duì)數(shù)期進(jìn)行鋪板，盡量鋪勻，控制好細(xì)胞數(shù)量，6 h后觀察細(xì)胞生長密度，24 h后進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 按照說明書，用慢病毒載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染。ANXA2 siRNA的序列5′‐GGTCTGAATTCAAGAGAAA‐3′和5′‐GCCAAAGAAATGAACATTC‐3′。將ANXA2‐SiRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞標(biāo)記為SiANXA2/A549，ANXA2‐SiRNA以及ANXA2過表達(dá)載體（Vector‐ANXA2）共轉(zhuǎn)染細(xì)胞標(biāo)記為SiANXA2+ANXA2/A549，將加干擾SiRNA作為空白對(duì)照組（Scr/A549）。將A549細(xì)胞計(jì)數(shù)并鋪板在6孔板內(nèi)培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞生長密度約70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并標(biāo)記組別。并將病毒懸液加入到6孔板內(nèi)，孵育48 h。用含有600 ng/mL潮霉素B的培養(yǎng)基選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。

1.5 Western blot實(shí)驗(yàn) 將全細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物在6孔板中用裂解緩沖液裂解并勻漿，并在12,000 rpm、4oC下離心15 min，使用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。在電泳轉(zhuǎn)膜后，與特異性抗體（一抗?jié)舛葹?:1,000）一起4oC過夜孵育。隨后將含有免疫復(fù)合物的纖維素膜與熒光素偶聯(lián)的二抗一起孵育（二抗?jié)舛葹?:5,000），然后通過Odyssey熒光掃描儀進(jìn)行檢測。

1.6 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 取Matrigel膠40 μL混合液加入Transwell上室，將小室放入24孔板內(nèi)，37oC放置3 h。將細(xì)胞消化離心后制備細(xì)胞（4×105個(gè)/mL）懸液。在下室加入含500 μL 10%FBS的培養(yǎng)基，上室加入無血清細(xì)胞懸液，放在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h。將小室取出，PBS清洗，用棉簽輕輕擦掉上室未穿過的細(xì)胞。將上室用4%多聚甲醛固定并晾干，然后將上室置于24孔板，用吉姆薩工作液染色，將小室置于顯微鏡下觀察并拍照，計(jì)算細(xì)胞數(shù)。

1.7 細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn) 用胰酶消化細(xì)胞，終止消化后離心棄培養(yǎng)基，用PBS洗3遍，用含1%牛血清白蛋白的無血清RPMI重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/ mL。將10 ng/mL CCL18作為化學(xué)引誘劑加入下室，上室加200 μL細(xì)胞懸液，在培養(yǎng)箱孵育24 h后，甲醛固定30 min。用0.1%吉姆薩染色20 min，用棉簽擦掉上室未遷移的細(xì)胞。用顯微鏡以×200的倍數(shù)隨機(jī)觀察3個(gè)視野。

1.8 F‐actin聚合實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞鋪在6孔板內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，將細(xì)胞放在不含血清的培養(yǎng)基中37oC、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，細(xì)胞饑餓3 h。用10 ng/mL的CCL18分別刺激15 s和30 s、1 min、2 min和3 min后固定，用預(yù)冷的PBS沖洗細(xì)胞，終止CCL18的刺激。用4%PFA固定細(xì)胞10 min。F‐buffer（10 mmol/L HEPES, 20 mmol/L KH2PO4, 5 mmol/L EGTA,2 mmol/L MgCl2, Dulbecco’s PBS, pH 6.8）沖洗3次，每次5 min。孔內(nèi)加1 mL 0.5%Tritox‐100，靜置20 min。F‐buffer沖洗3次，每次5 min?？變?nèi)加熒光鬼筆環(huán)肽，避光孵育1 h。每孔加入900 μL純甲醇，4oC孵育60 min。1,500 rpm，離心5 min，將上清液移入96孔板內(nèi)，每孔加3個(gè)復(fù)孔。使用酶標(biāo)儀讀取數(shù)值，熒光的激發(fā)波長488 nm，散發(fā)波長530 nm。不同時(shí)間的F‐肌動(dòng)蛋白相對(duì)聚合量計(jì)算公式為：刺激時(shí)間F‐actin值/未刺激F‐actin值=刺激時(shí)間熒光值。每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3遍。取平均值作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 16.0分析。計(jì)量資料之間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。多組間的比較采用單因素方差分析。所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）的形式表示。P<0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ANXA2在LUAD中的表達(dá)及其磷酸化程度與CCL18的關(guān)系 通過Western blot分析浸潤性導(dǎo)管癌組織和鄰近的非腫瘤組織的ANXA2表達(dá)水平，結(jié)果顯示，在4例具有代表性的患者樣本中，與相鄰非腫瘤組織相比，LUAD癌組織中ANXA2的蛋白表達(dá)水平明顯增高（P<0.05，圖1A）。隨后我們統(tǒng)計(jì)了ANXA2在所有患者樣本癌組織和相鄰非腫瘤組織中的蛋白表達(dá)，得到了相同的結(jié)論（P<0.05，圖1B）。將Scr/A549細(xì)胞作為對(duì)照組。通過Western blot檢測在有或沒有CCL18刺激的情況下，Scr/A549和SiNir1/A549細(xì)胞中ANXA2的蛋白和磷酸化水平，結(jié)果顯示，Nir1的表達(dá)影響CCL18誘導(dǎo)的ANXA2磷酸化。即CCL18與Nir1的結(jié)合促進(jìn)了LUAD細(xì)胞中ANXA2的磷酸化水平，但沒有促進(jìn)ANXA2的蛋白表達(dá)水平（P<0.05，圖1C）。

圖 1 ANXA2在肺腺癌細(xì)胞中過表達(dá)，其磷酸化受到CCL18的調(diào)控。A：ANXA2蛋白在配對(duì)的肺腺癌組織和鄰近正常組織中的表達(dá)情況，每對(duì)均來自同一患者；B：柱狀圖統(tǒng)計(jì)ANXA2蛋白在配對(duì)的肺腺癌組織和鄰近正常組織中的表達(dá)情況；C：通過蛋白質(zhì)印跡分析技術(shù)檢測在有或沒有10 ng/mL的CCL18刺激下，Scr/A549和SiNir1/A549細(xì)胞中ANXA2蛋白的表達(dá)水平。Fig 1 ANXA2 is overexpressed in lung adenocarcinoma cells, and its phosphorylation is regulated by CCL18. A: The expression of ANXA2 protein in paired lung adenocarcinoma tissue and adjacent normal tissue, each pair comes from the same patient; B: The expression of ANXA2 protein in paired lung adenocarcinoma tissue and adjacent normal tissue was analyzed by histogram; C: The expression level of ANXA2 protein in Scr/A549 and SiNir1/A549 cells was detected by Western blot analysis with or without CCL18 stimulation of 10 ng/mL. T: lung adenocarcinoma tissue; ANT: adjacent normal tissue.

2.2 ANXA2的降低可抑制LUAD細(xì)胞的趨化運(yùn)動(dòng)能力以及侵襲能力 使用siRNA降低A549中ANXA2蛋白的水平，我們通過Western blot分析驗(yàn)證在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞中ANXA2蛋白表達(dá)水平出現(xiàn)了下降（P<0.05，圖2A）。通過細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在降低了ANXA2蛋白表達(dá)之后，CCL18誘導(dǎo)的趨化運(yùn)動(dòng)出現(xiàn)了顯著的下降，表明ANXA2促進(jìn)了LUAD細(xì)胞中CCL18誘導(dǎo)的趨化運(yùn)動(dòng)能力（P<0.05，圖2B）。侵襲實(shí)驗(yàn)表明，無論培養(yǎng)基中是否加入CCL18，SiANXA2#2/A549組穿過人工基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量明顯少于Scr/A549組（P<0.05，圖2C），這表明ANXA2的降低抑制了CCL18誘導(dǎo)的LUAD細(xì)胞粘附、遷移和侵襲能力。

圖 2 ANXA2促進(jìn)CCL18誘導(dǎo)的肺腺癌細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)能力。A：在以Scrabble siRNA作為對(duì)照（Scr/A549）和兩組穩(wěn)定的siRNA（SiANXA2#1/A549和SiANXA2#2/A549）轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后檢測ANXA2蛋白的表達(dá)水平；B：用CCL18刺激Scr/A549和SiANXA2#2/A549細(xì)胞，進(jìn)行趨化反應(yīng)的比較。β-actin作為陰性對(duì)照。每獨(dú)立實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次, P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；C：在加入或不加入10 ng/mL CCL18刺激的情況下，分析Scr/A549和SiANXA2#2/A549細(xì)胞的侵襲能力，P<0.05。以×400放大倍數(shù)捕獲圖像，比例尺：20 μm。Fig 2 ANXA2 promotes the chemotaxis of lung adenocarcinoma cells induced by CCL18. A: Two stable siRNAs (SiANXA2#1 and SiANXA2#2) were transfected into A549 cells respectively, scramble siRNA as a control (Scr) . The ANXA2 protein expression level was detected by Western blot analysis. β-actin was used as a negative control; B: Comparison of chemotactic response with rCCL18 stimulation in Scr/A549 and SiANXA2#2/A549 cells.Each independent experiment was repeated at least three times, P<0.05, the difference was statistically significant; C: Analyze the invasion ability of Scr/A549 and SiANXA2#2/A549 cells with or without rCCL18 stimulation of 10 ng/mL, P<0.05. Capture images at ×400 magnification. Scale bar: 20 μm.

2.3 ANXA2的降低可通過AKT/cofilin信號(hào)通路抑制LUAD中CCL18誘導(dǎo)的F‐actin聚合 為了證明ANXA2的下調(diào)可以通過抑制F‐actin聚合來抑制CCL18誘導(dǎo)的LUAD細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)能力這一假設(shè)。F‐actin聚合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CCL18在Scr/A549細(xì)胞中在15 s、30 s、1 min、2 min和3 min時(shí)引起瞬時(shí)肌動(dòng)蛋白聚合，在SiANXA2#2/A549細(xì)胞中，肌動(dòng)蛋白的聚合反應(yīng)顯著降低（P<0.05，圖3A），即ANXA2通過調(diào)節(jié)CCL18誘導(dǎo)的F‐actin聚合進(jìn)而調(diào)節(jié)LUAD運(yùn)動(dòng)和侵襲。用10 ng/mL CCL18刺激細(xì)胞3 min后，通過Western blot分析實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)錄因子的核表達(dá)，以驗(yàn)證參與F‐actin的下游分子，這些分子在細(xì)胞中受ANXA2的調(diào)控。與Scr/A549細(xì)胞相比，SiANXA2#2/A549細(xì)胞中Ser473和Thr308位點(diǎn)的AKT的磷酸化水平均降低（P<0.05，圖3B）。Western blot結(jié)果表明，與Scr/A549組相比，SiANXA2#2/A549細(xì)胞中cofilin及LIMK磷酸化水平降低（P<0.05，圖3C）。這些結(jié)果表明，AKT/cofilin信號(hào)通路對(duì)于ANXA2促進(jìn)LUAD細(xì)胞中CCL18誘導(dǎo)的趨化運(yùn)動(dòng)及侵襲能力至關(guān)重要。

圖 3 ANXA2的降低通過AKT/cofilin通路抑制肺腺癌細(xì)胞中CCL18誘導(dǎo)的F-肌動(dòng)蛋白聚合。A：在不同時(shí)長的10 ng/mL CCL18的刺激下Scr/A549以及和SiANXA2#2/A549細(xì)胞中相對(duì)F-actin含量；B：在CCL18刺激下，分析Scr/A549、SiANXA2#2/A549中p-AKT（Ser473）、p-AKT（Thr308）的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)中使用AKT和β-actin用作陰性對(duì)照；C：分析在CCL18的刺激下，Scr/A549、SiANXA2#2/A549中cofilin、LIMK的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)中使用cofilin、LIMK和β-actin用作陰性對(duì)照。Fig 3 The reduction of ANXA2 inhibits CCL18-induced F-actin polymerization in lung adenocarcinoma cells through the AKT/cofilin pathway. A: Relative F-actin content in Scr/A549 and SiANXA2#2/A549 cells stimulated by 10 ng/mL CCL18 at different times; B: Under the stimulation of CCL18, the expression levels of p-AKT (Ser473) and p-AKT (Thr308) in Scr/A549 and SiANXA2#2/A549 were analyzed by Western blot analysis. AKT and β-actin were used as negative contrast in the experiment; C: Analyze the expression levels of cofilin and LIMK in Scr/A549, SiANXA2#2/A549 under the stimulation of CCL18 by Western blot analysis. In the experiment, cofilin, LIMK and β-actin were used as negative controls.

2.4 過表達(dá)ANXA2可促進(jìn)LUAD細(xì)胞侵襲能力和LUAD中CCL18誘導(dǎo)的F‐actin聚合 為了證明ANXA2對(duì)LUAD細(xì)胞功能的影響，我們進(jìn)行了挽救實(shí)驗(yàn)，使用SiRNA降低A549中ANXA2蛋白的水平，過表達(dá)ANXA2載體（Vector‐ANXA2）恢復(fù)ANXA2蛋白的水平，我們通過Western blot分析驗(yàn)證，結(jié)果表明A549細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染（圖4A）。侵襲實(shí)驗(yàn)表明，無論培養(yǎng)基中是否加入CCL18，SiANXA2#2+ANXA2/A549組穿過人工基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量明顯多于SiANXA2#2/A549組（P<0.05，圖4B）。F‐actin聚合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與SiANXA2#2/A549組相比，過表達(dá)ANXA2后，肌動(dòng)蛋白的聚合反應(yīng)顯著升高（P<0.05，圖4C）。這些結(jié)果表明，ANXA2過表達(dá)可促進(jìn)LUAD細(xì)胞侵襲能力和LUAD中CCL18誘導(dǎo)的F‐actin聚合。

3 討論

盡管在肺癌篩查及外科醫(yī)學(xué)、放射腫瘤學(xué)治療方面的不斷進(jìn)步的前提下，LUAD仍然是中國乃至世界范圍內(nèi)最常見的癌癥死亡原因[15]。而侵襲和轉(zhuǎn)移是造成絕大多數(shù)患者死亡的重要原因[16]。所以探究LUAD侵襲和轉(zhuǎn)移分子機(jī)制是提高LUAD患者生存質(zhì)量的關(guān)鍵[17]。研究表明，ANXA2可以促進(jìn)人類結(jié)直腸癌[18]、胃癌[19]和乳腺癌[20]等的侵襲和轉(zhuǎn)移，在LUAD的侵襲轉(zhuǎn)移中，同樣也有促進(jìn)血管生成和癌組織增殖等作用[21]。但在其如何受到CCL18調(diào)控，以及通過何種方式影響癌癥轉(zhuǎn)移及侵襲鮮有研究。

本研究中，我們使用了蛋白質(zhì)印跡分析的方法對(duì)14例患者的LUAD組織進(jìn)行了分析，我們從中精選了4例具有代表性的患者組織做了Western blot，結(jié)果顯示，相對(duì)于相鄰周圍組織，癌組織中ANXA2的表達(dá)量升高。并隨后做了柱狀圖統(tǒng)計(jì)ANXA2在14例患者組織中的表達(dá)，得到的結(jié)果再次證明了上述結(jié)論。相關(guān)研究[22]顯示，其水平升高與LUAD的轉(zhuǎn)移侵襲相關(guān)。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)入SiNir1的A549細(xì)胞中，與對(duì)照組Scr/A549細(xì)胞相比，ANXA2的磷酸化水平發(fā)生了下降，而當(dāng)沒有CCL18的刺激時(shí)，ANXA2磷酸化明顯降低，即ANXA2在細(xì)胞內(nèi)的磷酸化受到CCL18的調(diào)控，這在過往其他癌相關(guān)文獻(xiàn)[23]中也有提及。同時(shí)， Scr/A549和SiANXA2#2/A549的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)表明抑制ANXA2后A549細(xì)胞侵襲能力明顯下降，而在恢復(fù)ANXA2的表達(dá)后，A549細(xì)胞的侵襲能力較SiANXA2#2組明顯上升。在對(duì)其進(jìn)行F‐actin聚合實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果，F(xiàn)‐actin聚合反應(yīng)參與了對(duì)癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響。隨后我們采用Western blot分析的實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)F‐actin聚合相關(guān)的上游AKT/cofilin通路進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示SiANXA2#2/A549相對(duì)于對(duì)照組，p‐AKT（Ser473）、p‐AKT（Thr308）、cofilin和LIMK的磷酸化都發(fā)生了降低。

綜上所述，ANXA2通過AKT/cofilin信號(hào)通路促進(jìn)CCL18誘導(dǎo)的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，促使LUAD發(fā)生轉(zhuǎn)移及侵襲，為CCL18成為臨床篩查LUAD及靶向治療的分子標(biāo)志物奠定理論基礎(chǔ)，提高LUAD患者的遠(yuǎn)期生存率。雖然我們做了CCL18對(duì)ANXA2相關(guān)影響的研究，但是其對(duì)LUAD發(fā)生和進(jìn)展的蛋白機(jī)制并未完全闡明，還需進(jìn)一步研究。

Author contributions

Deng ZK and Zhang BG conceived and designed the study.Deng ZK, Xiao QP, Zheng YH and Feng RJ performed the experiments. Deng ZK and Sheng ZM analyzed the data. All the authors had access to the data. All authors read and approved the final manuscript as submitted.