王 道，梁波羅

(中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院婦產(chǎn)科，中國(guó) 長(zhǎng)沙 410011)

HTRA(High Temperature Requirement Factor A) 是一種熱休克誘導(dǎo)的、與包膜相關(guān)的絲氨酸蛋白酶，其具有結(jié)合分子伴侶和蛋白酶的雙重活性，能夠識(shí)別和降解細(xì)胞質(zhì)中錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)。HTRA家族由HTRA1，HTRA2，HTRA3和HTRA4組成[1]，共同特點(diǎn)是每個(gè)單體包括兩個(gè)或者3個(gè)主要結(jié)構(gòu)域[2,3]：一個(gè)Kazal樣結(jié)構(gòu)域、一個(gè)C末端的PDZ域和一個(gè)N端IGFBP樣結(jié)構(gòu)域。在人體中，這4種HTRA同源物都參與細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、神經(jīng)變性、細(xì)胞自噬以及惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等過(guò)程[4-7]。

HTRA1是一種非糖基化的絲氨酸蛋白酶，能夠降解多種底物[8]，其中包括細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(Extracellular matrix, ECM)。但是, 目前研究人員對(duì)人HTRA1蛋白的功能尚不清楚。研究表明[9]，HTRA1能夠與多種TGF-β家族蛋白結(jié)合，阻止受體激活來(lái)抑制細(xì)胞中BMP4，BMP2和TGF-β1等信號(hào)分子的傳導(dǎo)；還有報(bào)道[10]稱其可通過(guò)TGF-β1/SMAD信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞分化；Globus等[11]還提出HTRA1可能是WNT/β-catenin信號(hào)通路的新成員。

HTRA1廣泛分布在人體正常組織中，涉及許多與人類機(jī)體密切相關(guān)的疾病，如阿爾茲海默癥[12]、腦血管疾病[13]、年齡相關(guān)的黃斑變性[14]、癌癥[15]和骨關(guān)節(jié)炎[16]。在骨關(guān)節(jié)炎中，盡管人HTRA1在軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞中表達(dá)[17]，但其是成骨細(xì)胞的正調(diào)控劑還是負(fù)調(diào)節(jié)劑存在爭(zhēng)議[18]。越來(lái)越多的證據(jù)也表明，人HtrA1基因在多種腫瘤疾病中起著抑癌的作用[19]，包括乳腺癌、胃癌和肝細(xì)胞癌。此外，還有研究認(rèn)為HtrA1在卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌進(jìn)展和侵襲過(guò)程中被下調(diào)[20]。研究人員還證實(shí)，隨著年齡增長(zhǎng)，HtrA1基因的啟動(dòng)子變異可能導(dǎo)致老年黃斑變性[21]，這些都暗示我們有必要對(duì)人HtrA1基因進(jìn)行研究。

本研究對(duì)人HtrA1基因的編碼蛋白序列進(jìn)行同源性分析，對(duì)其理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特征和亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)，并推導(dǎo)出與人HTRA1蛋白發(fā)生相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖，然后通過(guò)GO (Gene Ontology) 基因本體注釋人HtrA1在機(jī)體中的重要生物學(xué)功能，最后比較其在不同腫瘤中的表達(dá)差異。

1 材料與方法

1.1 材料

人HtrA1基因的核酸序列信息從NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站獲取(Accession number: NM-002775.5)，氨基酸序列信息均來(lái)自Uniprot (http://www.uniprot.org)網(wǎng)站：智人(Q92743)、斑馬魚(yú)(Q6GMI0)、小家鼠(Q9R188)、牛(F1N152)、褐家鼠(Q9QZK5)、非洲爪蟾(A6YFB5)、家犬(F1PU95)、家貓(M3W0Q9)、黑猩猩(H2Q2P9)、獼猴(H9FX91)、雞(A0A1D5PSR5)。

1.2 方法

1.2.1HtrA1編碼蛋白的同源性分析和進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建 從Uniprot網(wǎng)址選擇11種具有代表性的物種，利用Clustal Omega及MEGA 10.0等軟件對(duì)不同物種的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析和進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建。

1.2.2HtrA1的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和分析 運(yùn)用多種數(shù)據(jù)庫(kù)及在線網(wǎng)站分析人HTRA1的理化性質(zhì)、信號(hào)肽、亞細(xì)胞定位、二/三級(jí)蛋白結(jié)構(gòu)、蛋白互作網(wǎng)絡(luò)、GO注釋功能和不同腫瘤中的表達(dá)量差異(如表1所示)。

表1 運(yùn)用的數(shù)據(jù)庫(kù)和軟件信息

2 結(jié)果與分析

2.1 人HtrA1基因編碼蛋白的同源性預(yù)測(cè)分析

通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)獲取不同物種HTRA1蛋白序列，利用Clustal軟件進(jìn)行同源比對(duì)分析(圖1A)。結(jié)果顯示，人(Homosapiens)與黑猩猩(Macacamulatta)、獼猴(Pantroglodytes)、斑馬魚(yú)(Daniorerio)、家貓(Feliscatus)、家犬(Canislupus)、牛(Bostaurus)、雞(Gallusgallus)、小家鼠(Musmusculus)、褐家鼠(Rattusnorvegicus)以及非洲爪蟾(Xenopuslaevis)的HTRA1蛋白序列的同源性分別是91.762%，99.168%，70.515%，95.868%，68.958%，93.84%，78.719%，92.292%，91.875%及64.108%。另外，進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示，HTRA1在哺乳動(dòng)物中的親緣關(guān)系較近，具有高度的保守性。人與黑猩猩、獼猴的親緣性最近，而與雞、非洲爪蟾以及斑馬魚(yú)的距離較遠(yuǎn)?？傊?1個(gè)物種之間的同源性高達(dá)77.84%，推測(cè)人HtrA1是一個(gè)高度保守的基因。

2.2 人HTRA1蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測(cè)分析

使用ProtParam預(yù)測(cè)分析了人HTRA1蛋白的理化性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)該蛋白由480個(gè)氨基酸組成，其中丙氨酸46個(gè)占9.6%，精氨酸31個(gè)占6.5%，包括58個(gè)帶正電荷的氨基酸殘基(Arg+Lys)和55個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸殘基(Asp+Glu)；分子式為C2232H3668N652O684S22；相對(duì)分子質(zhì)量為51 286.95；等電點(diǎn)為8.09；280 nm波長(zhǎng)處消光系數(shù)為11 430；吸光度為0.223；半衰期為30 h；穩(wěn)定系數(shù)為43.30；疏水值為94.69，平均親水性為-0.121。

2.3 人HTRA1蛋白的親/疏水性預(yù)測(cè)分析

利用ProtScale數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)HTRA1蛋白親水性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，HTRA1蛋白存在9個(gè)高分值峰區(qū) (Score值>1.5)，分別位于氨基酸的第9～18位、第91位、第93～94位、第109位、第111位、第205位、第218位、第282～283位以及第351位氨基酸，其中第12位氨基酸的亮氨酸分值最高(Score值=3.200)；HtrA1蛋白存在8個(gè)低分值 (Score值<-2) 的峰區(qū)，這些峰區(qū)分別位于第53位、第137位、第140～142位、第160位、第163～166位、第302位、第369～372位、第397～403位，其中第400位的天冬氨酸 (Score值=-2.967)分值最低。分析可知，人HtrA1蛋白存在大量疏水區(qū)，是一種疏水性蛋白(圖2)。

圖2 人HTRA1親/疏水性分析預(yù)測(cè)

2.4 人HTRA1蛋白信號(hào)肽及亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析

提交人HTRA1氨基酸序列到SignalP 4.1進(jìn)行在線預(yù)測(cè)分析，設(shè)置Cut-off值為0.450。分析結(jié)果顯示(圖3)，C，Y及S 最大值位點(diǎn)為23，23及15，C，Y及S的最大值分別為0.883，0.917及0.982，S-mean (1-22)和D (1-22)值分別為0.952和0.936，得分都大于0.450，提示在第22和23位氨基酸之間存在酶切位點(diǎn)，推測(cè)人HTRA1蛋白存在信號(hào)肽。

圖3 人HTRA1信號(hào)肽分析預(yù)測(cè)

通過(guò)Genecards分析人HTRA1蛋白的亞細(xì)胞定位，預(yù)測(cè)分析顯示，人HTRA1蛋白主要分布在質(zhì)膜外，其次是質(zhì)膜和胞液，如圖4所示。人HTRA1蛋白可能起始在核糖體先合成，露出N-端信號(hào)肽序列后停止翻譯，并在信號(hào)識(shí)別顆粒等因子協(xié)助下?？吭趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)繼續(xù)翻譯，通過(guò)膜泡運(yùn)到胞外，作為分泌性蛋白發(fā)揮生物學(xué)功能。

圖4 人HTRA1亞細(xì)胞定位的分析預(yù)測(cè)

2.5 人HTRA1蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

使用PSIPRED在線分析網(wǎng)站，對(duì)人HTRA1的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，人HTRA1蛋白共有61個(gè)α-螺旋，有112個(gè)β-折疊。α-螺旋占12.70% (61/480)，β-折疊占23.33% (112/480)，其余為無(wú)規(guī)則卷曲，人HTRA1蛋白中超過(guò)半數(shù)的氨基酸處于無(wú)序狀態(tài)(圖5)。

圖5 人HTRA1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析預(yù)測(cè)

2.6 人HTRA1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

Swiss-Model對(duì)人HTRA1三級(jí)蛋白結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行同源建模預(yù)測(cè)，分別得到4種預(yù)測(cè)模型。與其相應(yīng)模板的主要重疊區(qū)分別在第162～478位氨基酸、第170～479位氨基酸、第36～154位氨基酸、第36～157位氨基酸。對(duì)比分析4種模型峰圖可知，模型A的峰圖波形最穩(wěn)定，說(shuō)明模型A更穩(wěn)定可靠(圖6A和B)。

運(yùn)用拉曼光譜圖進(jìn)一步證實(shí)HTRA1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型的可靠性。模型A的結(jié)果顯示，90.0%的氨基酸殘基位于紅色區(qū)域內(nèi)，黃色區(qū)域內(nèi)存在9.1%的氨基酸殘基，只有第223位蘇氨酸殘基與第431位天冬酰胺殘基位于其他區(qū)域，說(shuō)明模型A中95.79%的氨基酸具有合理的二面角，提示模型A最可靠(圖6C)。

圖6 人HTRA1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的分析預(yù)測(cè)(A.三級(jí)結(jié)構(gòu)模型;B.波峰相似同源蛋白;C.拉曼光譜圖)

2.7 與人HTRA1蛋白有相互作用的蛋白預(yù)測(cè)分析

String 11.0 在線預(yù)測(cè)與人HTRA1有相互作用的蛋白，結(jié)果給出了得分前10的蛋白質(zhì)以及相互作用網(wǎng)絡(luò)(圖7)和詳細(xì)得分信息(表2)。其中，ACAN蛋白參與構(gòu)建細(xì)胞外基質(zhì)，YME1L1，CLPX，CLPP及HSPD1等蛋白在生物機(jī)體的過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)功能。

圖7 人HTRA1蛋白相互作用預(yù)測(cè)

表2 人HtrA1蛋白相互作用預(yù)測(cè)信息

2.8 人HTRA1蛋白功能GO注釋分析

Gene Ontology Consortium 數(shù)據(jù)庫(kù)從細(xì)胞組成(cellular component, cc)、分子功能(molecular function, mf) 和生物學(xué)過(guò)程(biological process, bp)對(duì)人HTRA1蛋白進(jìn)行分析。細(xì)胞組分結(jié)果說(shuō)明，人HTRA1蛋白主要定位在線粒體基質(zhì)和內(nèi)膜，另外在線粒體外也有大量分布，與人HTRA1的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)相吻合；分子功能結(jié)果顯示，人HTRA1蛋白具有ATP酶活性、水解酶活性、結(jié)合活性與蛋白形成二聚體；還參與了蛋白水解、蛋白代謝和大分子分解代謝等重要的生物學(xué)過(guò)程(表3)。

表3 人HTRA1蛋白GO注釋分析

2.9 人HtrA1基因在不同腫瘤中的表達(dá)量分析

cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)收集了來(lái)自腫瘤基因組圖譜(TCGA) 30多種癌癥類型的信息，筆者對(duì)人HtrA1基因進(jìn)行表達(dá)量分析。結(jié)果表明，除在急性髓系白血病中的表達(dá)量較低之外，該基因在肉瘤、間皮瘤、腦級(jí)別膠質(zhì)瘤表達(dá)量最高，其次是乳腺浸潤(rùn)癌、多形成性膠質(zhì)細(xì)胞瘤、肝細(xì)胞癌以及卵巢癌等，表達(dá)量默認(rèn)值x取以2為底的對(duì)數(shù)(log2x)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析(圖8)。

圖8 人HtrA1基因RNA表達(dá)量分析

3 討論

關(guān)于人HtrA1基因，學(xué)者研究都集中在炎癥或者腫瘤發(fā)生和進(jìn)展中的作用，例如人HtrA1在骨關(guān)節(jié)炎患者的軟骨中濃度顯著升高[22]；HTRA1蛋白的表達(dá)發(fā)生變化，在一些侵襲力強(qiáng)的惡性腫瘤中，如黑素瘤、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌等，尤其在轉(zhuǎn)移性癌癥中，HtrA1基因的表達(dá)下調(diào)[23-25]。一些研究證實(shí)[26,27]，HtrA1表達(dá)下調(diào)可減少癌細(xì)胞的遷移和抑制生長(zhǎng)。所以，HtrA1在癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲以及分化過(guò)程起關(guān)鍵作用[28,29]。但是，關(guān)于人HtrA1基因編碼的蛋白從基本理化性質(zhì)到相互作用網(wǎng)絡(luò)和GO功能注釋的報(bào)道很少，本研究有利于提高我們對(duì)HTRA1蛋白結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)的認(rèn)識(shí)，闡明其在人類機(jī)體發(fā)揮的重要作用。特別是在不同腫瘤組織樣本之間發(fā)現(xiàn)人HtrA1存在差異表達(dá)，筆者推測(cè)可能與腫瘤類型、組織學(xué)分級(jí)、轉(zhuǎn)移和細(xì)胞分化程度等因素有關(guān)，提示該標(biāo)記物或許能夠用于鑒定腫瘤起源組織、評(píng)估復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后藥物治療的效果。

本研究的序列比對(duì)結(jié)果表明，不同物種之間HTRA1蛋白序列的相似度較高。人HTRA1屬于一個(gè)高度保守性蛋白，早期研究證實(shí)從細(xì)菌到人該蛋白序列具有高度保守性，都含有絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)或PDZ結(jié)構(gòu)域[30]。筆者推測(cè)，HTRA1蛋白酶是一個(gè)嚴(yán)格調(diào)節(jié)蛋白水解的復(fù)合體，核心調(diào)控元件具有高度相似性，調(diào)控開(kāi)關(guān)的結(jié)構(gòu)可能是臨床干預(yù)疾病的基礎(chǔ)。此外，人HTRA1還含有信號(hào)肽，屬于一種分泌性蛋白。An等[31]研究表明，HTRA1分泌到細(xì)胞外能夠消化包括簇蛋白在內(nèi)的幾種細(xì)胞外蛋白質(zhì)，其在體外還能夠裂解為幾種蛋白如核心蛋白聚糖、肌動(dòng)蛋白、波形蛋白等[32], 提示臨床上可能存在通過(guò)合適的效應(yīng)分子調(diào)節(jié)蛋白酶活性的有效途徑。筆者預(yù)測(cè)的蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)表明模型A具有最合理的二面角，也是蛋白酶激活機(jī)制的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。本文推測(cè)人HTRA1是一種內(nèi)外功能穩(wěn)定的分子調(diào)控劑，與之前Cabrera等[33]提出人HTRA1的三聚體結(jié)構(gòu)對(duì)維持變構(gòu)激活非常關(guān)鍵的推論相一致，對(duì)于理解其結(jié)構(gòu)生物學(xué)和致病機(jī)理中的相關(guān)性尤為重要。

蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)一步解釋了人HTRA1蛋白參與骨關(guān)節(jié)炎、腫瘤等疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程的機(jī)制。結(jié)果顯示，ACAN，ARMS2，CLPP及CTRC等與人HTRA1蛋白發(fā)生相互作用，而ACAN與HTRA1蛋白關(guān)系最強(qiáng)。Rakic等研究[34]認(rèn)為在軟骨中HtrA1能夠抑制TGF-β家族信號(hào)，介導(dǎo)BMP-2再分化，從而增加軟骨細(xì)胞中ACAN和COL1A1等的表達(dá)；Huang等[35]在中國(guó)不同人群中證實(shí)CFH，ARMS2和HTRA1相互作用，涉及到新生血管性黃斑變性疾病的形成，與圖7所示蛋白網(wǎng)絡(luò)圖結(jié)果相符。Poulse等[36]證實(shí)HTRA1有效切割轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β-誘導(dǎo)蛋白(TGFBIP)，與GO功能分析認(rèn)為人HTRA1發(fā)揮內(nèi)肽水解酶作用是一致的；Muoz等[37]還揭示其可以調(diào)節(jié)載脂蛋白E(ApoE)的生物活性，參與蛋白水解等相關(guān)代謝過(guò)程?？傊?，HTRA1蛋白可以通過(guò)與多種蛋白相互作用，發(fā)揮其關(guān)鍵的生物學(xué)功能。

綜上所述，本文通過(guò)多種生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，將有助于后續(xù)研究人HtrA1基因在復(fù)雜疾病中的調(diào)控機(jī)制，但是預(yù)測(cè)結(jié)果還需要在臨床研究中得到更多的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。