■黃小乘 呂忠蕾 田怡豪 王宣力 李成云，2，3*

（1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉 133002；2.延邊大學(xué)肉?？茖W(xué)與產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，吉林延吉 133002；3.東北寒區(qū)肉?？萍紕?chuàng)新教育部工程研究中心，吉林延吉 133002）

縮合單寧（condensed tannins, CT）又稱為原花色素，是羥基黃烷-3-醇和羥基黃烷-3，4-醇，通過C4-C8 或C4-C6 的C-C 鍵縮合而成的縮合物[1]。許多豆科牧草，如山野豌豆、短花百脈根、紅豆草等以及分布在熱帶、亞熱帶的灌木、喬木等都含有縮合單寧[2]。反芻動物采食適量的縮合單寧（2%～4% DM）可防止膨脹病的發(fā)生，減緩反芻動物瘤胃微生物對蛋白質(zhì)降解的速度，提高豆科牧草的利用率和營養(yǎng)品質(zhì)[3]。植物中縮合單寧會受到植物的品種、植株的部位、成熟度、生長季節(jié)和土壤肥力、溫度、水分和光照等多種因素的影響[4-5]，而不同的縮合單寧對瘤胃發(fā)酵特性的影響不同。山野豌豆廣泛分布在歐洲、非洲及亞洲各地，其適口性好、生物量高、營養(yǎng)豐富、含有豐富的蛋白質(zhì)及適量的縮合單寧，牛、馬、羊、駱駝等都喜歡采食[6]，是一種品質(zhì)優(yōu)良的牧草。而目前關(guān)于山野豌豆中縮合單寧利用的報道比較少見。

本試驗對不同生長期山野豌豆中縮合單寧含量進行了測定,并通過在飼糧中添加不同生長時期山野豌豆縮合單寧，研究其對延邊黃牛瘤胃微生物發(fā)酵特性的影響，探討不同生長期山野豌豆縮合單寧對反芻動物過瘤胃蛋白保護效果及防止膨脹病等功能，以期為山野豌豆縮合單寧在反芻動物生產(chǎn)中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

山野豌豆來源于延邊長白山地區(qū)，分別在2020年7 月3 日、8 月6 日也就是山野豌豆的初花期、盛花期采集，采集后立即放置-80 ℃條件下保存；委托延邊大學(xué)草仙藥業(yè)有限公司對不同生長期山野豌豆中的縮合單寧進行工業(yè)化大量提取，所得山野豌豆縮合單寧粗提品純度為34.2%。

1.2 試驗動物與試驗飼糧

從吉林省龍井市海蘭江牧場選用9 頭健康無病的延邊黃牛公牛，平均體重（502.3±28.3）kg，均安裝永久性瘤胃瘺管?；A(chǔ)日糧參照美國NRC（2000）飼養(yǎng)標準配制。日糧配方及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.3 飼養(yǎng)管理與試驗設(shè)計

每天07:00、16:00進行定時飼喂、自由飲水，試驗期間保證飼養(yǎng)環(huán)境一致。試驗持續(xù)35 d，其中預(yù)試期15 d，正試期20 d。正試期第20 d 飼喂前、飼喂后1、3、6、9 h 采集瘤胃液，進行延邊黃牛瘤胃微生物發(fā)酵指標—pH、氨態(tài)氮（NH3-N）含量、揮發(fā)性脂肪酸（VFA）含量、微生物蛋白（MCP）濃度的測定，并利用實時定量熒光PCR（Real time PCR）測定延邊黃牛瘤胃總菌及溶纖維丁酸弧菌數(shù)量。

將9頭延邊黃牛隨機分為3組，其中對照組飼喂不添加山野豌豆縮合單寧提取物的基礎(chǔ)飼糧，初花期組飼喂添加了1%初花期山野豌豆縮合單寧提取物的基礎(chǔ)飼糧，盛花期組飼喂添加了1%盛花期山野豌豆縮合單寧提取物的基礎(chǔ)飼糧，每組每個時間點設(shè)3個重復(fù)。

1.4 試驗方法

1.4.1 樣品采集

冷凍干燥后的草粉粉碎，過40 目篩，做好標記，用于縮合單寧含量的測定；正試期第20 d 進行采樣，分別在進食前（6:00）與進食后1、3、6 h 和9 h（8:00、10:00、13:00和16:00），從各組延邊黃牛的瘤胃采集內(nèi)容物，充分混勻并用12層紗布過濾后，分別裝入按照試驗設(shè)計編號的50 mL 離心管中，迅速放入-80 ℃超低溫冷凍箱中冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 縮合單寧含量的測定

取粉碎樣品0.1 g，采用香蘭素鹽酸法（Vanilli-HCl）測定不同生長期山野豌豆縮合單寧的含量[7]。

1.4.3 瘤胃微生物發(fā)酵指標的測定

pH 使用酸度計（雷磁pHS-3C）對采集的瘤胃液進行即時測定；NH3-N 利用苯酚-次氯酸鈉比色法進行測定；采用氣相色譜法測定VFA[8]；MCP 的測定參照三氯醋酸（TCA）沉淀蛋白法[9]，其中，蛋白質(zhì)含量（mg/mL）=（1.45×D280-0.74×D260）×稀釋倍數(shù)。

1.4.4 瘤胃總菌、溶纖維丁酸弧菌的分析

取瘤胃液樣品，采用反復(fù)凍融法提取瘤胃液中的DNA[10]。然后對目標片段進行普通PCR擴增，反應(yīng)體系為：10×Buffur 2.50 μL，10 mmol/L 的dNTP 2.00 μL，10 μmol/L 的引物各1.50 μL，模板2.50 μL，Taq DNA聚合酶0.25 μL，去離子水14.75 μL，總體積25.00 μL；總菌反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min；溶纖維丁酸弧菌反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

之后設(shè)計目標菌種的引物，在GenBank上分別查找菌種的16S rDNA 序列，然后利用DNASTRAR 中的MegAlign 進行序列比對，尋找種內(nèi)保守區(qū)域，利用Primer express 5.0 進行引物設(shè)計，并通過GenBank 中BLAST檢測引物的特異性。目標菌株的引物見表2。

表2 總菌、溶纖維丁酸弧菌的引物

實時定量PCR 反應(yīng)體系：SYBR?Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)(2×)10.00 μL；PCR 上游引物（10 μmol/L）0.40 μL；PCR 下游引物（10 μmol/L）0.40 μL；ROX參比染料（50×）或ROX參比染料Ⅱ（50×）×2 0.40 μL；DNA 模板×3 2.00 μL；去離子水6.80 μL；共計20.00 μL。

兩步法PCR 擴增標準程序：預(yù)變性：95 ℃30 s，循環(huán)1 次；PCR 反應(yīng)：95 ℃40 s，60 ℃30～34 s，循環(huán)40次。

根據(jù)下列公式將瘤胃微生物目標菌數(shù)量表達式公式為：2-ΔΔCt=2-(ΔCt-ΔCtcb)，2-ΔΔCt是目標菌的初始模板量，ΔCt為目標菌引物所測的Ct值，ΔCtcb 為內(nèi)參模板的引物所測的Ct值。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)均采用Excel 軟件進行數(shù)據(jù)預(yù)處理，然后用SPSS 19.0 軟件中單因素方差分析過程（one-way ANOVA）進行統(tǒng)計，均值的多重比較采用LSD和Dun?can’s法進行分析，數(shù)據(jù)均以“平均值±標準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生長期山野豌豆縮合單寧含量（見表3）

表3 不同生長期山野豌豆縮合單寧含量(g/kg DM)

如表3所示，山野豌豆縮合單寧含量為36.482 7～38.261 1 g/kg DM，且盛花期縮合單寧含量更多。

2.2 不同生長期山野豌豆縮合單寧對延邊黃牛瘤胃微生物發(fā)酵特性的影響

2.2.1 不同生長期山野豌豆縮合單寧提取物對延邊黃牛瘤胃pH的影響（見表4）

由表4可知各組的pH隨發(fā)酵時間呈先降低后升高的趨勢，其中飼喂之前pH 最高，飼喂后1 h 開始降低，飼喂后3 h達到最低，然后開始升高。在飼喂后1 h時，盛花期組延邊黃牛瘤胃pH 顯著高于對照組和初花期組（P<0.05），在飼喂后6 h和9 h時，初花期組、盛花期組pH顯著高于對照組（P<0.05），初花期組、盛花期組之間pH差異不顯著（P>0.05）。

表4 不同生長期山野豌豆縮合單寧提取物對延邊黃牛瘤胃pH的影響

2.2.2 不同生長期山野豌豆縮合單寧提取物對延邊黃牛瘤胃NH3-N含量的影響（見表5）

由表5可知各組瘤胃NH3-N的濃度在飼喂后1 h時達到最高，在飼喂后6 h 時達到最低，在飼喂后9 h時略有回升。在飼喂后3、6、9 h 時初花期組、盛花期組瘤胃NH3-N 含量顯著低于對照組（P<0.05）。在飼喂后3 h 和9 h 時，瘤胃NH3-N 含量初花期組與盛花期組差異顯著（P<0.05）。

表5 不同生長期山野豌豆縮合單寧提取物對延邊黃牛瘤胃NH3-N含量的影響（mg/dL）

2.2.3 不同生長期山野豌豆縮合單寧提取物對延邊黃牛瘤胃VFA的影響（見表6）

表6 不同生長期山野豌豆縮合單寧提取物對延邊黃牛瘤胃VFA含量的影響

由表6 可知各組瘤胃中乙酸、丙酸、丁酸和總揮發(fā)性脂肪酸（total volatile fatty acid, TVFA）的濃度在飼喂后呈先升高后降低的趨勢。在飼喂后1 h 時，盛花期組乙酸濃度顯著低于對照組和初花期組（P<0.05）；在飼喂后6 h 和9 h 時，初花期組、盛花期組乙酸濃度顯著低于對照組（P<0.05），其中，飼喂后6 h時，盛花期組乙酸濃度顯著低于對照組和初花期組（P<0.05）。在飼喂前（0 h）時，初花期組、盛花期組丙酸濃度與對照組差異極顯著（P<0.01）；飼喂后1 h時，盛花期組與初花期組差異顯著（P<0.05）；在飼喂后9 h時，初花期組、盛花期組丙酸濃度顯著低于對照組（P<0.05）。在飼喂后9 h時，初花期組、盛花期組丁酸濃度顯著低于對照組（P<0.05）。在飼喂前（0 h）時和飼喂后6 h 時，初花期組乙酸/丙酸比值與對照組、盛花期組差異顯著（P<0.05），在飼喂后9 h時，差異達到極顯著（P<0.01）；在飼喂后1 h和3 h時，初花期組、盛花期組乙酸/丙酸比值極顯著低于對照組（P<0.01）。在飼喂前（0 h）時盛花期組TVFA 含量與初花期組、對照組相比差異極顯著（P<0.01）；在飼喂后3 h 時，盛花期組TVFA 含量極顯著低于初花期組和對照組（P<0.01）。在飼喂后9 h時，初花期組和盛花期組TV?FA極顯著低于對照組（P<0.01）。

2.2.4 不同生長期山野豌豆縮合單寧提取物對延邊黃牛瘤胃MCP的影響（見表7）

表7 不同生長期山野豌豆縮合單寧提取物對延邊黃牛瘤胃MCP的影響（mg/mL）

由表7可知，在飼喂后3 h時初花期組、盛花期組瘤胃MCP 顯著低于對照組(P<0.05)，初花期組與盛花期組兩組之間差異不顯著(P>0.05)；飼喂后6 h 時，初花期組與盛花期組瘤胃MCP 顯著低于對照組(P<0.05)，并且，初花期組與盛花期組兩組之間差異顯著(P<0.05)；飼喂后9 h 時，各組瘤胃MCP 差異不顯著(P>0.05)。

2.3 不同生長期山野豌豆縮合單寧提取物對延邊黃牛瘤胃微生物的影響（見圖1、圖2、表8）

表8 不同生長期山野豌豆縮合單寧提取物對延邊黃牛瘤胃內(nèi)目標菌數(shù)量（目標基因相對表達量）的影響

圖1 總菌Real-time PCR擴增曲線

圖2 溶纖維丁酸弧菌Real-time PCR擴增曲線

由圖1、2可知，總菌和溶纖維丁酸弧菌的擴增動力學(xué)曲線光滑，指數(shù)期明顯，符合計算標準。由表8可知各組的瘤胃總菌數(shù)量沒有顯著差異（P>0.05）。與對照組相比，飼喂不同生長期山野豌豆可以顯著降低溶纖維丁酸弧菌數(shù)量（P<0.05），盛花期組作用更強。

3 討論

3.1 不同生長期山野豌豆縮合單寧含量

植物品種、生長期不同，縮合單寧的含量不同[11]。本試驗利用香蘭素鹽酸法測定不同生長期山野豌豆縮合單寧的含量，由于香蘭素-鹽酸還能與其他植物成分（如二氫查耳酮和花青苷等）發(fā)生反應(yīng)，所以用香蘭素鹽酸法測得的縮合單寧含量會有點偏高[12]。研究表明，當飼喂的縮合單寧含量超過3%就可能會降低山羊的采食量[13]。在飼糧中添加120 g/kg 縮合單寧，降低了荷斯坦奶牛的干物質(zhì)采食量[14]。這是由于單寧與唾液蛋白和糖蛋白在口腔中相互作用，會引起收斂感、干燥感、澀味，飼料適口性下降，干物質(zhì)采食量降低[15]。本試驗不同生長期山野豌豆縮合單寧提取物的添加量為1%，不會引起采食量降低。

3.2 不同生長期山野豌豆縮合單寧對延邊黃牛瘤胃微生物發(fā)酵特性的影響

不同生長期山野豌豆縮合單寧均使延邊黃牛瘤胃內(nèi)的pH有上升趨勢，這是由于縮合單寧可以結(jié)合蛋白質(zhì)，降低蛋白質(zhì)在瘤胃中的溶解度和表面活性，避免被瘤胃微生物迅速降解，形成了過瘤胃蛋白保護機制[16]，有機酸生成量減少，減緩pH的下降。而盛花期組pH相對較高，可能是由于分子量大的縮合單寧擁有較強的極性，更容易與蛋白質(zhì)結(jié)合[17]，過瘤胃蛋白保護效果更好。Barry等[18]也得到相同結(jié)論，發(fā)現(xiàn)在同樣濃度條件下，縮合單寧分子量越高對飼料蛋白質(zhì)的保護效果越強。

瘤胃液中氨態(tài)氮濃度在一定程度上反映了瘤胃微生物分解含氮物質(zhì)產(chǎn)生氨的速度。反芻動物飼喂高質(zhì)量牧草時，絕大多數(shù)氨態(tài)氮以尿素的形式被排出體外[19]，飼料利用率下降。Powell 等[20]研究發(fā)現(xiàn)將含有縮合單寧的牧草飼喂反芻動物，飼喂縮合單寧組動物糞氮/尿氮比值顯著高于未飼喂縮合單寧組，氮排泄途徑發(fā)生了改變。Wang 等[21]試驗發(fā)現(xiàn)飼喂紅豆草干草能使羊瘤胃NH3-N濃度顯著降低。本試驗也獲得一致的結(jié)果，在飼喂后3、6 h和9 h時，添加不同時期山野豌豆縮合單寧提取物都可以顯著降低瘤胃NH3-N 的濃度（P<0.05），起到保護過瘤胃蛋白的作用，其中盛花期組作用更強。

反芻動物機體代謝的碳流量的2/3來自瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的VFA，可提供機體需要總能量的70%～80%。本試驗發(fā)現(xiàn)，在飼糧中添加不同生長期山野豌豆縮合單寧提取物可以顯著降低延邊黃牛瘤胃內(nèi)VFA 濃度（P<0.05）。這是因為在采食后，瘤胃快速發(fā)酵，產(chǎn)生大量的乙酸、丙酸、丁酸等，隨著時間的推移，VFA 逐漸被瘤胃微生物利用及被瘤胃壁吸收，濃度下降[22]。而縮合單寧有抑制瘤胃微生物生長以及抵抗生物降解的能力，所以瘤胃細菌、原蟲和真菌等微生物對粗纖維、淀粉等碳水化合物的降解也被抑制，VFA 含量的降低，可以有效預(yù)防反芻動物瘤胃酸中毒[23-24]。Slianikove等[25]用含縮合單寧的白堅木、角豆樹等飼喂發(fā)現(xiàn)，瘤胃液中VFA 濃度降低（P<0.05），與本試驗的研究結(jié)果一致。

在飼糧中添加不同生長期山野豌豆縮合單寧提取物使得延邊黃牛瘤胃MCP濃度降低（P<0.05），這是因為瘤胃內(nèi)微生物蛋白質(zhì)的合成主要取決于瘤胃內(nèi)碳水化合物和氮的利用效率，而縮合單寧可以保護過瘤胃蛋白，蛋白質(zhì)與縮合單寧形成復(fù)合物，微生物可以利用的氮源含量降低，使得微生物蛋白質(zhì)合成量和生產(chǎn)效率降低[26]。雖然NH3-N的濃度降低對MCP的合成產(chǎn)生影響，但Slyter[27]認為微生物正常生長對氨濃度耐受的臨界范圍是0.35～29.00 mg/dL之間，本試驗NH3-N的濃度在此范圍內(nèi)，因此可以排除NH3-N的濃度影響。

3.3 不同生長期山野豌豆縮合單寧提取物對延邊黃牛瘤胃微生物的影響

溶纖維丁酸弧菌是一種嚴格厭氧型革蘭氏陽性菌，不僅具有蛋白降解酶活性，還有生物氫化的作用，乙酸和丁酸都是其發(fā)酵主要產(chǎn)物[28]。在飼糧中添加不同生長期的山野豌豆縮合單寧提取物均顯著降低了瘤胃中溶纖維丁酸弧菌的數(shù)量（P<0.05），且瘤胃中乙酸和丁酸濃度降低也可以一定程度上反應(yīng)出縮合單寧對溶纖維丁酸弧菌的抑制。研究表明，在綿羊飼糧中添加2%的縮合單寧，顯著降低了瘤胃中總細菌和溶纖維丁酸弧菌的數(shù)量[29]。據(jù)Min[30]報道，當在綿羊飼糧中添加含縮合單寧的百脈根（縮合單寧32 g/kg DM），瘤胃丁酸弧菌數(shù)量減少，與本試驗結(jié)果一致。通常認為，單寧能夠抑制微生物生長。雖然單寧對瘤胃微生物有較強的抑制作用，但仍有很多微生物通過不同的方式適應(yīng)單寧對其的影響，如分泌聚合物與單寧結(jié)合以減少單寧對微生物的影響[31]。Animut等[32]在山羊飼糧中添加神戶胡枝子單寧，發(fā)現(xiàn)細菌總數(shù)沒有受到影響。在本試驗中，在飼糧中添加不同生長期山野豌豆縮合單寧提取物，瘤胃總菌的數(shù)量與對照組相比沒有顯著差異（P>0.05），證明添加不同生長期山野豌豆縮合單寧提取物不會影響瘤胃微生物的整體環(huán)境。

4 結(jié)論

山野豌豆在不同生長期，縮合單寧含量不同，且盛花期山野豌豆縮合單寧含量更多。在飼糧中添加不同生長期山野豌豆縮合單寧提取物均使延邊黃牛瘤胃內(nèi)的pH有上升趨勢，使NH3-N、MCP和VFA的濃度有下降趨勢。在飼糧中添加不同生長期山野豌豆縮合單寧提取物均對延邊黃牛瘤胃內(nèi)溶纖維丁酸弧菌有抑制作用，對瘤胃總菌沒有影響。證明山野豌豆縮合單寧有保護過瘤胃蛋白、預(yù)防酸中毒的作用，且盛花期山野豌豆縮合單寧保護過瘤胃蛋白的效果更好。