■王 平 王 濤 胡驍飛 王全亮 彭 峰 楊小進 尹清強*

（1.河南農業(yè)大學動物科技學院，河南鄭州 450046；2.河南省農業(yè)科學院動物免疫學重點實驗室，河南鄭州 450002；3.河南廣安生物科技股份有限公司，河南鄭州 450001；4.河南省正陽種豬場，河南駐馬店 463600；5.洛陽歐科拜克生物技術股份有限公司，河南洛陽 471600）

黃曲霉毒素是由某些曲霉真菌產生的次級代謝產物，具有極強的毒性、誘變性和強致癌性，是世界公認的危害最大的霉菌毒素，其中黃曲霉毒素B1(AFB1)的毒性最強[1]。玉米赤霉烯酮(ZEA)是一種由鐮刀菌次級代謝產生的雌激素類霉菌毒素，對動物和人類都會產生危害，能導致人或動物的生殖系統紊亂[2]。AFB1 和ZEA 污染問題關系到飼料安全、動物生產和食品安全，甚至還威脅到人類自身健康[3]。霉菌毒素對人類健康的危害主要是動物采食了飼料中霉菌毒素后在體內組織器官中殘留，人們長期食用含霉菌毒素超標的畜產品后會引起中毒，甚至致癌。因此，不僅要解決飼料霉菌毒素污染問題同時還要減少霉菌毒素在動物體內和畜產品中的殘留問題。

飼料中霉菌毒素脫毒方式有物理法、化學法以及生物法。目前關于霉菌毒素脫毒劑的研究主要集中于脫毒劑緩解毒素對動物生產性能和繁殖性能的影響，但是毒素還是會在動物組織中沉積，尤其是肝臟[4-6]，這些沉積的毒素是否能夠完全消解和排出還有待研究。關于毒素在動物的體內消解及排出規(guī)律的研究較少。

本文通過測定不同時間內AFB1 和ZEA 在肉雞不同組織器官內含量變化，以觀察兩種毒素在體內的代謝情況及消減規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料

生物解毒劑：枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌、產朊假絲酵母在的飼糧中含量分別為：1×107、1×106、1×107CFU/g。

霉變玉米：市購，經測定AFB1 含量為69 μg/kg，ZEA含量為60 μg/kg。

霉菌毒素的制備：取活化過的黃曲霉孢子，涂布于PDA 固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至孢子大量產生時收獲(約120 h)。在平板內加入適量高壓滅菌的生理鹽水(含0.05%的Tween 80)，用高壓過的涂布棒將平板上的孢子緩慢刮下，形成孢子濃度約為1×108CFU/mL 的黃曲霉孢子懸液。取粉碎后的玉米80 g(過8 目篩)，裝入250 ml 錐形瓶內，加水40 mL 攪拌均勻后，加棉塞高壓蒸汽滅菌20 min。待冷卻后接種上述配制成的黃曲霉孢子懸液2 mL，用高壓滅菌玻璃棒攪拌均勻后置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱內，約7 d后收獲。放置室溫晾干，約5～6 d 后粉碎過20 目篩，避光保存。測定AFB1 的含量為2 547 μg/kg，ZEA 含量為5 μg/kg。ZEA純品：購于Sigma公司。

1.2 試驗動物及設計

選擇22 日齡健康且體重無差異的羅斯308 肉雞150只，分為3個處理組，每個處理組5個重復，每個重復10只，飼養(yǎng)期20 d。在第21 d，2和3組換成基礎日糧飼喂7 d。試驗設計與分組如下：

1 組：飼喂基礎日糧（基礎日糧中含AFB1 14.45 μg/kg、ZEA 58.58 μg/kg）；

2組：基礎日糧+50 μg/kg AFBl+500 μg/kg ZEA；

3 組：基礎日糧+50 μg/kg AFBl+500 μg/kg ZEA+生物解毒劑。

基礎日糧配方按照美國營養(yǎng)研究委員會NRC(1994)肉仔雞飼養(yǎng)標準配制。日糧配方及營養(yǎng)水平見表1。用霉變玉米、制備的霉菌毒素和ZEA 純品調整每組毒素含量。

表1 肉雞后期日糧的組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

1.3 血清、肝臟、胸肌、糞便中AFB1和ZEA含量測定及消減規(guī)律

在42 d屠宰，每組取3只肉雞的肝臟、胸肌、血清及糞便。隨后換成基礎日糧飼喂7 d。以42 d樣品作為兩種毒素在肉雞體內代謝0 h的含量。在飼喂基礎日糧1、3、5 d及7 d 時分別從1、2、3組中屠宰3只雞，取血清、肝臟、胸肌以及糞便。按照德國拜發(fā)公司AFB1和ZEA試劑盒步驟進行毒素含量測定。

1.4 糞便中AFB1和ZEA凈排出總量測定

每組取3只雞，采用全收糞法分別收集飼喂基礎日糧1、3、5 d及7 d時的排泄物。60～65 ℃烘干，自然狀態(tài)下充分回潮24 h，稱重記錄每天總糞重，粉碎后過40 目篩備用。按照德國拜發(fā)公司AFB1 和ZEA 試劑盒步驟進行毒素含量測定。

AFB1（ZEA）凈排出總量（μg）=每克糞便中毒素含量（μg/g）×每天總糞重（g）

1.5 數據統計與分析

試驗數據經Excel初步整理后，采用Design-Expert 8.0.6軟件對響應面數據進行分析。采用SPSS 17.0 統計分析軟件對各組數據進行方差分析和Duncan’s法多重比較，差異顯著用P<0.05 表示，所有結果均以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 AFB1和ZEA在肉雞體內的消解規(guī)律(見表2、表3)

表2 不同時間AFB1在肉雞體內代謝的情況(μg/kg)

表3 不同時間ZEA在肉雞體內代謝的情況(μg/kg)

由表2可知，組織中AFB1含量為：肝臟>胸肌>血清。在0 d時，2組和3組肝臟、胸肌和糞便中AFB1含量差異不顯著(P>0.05)，但顯著高于基礎日糧組(P<0.05)。在7 d 時，2 組胸肌、血清和糞便中AFB1 含量顯著高于3 組和基礎日糧組(P<0.05)。在排毒第7 d時肝臟、胸肌、血清和糞便中AFB1 含量顯著低于第0 d 時(P<0.05)。在第7 d 時，基礎日糧組和3 組血清中未檢出AFB1 含量。在第3 d 時，2 組和3 組糞便中AFB1 含量顯著高于其他時間(P<0.05)。在0～7 d 內，2 組和3 組肝臟中AFB1 含量差異不顯著(P>0.05)，并顯著高于基礎日糧組(P<0.05)。

由表3 可知，ZEA 主要存在于糞便，其次肝臟和血清。在0～7 d時，肝臟、血清和糞便中ZEA含量為：2組>3組>1組(P<0.05)。各組胸肌中ZEA殘留量未檢出。1組血清中ZEA在0、1、7 d檢不出。2組和3組血清中ZEA 含量皆以第7 d 最低(P<0.05)。1 組糞便中ZEA含量在7 d內無顯著變化(P>0.05)。2組和3組糞便中ZEA含量在第3 d時最高(P<0.05)。

2.2 AFB1和ZEA在肉雞體內的排出規(guī)律(見表4、表5)

表4 不同時間AFB1的凈排出的總量(μg)

表5 不同時間ZEA的凈排出的總量(μg)

由表4可知，在消解試驗階段的1、3、5 d以及7 d內，2組和3組的毒素凈排出量始終顯著高于1組(P<0.05)，其中3組排出量從第5 d起顯著低于2組(P<0.05)。在第3 d時，2組和3組AFB1凈排出總量最高(P<0.05)。

由表5可知，在消解試驗階段的1、3、5 d以及7 d內，每組ZEA排出量為：2組>3組>1組(P<0.05)。在第3 d時3個組的ZEA凈排出總量最高(P<0.05)。

3 討論

AFB1在畜禽的肝臟、血液、肌肉及動物產品中有檢測到毒素的殘留，甚至能夠通過食物對人類的健康產生威脅[7-8]。動物攝入含AFB1的飼料后，十二指腸可以吸收50%，之后主要在肝臟蓄積和代謝[9]。ZEA同樣由胃腸道吸收后進入肝腸循環(huán)，從而滯留時間延長，在家禽體內肝臟殘留最多[10-11]。本試驗結果顯示AFB1主要存在于肝臟、肌肉和血清，通過糞便排出體外。ZEA不在肌肉中沉積，若飼糧中含有大量的ZEA，ZEA則存在于肝臟和血清，若飼糧中ZEA含量較少，ZEA則主要存在于肝臟，大量ZEA通過糞便排出體外。添加生物脫毒劑能夠減少體內毒素的沉積，但不能消除毒素沉積。宋文靜等[12]研究發(fā)現動物攝食低劑量AFB1后，肝臟和肌肉中都有殘留，其中肝臟殘留量較肌肉中多，而添加的復合益生菌均可有效降低組織中的毒素殘留，與本試驗結果一致。崔曉旭[13]在肉雞飼喂含AFB1 5 mg/kg的飼料28 d后，飼喂正常飼糧，發(fā)現肝臟和肌肉中毒素殘留的消除時間至少在11～18 d達到定量限。而本試驗在飼喂含AFB1 50 μg/kg日糧20 d后飼喂基礎日糧7 d后發(fā)現基礎日糧組和添加生物脫毒劑組血清中的毒素完全消除，而肝臟、肌肉和糞便中仍有毒素存在，雖然隨著時間延長，毒素含量降低，但并不能完全消除。王定發(fā)[5]發(fā)現在青年母豬日糧中添加2 mg/kg ZEA飼喂21 d后母豬肌肉中ZEA殘留量為0.031 μg/kg。而本試驗在飼喂含ZEA 500 μg/kg日糧20 d后肉雞肌肉中ZEA無檢出，與前人研究結果不一致，這可能與日糧中毒素含量和畜種有關。目前還未見有關于ZEA在體內消解的報道。本試驗在飼喂含ZEA 500 μg/kg日糧20 d后飼喂基礎日糧7 d后發(fā)現基礎日糧組血清中ZEA完全消除，而肝臟和糞便中仍有毒素存在。同時還發(fā)現大量的AFB1和ZEA通過糞便排出體外，污染環(huán)境。添加霉菌毒素生物降解劑減少了糞便中毒素含量和毒素凈排出量，這說明霉菌毒素生物降解劑是通過體內分解毒素來降低毒素的排出，從而減少環(huán)境污染。

本試驗通過測定血清、糞便、胸肌、肝臟中兩種霉菌毒素含量的含量發(fā)現，當飼料中霉菌毒素含量較高時，在組織和器官中的殘留量也會提高，但霉菌毒素生物解毒劑的添加可以減少霉菌毒素的殘留量和排放量，歸因于益生菌對霉菌毒素的降解。另外，隨著排毒時間的延長，霉菌毒素的殘留量和排放量逐漸降低，但一周時間不足以排出長期蓄積的霉菌毒素。如何能夠消除體內沉積的毒素還有待進一步研究。

4 結論

不同毒素在肝臟、肌肉、血清、糞便中殘留程度及消解程度不同。日糧中AFB1和ZEA含量越高，組織、器官及排泄物中毒素含量就越高，并且7 d 內AFB1和ZEA在組織、器官內殘留無法消除。添加霉菌毒素生物解毒劑可有效降低組織、器官及排泄物中AFB1和ZEA含量，為消除霉菌毒素危害奠定基礎。