■華詩卉 周柏汝 張延龍 姜承言 姚瑞珂 李敬雙 于 洋

（錦州醫(yī)科大學(xué)，遼寧錦州 121001）

免疫增強(qiáng)劑是一些單獨(dú)使用即能引起機(jī)體出現(xiàn)短暫的免疫功能增強(qiáng)作用的物質(zhì)，有的與抗原同時(shí)使用。在畜禽生產(chǎn)中常將免疫增強(qiáng)劑與疫苗同時(shí)使用，以達(dá)到增強(qiáng)免疫功能、延長(zhǎng)免疫時(shí)間的效果[1]。目前常用的免疫增強(qiáng)劑主要是化學(xué)性免疫增強(qiáng)劑，其藥物殘留量大，易影響食品安全。中藥免疫增強(qiáng)劑藥物殘留量小，安全性高，特別是復(fù)方中藥免疫增強(qiáng)劑通過藥物配伍藥效更佳，越來越受到科研人員的重視。

黃芪、紫錐菊、當(dāng)歸、枸杞、金銀花、熟地和甘草都是我國傳統(tǒng)的中藥，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)臨床。本研究根據(jù)單味中藥的性能和功效，按照中醫(yī)理論，辨癥施治的原則進(jìn)行組方，添加雛雞日糧中。檢測(cè)中藥組方對(duì)新城被病毒（NDV）抗體效價(jià)、免疫器官指數(shù)、脾淋巴細(xì)胞增殖、脾淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-4（IL-4）和壞死因子-α（TNF-α）的影響。為復(fù)方中藥免疫增強(qiáng)劑的開發(fā)和在飼料添加劑中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

1 日齡海蘭褐公雞雛，由錦州鴻強(qiáng)牧業(yè)有限公司提供。

1.2 疫苗

雞新城疫弱毒疫苗，遼寧省益康生物股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)19306002。

1.3 藥品

當(dāng)歸（產(chǎn)地甘肅岷縣）；黃芪、枸杞和甘草（產(chǎn)地甘肅省寧夏）；紫錐菊（產(chǎn)地河北省保定）；金銀花（山東省平邑縣）；熟地（河南省焦作）；鹽酸左旋咪唑粉（四川省飛天動(dòng)物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)200901）。

1.4 主要試劑

IL-4和TNF-α試劑盒（武漢純度生物科技有限公司生產(chǎn)）；雞新城疫病毒血凝抑制試驗(yàn)（HI）抗原（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所生產(chǎn)）；磷酸鹽緩沖溶液（PBS）、RPMI-1640培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）、氯化銨（NH4Cl）和三羥甲基氨基甲烷（Tris）（北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)）；二甲基亞砜（DMSO）、四甲基偶氮唑鹽（MTT）、臺(tái)盼藍(lán)（Trypan Blue），上海展云化工有限公司生產(chǎn)。

2 方法

2.1 復(fù)方中藥的制備

黃芪、紫錐菊、當(dāng)歸、枸杞、金銀花、熟地和甘草按質(zhì)量分?jǐn)?shù)，分別占30%、20%、10%、10%、10%、10%和10%，每味中藥用中藥粉碎機(jī)充分粉碎后過80 目篩，按比例混合裝袋備用。

2.2 試驗(yàn)動(dòng)物分組與飼養(yǎng)方法

試驗(yàn)設(shè)5 個(gè)組，1 組為空白對(duì)照組，2 組為陽性對(duì)照組，3、4 組和5 組分別為添加不同濃度復(fù)方中藥組。每組30只雞雛，自由采食、飲水，7日齡用雞新城疫弱毒疫苗進(jìn)行免疫，操作按照疫苗說明書進(jìn)行，按說明書2倍用量。1組飼料不加藥物，2組在飼料中加鹽酸左旋咪唑粉（0.1 g/kg），3、4 組和5 組在飼料中加入不同濃度（5、10 g/kg和15 g/kg）復(fù)方中藥。

2.3 NDV抗體效價(jià)的檢測(cè)

28 日齡，每組隨機(jī)抽取20 只雞，采用血凝（HA）和血凝抑制（HI）檢測(cè)NDV抗體效價(jià)，按照姚火春[2]方法操作。

2.4 免疫器官指數(shù)的檢測(cè)

28 日齡，每組隨機(jī)抽取20 只雛雞，檢測(cè)胸腺、法氏囊和脾臟指數(shù)，按照李金鳳等[3]的方法操作。

2.5 脾淋巴細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子分泌的檢測(cè)

28 日齡，每組隨機(jī)抽取5 只雛雞，無菌操作取出脾臟分離淋巴細(xì)胞，制成淋巴細(xì)胞懸液，MTT 法檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞增殖，ELISA 法檢測(cè)IL-4 和TNF-α的分泌，按照仇真毓等[4]試驗(yàn)方法操作。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±S）”表示，用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0進(jìn)行一維方差分析組間差異。小寫字母表示差異顯著P<0.05，大寫字母表示差異極顯著P<0.01。

3 結(jié)果與分析

3.1 復(fù)方中藥對(duì)NDV抗體效價(jià)的影響(見圖1)

圖1 復(fù)方中藥對(duì)NDV抗體效價(jià)的影響

由圖1可知，1組NDV抗體效價(jià)極顯著低于2 組、3 組和4 組（P<0.01），顯著低于5 組（P<0.05），2 組與4 組之間差異不顯著（P>0.05），表明復(fù)方中藥能夠提高NDV抗體效價(jià)，4組效果最佳。

3.2 復(fù)方中藥對(duì)免疫器官指數(shù)的影響(見圖2)

由圖2可知，1組胸腺指數(shù)、法氏囊指數(shù)和脾指數(shù)均極顯著低于2、3、4、5 組（P<0.01），胸腺指數(shù)2 組與3、4 組差異均不顯著（P>0.05），法氏囊指數(shù)和脾指數(shù)2 組與4 組差異不顯著（P>0.05），表明復(fù)方中藥能夠促進(jìn)免疫器官的發(fā)育，4組效果最佳。

圖2 復(fù)方中藥對(duì)免疫器官指數(shù)的影響

3.3 復(fù)方中藥對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖的影響(見圖3)

由圖3 可知，1 組脾淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)均極顯著低于2、3、4、5 組（P<0.01），2 組與4 組差異不顯著（P>0.05），表明復(fù)方中藥能夠促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖，4 組效果最佳。

2.4 復(fù)方中藥對(duì)脾淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子分泌量的影響(見圖4)

圖4 復(fù)方中藥對(duì)脾淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子分泌量的影響

由圖4 可知，1 組IL-4 和TNF-α分泌量均極顯著低于2、3、4、5 組（P<0.01），IL-4 分泌量2 組與4 組差異不顯著（P>0.05），TNF-α分泌量2 組與3、4 組差異不顯著（P>0.05），表明復(fù)方中藥能夠促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞IL-4和TNF-α的分泌，以4組效果最佳。

4 討論

4.1 復(fù)方中藥免疫調(diào)節(jié)作用效果分析

黃芪、紫錐菊、當(dāng)歸、枸杞、金銀花、熟地和甘草都是我國傳統(tǒng)的中藥。黃芪可以補(bǔ)氣升陽，主要成分含有多糖類、黃酮類和三萜類等，具有增強(qiáng)免疫、抗腫瘤、抗病毒等功效[5]。紫錐菊被西方國家稱為萬能的免疫草藥，主要成分含有多糖類、黃酮類和多酚類等，成為國際上熱門的免疫促進(jìn)劑和免疫調(diào)節(jié)劑[6]。當(dāng)歸為補(bǔ)血之圣藥，主要成分含有揮發(fā)油、有機(jī)酸、多糖、黃酮等，具有增強(qiáng)免疫、抗腫瘤、抗氧化等功效[7]。枸杞可以補(bǔ)氣強(qiáng)精，滋補(bǔ)肝腎，主要成分是枸杞子色素，具有提高機(jī)體免疫力、抗炎等作用[8]。金銀花清熱解毒，涼散風(fēng)熱，主要含有黃酮類、綠原酸類和皂苷類等成分，被譽(yù)為“清熱解毒之良藥”[9]。熟地可以補(bǔ)腎填精，養(yǎng)血滋陰，主要成分是多糖、5-羥甲基醛糖和氨基酸，具有抗氧化、增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤等功效[10]。甘草可以補(bǔ)脾益氣，清熱解毒，主要成分含有多糖類、黃酮類和三萜類等，具有增強(qiáng)免疫、抗炎、抗腫瘤、抗病毒等功效[11]。本研究按照中醫(yī)和中獸醫(yī)理論，辨癥施治的原則，依據(jù)黃芪、紫錐菊、當(dāng)歸、枸杞、金銀花、熟地和甘草的性能與功效，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別占30%、20%、10%、10%、10%、10%和10%進(jìn)行組方，達(dá)到補(bǔ)氣升陽、補(bǔ)腎填精、健脾養(yǎng)血、強(qiáng)筋健骨、清熱解毒的效果，從而發(fā)揮免疫功效。

4.2 復(fù)方中藥對(duì)雞免疫功能的影響

4.2.1 復(fù)方中藥對(duì)NDV抗體效價(jià)的影響

抗體效價(jià)的高低直接反應(yīng)機(jī)體的體液免疫狀態(tài)[12]。靳雙星等[13]利用黃芪、板藍(lán)根、連翹、茯苓、山楂、枳實(shí)和白術(shù)制成復(fù)方中藥合劑，利用7、10日齡和14 日齡未免疫AA 肉雞，各日齡均設(shè)復(fù)方中藥制劑低、中、高劑量組（飲水中加入5、10 mL/L和15 mL/L），連用21 d。7、10日齡和14日齡的雞分別用NDClone-30 疫苗滴、鼻點(diǎn)眼，ND 油乳劑滅活苗頸部皮下注射，IBD疫苗滴口。21、28日齡和35日齡采用瓊脂擴(kuò)散沉淀反應(yīng)測(cè)定抗體效價(jià)，結(jié)果復(fù)方中藥制劑能提高NDV和IBDV 抗體效價(jià)。本研究結(jié)果復(fù)方中藥能夠提高NDV 抗體水平，與上述結(jié)果是一致的，說明復(fù)方中藥可以調(diào)節(jié)機(jī)體的體液免疫功能。

4.2.2 復(fù)方中藥對(duì)脾淋巴細(xì)胞功能的影響

淋巴細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫活性細(xì)胞，只有受到抗原刺激才能活化。細(xì)胞分裂增殖、產(chǎn)生抗體和分泌細(xì)胞因子是淋巴細(xì)胞活化的重要標(biāo)志。淋巴細(xì)胞增殖是衡量機(jī)體免疫調(diào)節(jié)功能強(qiáng)弱的重要指標(biāo)[14]。顧歡歡等[15]用42日齡肉雞分離脾淋巴細(xì)胞，用淫羊藿多糖選用5 個(gè)濃度（1 500.00、1 250.00、625.00、312.50 μg/mL和156.25 μg/mL）單獨(dú)和協(xié)同脂多糖（LPS）刺激，用MTT法測(cè)定淋巴細(xì)胞增殖率，結(jié)果淫羊藿多糖可刺激脾臟淋巴細(xì)胞增殖。IL-4是Th2型細(xì)胞因子，誘導(dǎo)幼稚輔助性T細(xì)胞分化成Th2細(xì)胞[16]，對(duì)疫苗免疫應(yīng)答具有調(diào)節(jié)作用，是衡量疫苗免疫的重要指標(biāo)[17]。TNF-α是Th1型細(xì)胞因子，影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng)、增殖、分化和凋亡，從而影響機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)活性功能[18]。靳二輝等[19]將女貞子、枸杞、當(dāng)歸、金銀花、熟地、淫羊藿和黃芪粉碎制成復(fù)方制劑，應(yīng)用于1日齡AA肉仔雞，復(fù)方制劑設(shè)3個(gè)劑量組（日糧中添加5、1 g/kg和1 g/kg），21 和42 日齡ELISA 法檢測(cè)血清中細(xì)胞因子的分泌，結(jié)果表明復(fù)方制劑能夠促進(jìn)INF-γ、IL-4 和IL-12 的分泌。仇真毓等[4]將洋蔥槲皮素添加到雛雞日糧中，洋蔥槲皮素設(shè)4個(gè)不同濃度組（1、2、4 g/kg和8 g/kg），30日齡ELISA法檢測(cè)TNF-α的分泌，結(jié)果洋蔥槲皮素能夠促進(jìn)TNF-α的分泌。本研究結(jié)果復(fù)方中藥能夠刺激脾淋巴細(xì)胞增殖，促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞IL-4 和TNFα的分泌，與上述結(jié)果是一致的，說明復(fù)方中藥能夠活化淋巴細(xì)胞，從而發(fā)揮淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)活性。

4.2.3 復(fù)方中藥對(duì)免疫器官發(fā)育的影響

免疫器官的重量可用于評(píng)價(jià)雛雞的免疫狀態(tài)[20]。呂樹臣等[21]將黃芪、黃柏、甘草、防風(fēng)和蒲公英按不同百分比（25%、25%、10%、10%和20%）制成復(fù)合型中藥添加劑，用21 日齡貴妃雞，復(fù)合型中藥添加劑設(shè)3 個(gè)劑量組（日糧中添加5、10 g/kg 和15 g/kg），試驗(yàn)期為91 d，結(jié)果復(fù)合型中藥添加劑能夠提高雞胸腺、法氏囊和脾的重量。本研究結(jié)果復(fù)方中藥能夠提高胸腺、法氏囊和脾指數(shù)，與上述結(jié)果是一致的，說明復(fù)方中藥能夠促進(jìn)免疫器官的發(fā)育，從而提高機(jī)體的免疫功能。

5 結(jié)論

復(fù)方中藥能夠促進(jìn)雞抗體的產(chǎn)生，促進(jìn)免疫器官的發(fā)育，刺激脾淋巴細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的分泌，從而提高雞的免疫功能，10 g/kg的添加量效果最佳。