覃碧艷，刁 娜，白 嵐

1南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院消化內(nèi)科廣東省胃腸疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510515；2中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院消化內(nèi)科//廣東省結(jié)直腸盆底疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州510655

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）被認(rèn)為是代謝綜合征的肝臟表現(xiàn)，從非炎癥性孤立性肝臟脂肪變性到非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝硬化，甚至發(fā)展為肝癌，與胰島素抵抗及心血管疾病等代謝性疾病密切相關(guān)［1］。瘦型脂肪肝患者本身不具有代謝綜合征的危險(xiǎn)因素，常見于一些消耗性疾病，如晚期腫瘤［2,3］。腫瘤惡病質(zhì)患者及小鼠模型中血脂明顯下降，而肝臟組織卻發(fā)生了脂肪變性［4］。這可能是由于腫瘤惡病質(zhì)狀態(tài)下肝臟組織中糖異生及羥甲基戊二酰輔酶A還原酶增加，而脂肪酸氧化減少，肝臟極低密度脂蛋白分泌受抑制［5-8］。

甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白（PTHrP）是一種多效肽，最早發(fā)現(xiàn)于惡性腫瘤患者［9］，并參與了腫瘤惡病質(zhì)的進(jìn)展，其誘導(dǎo)白色脂肪組織UCP1表達(dá)增加，被認(rèn)為是腫瘤高代謝狀態(tài)的原因［10］。PTHrP 也可表達(dá)于正常機(jī)體的多種組織，通過自分泌和（或）旁分泌的方式作用于靶器官［11］。PTHrP的結(jié)構(gòu)與甲狀旁腺激素類似，因此其生物學(xué)作用與甲狀旁腺激素相似，可調(diào)節(jié)鈣磷代謝，促進(jìn)骨質(zhì)吸收［12］。NAFLD患者中肝臟及血漿中骨橋蛋白的表達(dá)與其脂肪變性、炎癥和纖維化的嚴(yán)重程度相關(guān)［13-15］。小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示骨橋蛋白的表達(dá)是NASH 發(fā)展所必需的，而骨橋蛋白的功能缺失則可預(yù)防或改善NASH［16-18］。但目前PTHrP 對(duì)NAFLD 的影響尚不明確。本文旨在研究PTHrP對(duì)MCD誘導(dǎo)的小鼠NAFLD模型的作用，探討PTHrP對(duì)NAFLD的影響，為NAFLD的預(yù)防及治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

空載腺相關(guān)病毒（AAV-Vehicle）、PTHrP 過表達(dá)腺相關(guān)病毒（AAV-PTHrP）（和元生物）；甘油三酯（TG）測(cè)定試劑盒、游離脂肪酸（FFAs）測(cè)定試劑盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT/GPT）測(cè)定試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST/GOT）測(cè)定試劑盒（南京建成）；PTHrP（Bachem）；FFAs（TCI）；蛋氨酸膽堿缺乏飼料（MCD）（Research Diets）；人正常肝細(xì)胞株（L02細(xì)胞株）、小鼠正常肝細(xì)胞株（AML細(xì)胞株）購(gòu)自昆明細(xì)胞庫，由本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)備用。

1.2 動(dòng)物模型的建立與標(biāo)本收集

6～8周雄性C57BL/6J小鼠購(gòu)自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心清潔級(jí)恒溫環(huán)境下飼養(yǎng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物保健和倫理委員會(huì)審查和批準(zhǔn)。小鼠隨機(jī)分為3組，每組4只，自由進(jìn)食進(jìn)水。分組如下：空白對(duì)照（Blank組）、MCD飼料加對(duì)照腺相關(guān)病毒（AAV-Vehicle組）、MCD飼料加PTHrP 過表達(dá)腺相關(guān)病毒（AAV-PTHrP組）。Blank組小鼠實(shí)驗(yàn)期間給予普通飼料喂養(yǎng)4周。AAV-Vehicle組和AAVPTHrP 組小鼠經(jīng)尾靜脈注射腺相關(guān)病毒1 周后給予MCD飼料喂養(yǎng)3周。每周定期稱量小鼠體質(zhì)量。小鼠經(jīng)12 h禁食后麻醉取血并收集肝臟組織。部分肝臟組織固定后作病理學(xué)分析。余下組織置于-80 ℃冰箱中保存，用于生化指標(biāo)檢測(cè)。

1.3 細(xì)胞模型的建立

細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L02細(xì)胞和AML細(xì)胞接種于六孔板。給予含250 μmol/L FFAs的無血清DMEM培養(yǎng)基處理24 h。

1.4 病理學(xué)分析

1.4.1 HE染色 肝臟組織石蠟包埋切片，依次進(jìn)行水化、Mayer氏蘇木素染色、1%鹽酸乙醇溶液分化、伊紅染液復(fù)染、脫水、二甲苯透明及中性樹脂封片后光鏡下觀察，采用NAFLD 活動(dòng)度（NAS）評(píng)分和SAF評(píng)分評(píng)估小鼠NAFLD病變程度。

1.4.2 油紅染色 肝臟組織固定后加入OCT包埋劑包埋。待組織冰凍成塊后6 μm連續(xù)切片。室溫平衡干燥冰凍切片。10%多聚甲醛固定。經(jīng)洗滌、浸泡脫水后加入油紅染液染色。85%異丙醇中浸泡、洗片。蘇木素染液染色。最后水洗后封片，光鏡下觀察。NAFLD細(xì)胞模型經(jīng)PTHrP處理后棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，加入多聚甲醛固定。后續(xù)步驟同肝臟組織油紅染色。

1.4.3 尼羅紅染色 L02脂肪肝細(xì)胞模型經(jīng)PTHrP處理后棄去細(xì)胞培養(yǎng)基。PBS緩沖液洗滌細(xì)胞。加入尼羅紅染色液。37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育后熒光顯微鏡下觀察。流式細(xì)胞術(shù)分析熒光強(qiáng)度。

1.4.4 天狼猩紅染色 肝臟組織石蠟包埋切片后水化。加入天狼猩紅染色液染色。水洗后脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，光鏡下觀察。

1.4.5 肝組織病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn) 鏡下肝細(xì)胞大泡性或以混合性為主的脂肪變性面積≥5%是病理學(xué)診斷NAFLD的必要條件。根據(jù)肝組織脂肪變是否伴有炎癥反應(yīng)和纖維化，NAFLD分為：（1）單純性脂肪肝：?jiǎn)渭冎咀冃曰蛑咀冃苑峭瑫r(shí)伴有肝小葉炎癥和氣球樣變性；（2）NASH：肝細(xì)胞脂肪變性同時(shí)伴有肝小葉炎癥和氣球樣變；（3）NASH相關(guān)性肝硬化：肝小葉結(jié)構(gòu)完全毀損，代之以假小葉形成和廣泛纖維化。

1.5 生化指標(biāo)檢測(cè)

收集血清及肝臟組織標(biāo)本，分別采用TG測(cè)定試劑盒、FFAs 測(cè)定試劑盒、ALT/GPT 測(cè)定試劑盒及AST/GOT測(cè)定試劑盒檢測(cè)各小鼠血清及肝臟中TG、FFAs、ALT及AST水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 6.0和SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間的差異比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTHrP加重MCD誘導(dǎo)的小鼠肝臟脂肪變性

根據(jù)肝臟組織的油紅染色結(jié)果，MCD飲食小鼠肝臟組織中均存在大量脂質(zhì)沉積，而AAV-PTHrP組更為明顯（圖1A）。HE染色結(jié)果同樣顯示AAV-PTHrP組小鼠脂肪空泡明顯多于AAV-Vehicle組，且空泡體積較大，胞核被擠壓于肝細(xì)胞一側(cè)，細(xì)胞界限不清（圖1B）。根據(jù)SAF評(píng)分，AAV-PTHrP組小鼠肝細(xì)胞脂肪變均可達(dá)到3 分，肝細(xì)胞脂肪變比例＞66%；AAV-Vehicle 組多為2 分，肝細(xì)胞脂肪變比例為34%～66%（P=0.049，圖1C）。AAV-PTHrP組小鼠肝臟中TG及FFAs的水平同樣高于其余兩組小鼠（P=0.0037，P=0.041）），而血清中TG及FFAs的水平則低于另外兩組小鼠（P=0.029，P＜0.001，圖1D～G）。

圖1 PTHrP過表達(dá)加重MCD小鼠誘導(dǎo)的肝臟脂肪變性Fig.1 PTHrP Overexpression aggravates hepatic steatosis in MCD mice.A,B:Oil red staining and HE staining of the liver tissue in AAV-vehicle group and AAV-PTHrP group.C:SAF score for steatosis in AAV-vehicle group and AAV-PTHrP group.D-G:Levels of TG and FFAs in the liver and serum in different groups(n=4).*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

2.2 PTHrP加重MCD誘導(dǎo)的小鼠肝臟損傷

實(shí)驗(yàn)過程中，與正常飲食組相比，MCD飲食小鼠出現(xiàn)體質(zhì)量下降，且AAV-PTHrP組小鼠體質(zhì)量下降更為明顯（圖2A）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，AAV-PTHrP組小鼠肝臟組織濕重低于較AAV-Vehicle組小鼠（P=0.044，圖2B）。AAVPTHrP組小鼠血清中ALT及AST的水平分別為134.76±35.80 U/L 和105.63±18.96 U/L，明顯高于Blank 組和AAV-Vehicle組小鼠（P=0.016，P=0.033，圖2C、D）。另外，肝臟組織中的ALT 水平也明顯高于Blank 組和AAV-Vehicle組（P=0.033），而后兩者ALT水平相當(dāng)（圖2E）。根據(jù)HE染色結(jié)果對(duì)MCD飲食小鼠進(jìn)行SAF評(píng)分和NAS評(píng)分。AAV-PTHrP組小鼠活動(dòng)度、纖維化程度和總SAF評(píng)分均高于AAV-Vehicle組，即AAV-PTHrP組小葉內(nèi)炎癥、肝細(xì)胞氣球樣變和肝纖維化均較AAVVehicle 組更為明顯（P=0.013，P=0.016，P＜0.001，圖2F～H）。NAS評(píng)分結(jié)果提示AAV-Vehicle組小鼠存在NASH可能，而AAV-PTHrP組小鼠存在NASH的可能性非常大（P=0.005，圖2I）。天狼星紅染色結(jié)果顯示，AAV-PTHrP組小鼠肝臟組織中膠原蛋白形成的纖維間隔較AAV-Vehicle組小鼠更強(qiáng)（P＜0.05，圖2J）。

圖2 PTHrP過表達(dá)加重MCD小鼠誘導(dǎo)的肝臟損傷Fig.2 PTHrP Overexpression aggravates hepatic injury in MCD mice.A:Weight changes in the 3 groups.B:Wet weight of the liver in AAV-vehicle group and AAV-PTHrP group.C-E:Levels of ALT and AST in the serum and ALT in the liver in the 3 groups.F,G:Grade of activity and stage of fibrosis in AAV-vehicle group and AAV-PTHrP group.H:SAF scores in AAV-vehicle group and AAV-PTHrP group.I:NAS of AAV-vehicle group and AAV-PTHrP group.J:Sirius red staining of the liver tissue in AAV-vehicle group andAAV-PTHrP group.n=4,*P＜0.05,**P＜0.01,**P＜0.001.

2.3 PTHrP在體外增加FFAs誘導(dǎo)的AML細(xì)胞脂質(zhì)沉積

無FFAs下，Control組及PTHrP組AML細(xì)胞內(nèi)脂滴水平相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3A）。給予FFAs刺激后，兩組AML細(xì)胞內(nèi)脂滴均明顯增多，且PTHrP組脂滴增加程度更為明顯（P=0.005，圖3B）。

圖3 PTHrP在體外促進(jìn)小鼠AML細(xì)胞脂質(zhì)沉積Fig.3 PTHrP promotes lipid deposition in AML cells in vitro.A:Oil red staining of AML cells in control group and PTHrP group(Original magnification:×400).B:Relative lipid content inAMLcells(n=3,**P＜0.01).

2.4 PTHrP在體外促進(jìn)FFAs誘導(dǎo)的L02細(xì)胞脂質(zhì)沉積

油紅和尼羅紅染色顯示PTHrP使FFAs誘導(dǎo)的L02脂肪肝細(xì)胞模型出現(xiàn)更明顯的脂質(zhì)沉積（圖4A）。進(jìn)一步通過流式細(xì)胞技術(shù)分析Control組和PTHrP組的尼羅紅染色的平均熒光強(qiáng)度，結(jié)果顯示PTHrP組平均熒光強(qiáng)度更高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.039，圖4B）。此外，CCK8 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)給予PTHrP 刺激后，F(xiàn)FAs 誘導(dǎo)的L02脂肪肝細(xì)胞模型細(xì)胞活性較低（P=0.015，圖4C）。

圖4 PTHrP在體外促進(jìn)L02細(xì)胞脂質(zhì)沉積Fig.4 PTHrP promotes lipid deposition in L02 cells in vitro.A:Oil red staining and Nile red staining of L02 cells(×400).B:Median fluorescence intensity(MFI)of Nile red staining of the control group and PTHrP group.C:Viability of L02 cells.n=3,*P＜0.05.

3 討論

以往觀點(diǎn)多認(rèn)為，“二次打擊”學(xué)說是NAFLD主要的發(fā)病機(jī)制，即脂肪變性和代謝應(yīng)激源的先后打擊引發(fā)一系列炎癥、脂肪壞死和纖維化形成［19,20］。然而，近年更多研究表明NAFLD需由多重因素同時(shí)作用形成［21,22］。肝臟組織中大量TG沉積是NAFLD的主要特征。肝細(xì)胞脂肪酸合成增多，過量TG沉積于肝臟脂滴內(nèi)，肝臟組織出現(xiàn)異常的脂質(zhì)堆積，最終導(dǎo)致脂肪肝的形成［23］。本研究通過檢測(cè)肝臟組織中各脂質(zhì)成分水平發(fā)現(xiàn)，PTHrP可促使MCD小鼠肝臟組織中TG及FFAs水平進(jìn)一步升高。病理學(xué)診斷NAFLD的必要條件為鏡下肝細(xì)胞大泡性或以混合性為主的脂肪變性面積≥5%，并根據(jù)肝組織脂肪變是否伴有炎癥反應(yīng)和纖維化分為單純性脂肪肝、NASH和NASH相關(guān)性肝硬化［24］。AAV-PTHrP組小鼠肝細(xì)胞脂肪變百分比＞67%，AAV-Vehicle組肝細(xì)胞脂肪變百分比多為34%～66%，即兩組小鼠均可達(dá)到NAFLD病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)，且PTHrP加重了MCD誘導(dǎo)的小鼠肝組織脂肪變。

內(nèi)毒素血癥可刺激成人肝臟組織產(chǎn)生PTHrP，誘導(dǎo)肝臟發(fā)生急性損傷反應(yīng)［25］。血清ALT水平升高是急性肝細(xì)胞損害的敏感標(biāo)志。本研究中過表達(dá)PTHrP小鼠血清和肝臟組織中ALT水平均明顯升高，提示PTHrP亦可促使MCD脂肪肝小鼠發(fā)生急性肝細(xì)胞損害。體外實(shí)驗(yàn)同樣顯示PTHrP可降低FFAs誘導(dǎo)的L02脂肪肝細(xì)胞的活性，結(jié)合其加重肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積的作用，提示PTHrP可增強(qiáng)FFAs對(duì)肝細(xì)胞的脂毒性。與高脂飲食不同，MCD脂肪性肝病小鼠體質(zhì)量呈下降趨勢(shì)，且體質(zhì)量下降速度可反映NAFLD 的嚴(yán)重程度。3 組小鼠中，AAV-PTHrP組小鼠體質(zhì)量下降最為明顯。對(duì)其進(jìn)行NAS評(píng)分，AAV-PTHrP組NAS評(píng)分同樣為3組小鼠中最高，且為NASH的可能性非常大。NASH的病理學(xué)特征是肝細(xì)胞脂肪變性同時(shí)伴有肝小葉炎癥和氣球樣變［24］。結(jié)合SAF評(píng)分，AAV-PTHrP組小鼠同時(shí)存在肝細(xì)胞脂肪變、小葉炎癥和氣球樣變，可診斷為NASH，而AAV-Vehicle組小鼠多僅為單純性脂肪肝。除了肝細(xì)胞脂肪變性、炎癥反應(yīng)和肝細(xì)胞氣球樣變，NASH還存在不同程度的肝纖維化［26］。與大多數(shù)慢性肝病一樣，NASH的持續(xù)肝損傷與肝纖維化的發(fā)生有關(guān)，肝臟瘢痕形成是肝臟對(duì)損傷的傷口愈合反應(yīng)的結(jié)果，包括沉積高密度細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，扭曲肝臟結(jié)構(gòu)并形成再生結(jié)節(jié)，最終導(dǎo)致肝硬化的形成。既往研究表明，PTHrP可激活肝星狀細(xì)胞［27］。而肝星狀細(xì)胞則是肝臟膠原纖維的主要來源。同樣地，本實(shí)驗(yàn)中小鼠肝纖維化評(píng)分和天狼星紅染色結(jié)果均顯示PTHrP可促進(jìn)MCD小鼠肝纖維化形成。上述結(jié)果提示PTHrP可加快MCD小鼠NASH進(jìn)展。

然而與大多數(shù)NAFLD不同，本研究中PTHrP降低了血漿中TG和FFAs濃度，且體質(zhì)量與血脂變化一致。如前所述，PTHrP最早發(fā)現(xiàn)于腫瘤患者［9］。近年來有研究表明PTHrP可促使脂肪酸及蛋白質(zhì)過度分解，誘導(dǎo)腫瘤惡液質(zhì)的形成［28］。骨來源的PTHrP 可增強(qiáng)小鼠的脂肪酸氧化及能量消耗，進(jìn)而引起一系列的代謝改變［29］。Mojgan等發(fā)現(xiàn)相當(dāng)比例的結(jié)直腸癌患者同時(shí)患有代謝綜合征［30］。此外，脂肪營(yíng)養(yǎng)不良存在包括肝脂肪變性等胰島素抵抗相關(guān)代謝并發(fā)癥的易感性［31］。而蛋白質(zhì)缺乏可導(dǎo)致載脂蛋白合成減少，肝細(xì)胞中脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)受抑制，肝臟組織中出現(xiàn)脂質(zhì)沉積［32］。因此，PTHrP可能參與了非肥胖型NAFLD的形成。

綜上所述，PTHrP 可促進(jìn)MCD 誘導(dǎo)的小鼠NAFLD發(fā)展。與此同時(shí)，PTHrP致小鼠體質(zhì)量減輕及血脂水平下降，提示PTHrP可能與非肥胖型NAFLD相關(guān)。此外，因其在骨質(zhì)代謝的作用，近年來PTHrP被應(yīng)用于治療骨質(zhì)疏松癥。對(duì)于骨質(zhì)疏松癥合并NAFLD患者，應(yīng)用PTHrP治療時(shí)應(yīng)注意肝臟病變情況。