廖 暉，王 毅，徐小平，周陳杰，張健民，鐘克波，楊定華

1南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院肝膽二科，廣東 廣州 510280；2南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院肝膽外科，廣東 廣州510515

肝細(xì)胞癌（HCC）發(fā)病率位居惡性腫瘤的第6位，起病隱匿，進(jìn)展迅速［1-2］。肝癌的治療措施中有望獲得治愈的方法有手術(shù)切除、肝移植和局部消融，但這些方法主要適用于早期患者［2-3］。對于晚期和上述方法治療失敗的肝癌患者仍缺乏有效的治療措施［2-3］。近年來，隨著對分子發(fā)病機制的深入研究，多條與HCC發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的信號通路被闡明，促進(jìn)了HCC分子靶向治療的發(fā)展［4-6］。另一方面，目前已有研究指出哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）與其他蛋白結(jié)合形成mTOR 復(fù)合物1（mTORC1）和mTOR復(fù)合物2（mTORC2），這些蛋白復(fù)合物與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［7-9］。

研究表明HCC患者存在mTOR信號異常激活，是非常有前景的治療肝細(xì)胞癌的分子靶點［10］。目前，針對mTOR的靶向藥物主要是傳統(tǒng)mTORC1抑制劑雷帕鳴及其衍生物。從目前的臨床數(shù)據(jù)來看，這些藥物對HCC的治療遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有達(dá)到預(yù)期的臨床效果，可能的原因主要為三點：不能完全地抑制mTORC1 的活性；對mTORC2 無效；反饋性地激活了AKT信號［11-16］。因此，研究者們希望能夠研發(fā)同時阻斷mTORC1 信號和mTORC2 信號的新型雙mTOR 抑制劑。AZD2014屬于APT竟?fàn)幮缘膍TOR激酶抑制劑［17］。研究表明它可以同時抑制mTORC1和mTORC2信號，且不激活A(yù)KT信號，具有顯著的抗癌作用［18-23］。前期我們在肝癌細(xì)胞株中也觀察到AZD2014具有較好的抗癌作用［24］。但AZD2014在動物體內(nèi)對HCC是否具有抗癌作用尚不清楚。本研究擬在裸鼠皮下成瘤模型中，研究AZD2014在動物體內(nèi)對肝細(xì)胞癌的抗癌作用及其機制，為HCC的防治提供更多思路。

1 材料和方法

1.1 肝癌細(xì)胞、裸鼠來源

人肝癌細(xì)胞株HCCLM3購買于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，雄性無特定病原體（SPF）Balb/c裸鼠16只購買于廣東省醫(yī)學(xué)動物實驗中心，4～6周齡，體質(zhì)量18～22 g，飼養(yǎng)于南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院動物實驗中心。AZD2014購買于美國Selleckchem公司。本實驗通過南方醫(yī)科大學(xué)動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 藥品與試劑

PV-9000通用型二步法免疫組化檢測試劑盒購買于北京中杉金橋公司），包括：E鈣蛋白（E-cadherin）單克隆一抗（CST），神經(jīng)性鈣黏附素（N-cadherin）單克隆一抗（CST），波形蛋白（Vimentin）單克隆一抗（CST），CD31 單克隆一抗（CST），Ki-67 單克隆一抗（CST），Cleaved caspase-3單克隆一抗（CST）。

1.3 裸鼠皮下成瘤實驗和分組

HCCLM3用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。HCCLM3細(xì)胞濃度培養(yǎng)至5×107/mL時在每只裸鼠右側(cè)腰腹部皮下接種100 μL細(xì)胞懸液。接種后觀察裸鼠一般狀態(tài)和腫瘤生長情況。待皮下成瘤塊明顯后（體積＞20 mm3），將其隨機分成對照組和AZD2014 組，每組各5 只。AZD2014 組每天腹腔注射一次AZD2014 藥物，劑量為5 mg/kg；對照組每天腹腔注射藥物溶劑（0.2%Tween80+2%聚乙二醇的PBS液）2.5 mL/kg。每4 d用游標(biāo)卡尺測量裸鼠皮下瘤塊的最長徑和對應(yīng)的正中垂直線，并計算腫瘤體積。連續(xù)給藥24 d后處死裸鼠，剝離皮下瘤塊并測量體積，并進(jìn)行組織學(xué)檢測。

1.4 HE染色和免疫組化染色

腫瘤組織經(jīng)脫水、包埋后制成石蠟切片。切片經(jīng)脫蠟、水化后置于蘇木素溶液和伊紅染液中染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片。

切片脫蠟、水化后采用高壓修復(fù)組織抗原，3%H2O2溶液滅活內(nèi)源性過氧化物酶。山羊血清封閉20 min。滴加一抗E-cadherin（1∶100）、N-cadherin（1∶125）、Vimentin（1∶200）、CD31（1∶100）、Ki-67（1∶400）、Cleaved caspase-3（1∶200）。按照試劑盒說明書滴加試劑，二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木素復(fù)染。組織切片梯度酒精中脫水，二甲苯透明及封片。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，采用每組5 只實驗動物已可達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義，為遵循動物倫理學(xué)相關(guān)要求，故選擇每組5 只實驗動物進(jìn)行實驗。采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，正態(tài)分布計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組比較采用t檢驗，兩組多個時間點比較采用重復(fù)測量方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計意義。

2 結(jié)果

2.1 AZD2014對裸鼠腫瘤生長的影響

對照組腫瘤明顯大于AZD2014組（圖1）。不同時間點對照組和AZD2014 組腫瘤的體積比較（圖2），AZD2014組腫瘤體積隨時間延長，幾乎未再增長，而與此相反的是，對照組中的腫瘤體積隨著時間的延長而不斷增大（F=43.021，P＜0.001）。

圖1 裸鼠及皮下腫瘤Fig.1 Gross observatin of the tumor-bearing mice and the dissected tumors in control group(A)andAZD2014 group(B).

圖2 對照組和AZD2014組裸鼠皮下腫瘤增長情況Fig.2 Growth curve of subcutaneous tumor in nude mice treated with AZD2014 or vehicle (n=5).*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

2.2 AZD2014在體內(nèi)對肝細(xì)胞癌組織學(xué)的影響

HE染色發(fā)現(xiàn)AZD2014組中發(fā)生壞死的細(xì)胞明顯多于對照組（圖3）。我們對腫瘤組織中若干個細(xì)胞功能相關(guān)蛋白進(jìn)行了檢測。AZD2014給藥組中Ki-67的表達(dá)量明顯低于對照組（圖4）。在祼鼠體內(nèi)研究中，發(fā)現(xiàn)AZD2014給藥組中cleaved caspase-3的表達(dá)量明顯高于對照組（圖5）。AZD2014給藥組中CD31分子的表達(dá)量明顯低于對照組（圖6）。在體內(nèi)研究中，我們發(fā)現(xiàn)AZD2014 給藥組間質(zhì)細(xì)胞表型蛋白N-cadherin 和Vimentin的表達(dá)水平明顯低于對照組，而上皮細(xì)胞表型蛋白E-cadherin的表達(dá)水平則明顯高于對照組（圖7～9）。

圖3 腫瘤HE染色Fig.3 HE staining of the tumor tissues (Original magnification:×400).A:Control group.B:AZD2014 group.

圖4 免疫組化Ki-67的表達(dá)水平Fig.4 Immunohistochemical staining for detecting Ki-67 in the tumor tissues(×400).A:Control group.B:AZD2014 group.

圖5 免疫組化Cleaved caspase-3的表達(dá)水平Fig.5 Immunohistochemical staining for detecting cleaved caspase-3 in the tumor tissues(×400).A:Control group.B:AZD2014 group.

圖6 免疫組化CD31的表達(dá)水平Fig.6 Immunohistochemical staining for detecting CD31 in the tumor tissues(×400).A:Control group.B:AZD2014 group.

圖7 免疫組化E-cadherin蛋白表達(dá)水平Fig.7 Immunohistochemical staining for detecting E-cadherin in the tumor tissues(×400).A:Control group.B:AZD2014 group.

圖8 免疫組化Vimentin蛋白表達(dá)水平Fig.8 Immunohistochemical staining for detecting Vimentin in the tumor tissues(×400).A:Control group.B:AZD2014 group.

圖9 免疫組化N-cadherin蛋白表達(dá)水平Fig.9 Immunohistochemical staining for detecting N-cadherin in the tumor tissues(×400).A:Control group.B:AZD2014 group.

3 討論

HCC是一種普遍惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年增加［25］；其臨床表現(xiàn)輕重主要與腫瘤部位、病理類型及是否發(fā)生轉(zhuǎn)移有關(guān)，臨床上大部分患者就診時已是中晚期，不能或不適于進(jìn)行手術(shù)治療。晚期HCC患者多采用介入治療、藥物治療或多種方案聯(lián)合運用的綜合措施進(jìn)行治療，然而治療效果卻并不理想，這主要與HCC生物學(xué)特性有關(guān)［26］。

mTOR信號通路以mTORC1和mTORC2兩種復(fù)合物的形式存在，mTORC1主要聯(lián)合下游的4EBP1和S6K 參與促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，從而發(fā)揮促增殖作用［27］；mTORC2則主要聯(lián)合AKT通路發(fā)揮作用［26］。約半數(shù)以上的HCC患者表現(xiàn)出mTOR信號通路的異常激活。臨床上已將mTORC1的特異性抑制劑雷帕鳴用于HCC的治療，然而，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)雷帕鳴誘導(dǎo)自噬作用有限［24］，這在其他類型的腫瘤細(xì)胞中也有類似的報道［28］。

AZD2014作為高度選擇性的mTOR抑制劑，能夠在完全抑制mTORC1通路的同時抑制mTORC2通路，可作為新的抗腫瘤藥物應(yīng)用于臨床。目前其應(yīng)用于其他類型腫瘤的報道較多，而在HCC 中的應(yīng)用研究極少。有研究在口腔癌細(xì)胞上證實AZD2014能夠誘導(dǎo)G1/G2/M細(xì)胞周期阻滯［19］，有研究應(yīng)用永生化小鼠內(nèi)皮細(xì)胞證實AZD2014通過內(nèi)源性凋亡途徑來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［22］。

本實驗中，我們選用了一些指標(biāo)對腫瘤的增殖能力及細(xì)胞凋亡進(jìn)行了描述。Ki-67是一種細(xì)胞增殖相關(guān)抗原，其功能與細(xì)胞有絲分裂密切相關(guān)，在細(xì)胞增殖中發(fā)揮著不可或缺的作用［29］。Caspase-3是細(xì)胞凋亡中承擔(dān)重要功能的蛋白，已廣泛用于描述腫瘤細(xì)胞凋亡及壞死情況［30］。在實驗中，我們發(fā)現(xiàn)注射AZD2014的實驗組的腫瘤大小及增長速度均明顯小于對照組，同時表達(dá)低Ki-67表達(dá)和高Caspase-3表達(dá)的特性，這在HCC上對AZD2014的細(xì)胞周期阻滯和誘導(dǎo)凋亡作用提供進(jìn)一步佐證。另外，CD31作為一種廣泛存在于血管內(nèi)皮的細(xì)胞因子，常被用作描述微血管生成情況［31］。我們的研究發(fā)現(xiàn)，實驗組的CD31表達(dá)明顯低于對照組，可以證明AZD2014對腫瘤微血管生成亦有抑制作用。因此，本實驗證實了雙mTORC1/2抑制劑AZD2014在體內(nèi)可以顯著地抑制HCC的生長。

目前認(rèn)為上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變在惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等過程中發(fā)揮著重要的作用。HCC具有較強的轉(zhuǎn)移傾向和較高的復(fù)發(fā)率，這也正是近年來治療預(yù)后未能得到明顯改善的重要原因。若能抑制腫瘤細(xì)胞的EMT進(jìn)程，或可以打破這一僵局。TGF-β信號在調(diào)控EMT進(jìn)程中起著重要的作用［32-33］。有研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β可以通過PI3K信號通路激活mTORC1和mTORC2，增加細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成，增強細(xì)胞遷移和侵襲的能力，促進(jìn)細(xì)胞從上皮表型轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)表型［34-35］。我們前期的研究已證實AZD2014可以抑制體外肝癌細(xì)胞的EMT進(jìn)程［24］；本次研究中我們發(fā)現(xiàn)AZD2014 處理后的裸鼠腫瘤中HCC間質(zhì)表型蛋白N-cadherin 和Vimentin的表達(dá)水平明顯降低，而上皮表型蛋白E-cadherin 的表達(dá)水平則明顯升高，共同證明AZD2014 在體內(nèi)也能夠有效地抑制HCC的EMT進(jìn)程。

總之，我們證實了使用對mTORC1和mTORC2有聯(lián)合抑制作用的AZD2014，能夠更顯著的抑制HCC的增殖、微血管形成及EMT 進(jìn)程，同時還能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的壞死及凋亡，共同作用發(fā)揮更理想的肝細(xì)胞癌抗癌效果。AZD2014有望能作為HCC分子靶向治療新抑制劑在臨床應(yīng)用。