植 曦，周俊豪，田 湖，周冉冉，黃振輝，劉存東

1南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院泌尿外科，廣東廣州 510630；2肇慶市第一人民醫(yī)院泌尿外科，廣東 肇慶526020

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)第2常見(jiàn)的惡性腫瘤，已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生威脅之一［1,2］。約25%的膀胱癌為肌層浸潤(rùn)性膀胱癌，約75%為非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌［3］。盡管非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌可以通過(guò)經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)等外科學(xué)方式進(jìn)行治療，但術(shù)后復(fù)發(fā)率高達(dá)70%，其中約20%進(jìn)展為肌層浸潤(rùn)性膀胱癌，最終導(dǎo)致遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后不良［4］。因此，了解膀胱癌侵襲轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的分子機(jī)制，探索新的治療靶點(diǎn)極具臨床意義和研究?jī)r(jià)值。

人矮小同源盒基因2（SHOX2）是人矮小同源盒基因的同源物［5］，主要參與脊椎動(dòng)物胚胎形成期的轉(zhuǎn)錄調(diào)控［6］。近年來(lái)，越來(lái)越多證據(jù)表明SHOX2在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演了重要角色。在肺癌中，SHOX2可以作為診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物［7-9］；在食管鱗狀細(xì)胞癌、胃腺癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌中，SHOX2可以促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移［10-12］；在肝癌中，高表達(dá)的SHOX2與術(shù)后復(fù)發(fā)密切相關(guān)［13］。然而，SHOX2在膀胱癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能和作用機(jī)制目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究分析了TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中SHOX2基因在膀胱癌與癌旁膀胱組織中的表達(dá)差異及其對(duì)膀胱癌預(yù)后的影響，利用基因集富集分析GSEA軟件對(duì)SHOX2的生物學(xué)功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，并通過(guò)功能缺失性及功能獲得性實(shí)驗(yàn)，在細(xì)胞水平觀察SHOX2對(duì)膀胱癌細(xì)胞遷移、侵襲能力和干細(xì)胞特性的影響。本研究探索SHOX2在膀胱癌細(xì)胞中對(duì)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的調(diào)控作用及其可能機(jī)制，為深入研究探討膀胱癌侵襲轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的機(jī)制提供重要的理論基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株、主要試劑和耗材

人膀胱癌細(xì)胞株T24（美國(guó)典型物保藏中心）。RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶（BI）；SHOX2 鼠單克隆抗體（Abcam）；Ecadherin兔多克隆抗體、Vimentin兔多克隆抗體、β-actin鼠單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體（proteintech）；基質(zhì)膠、Transwell小室、超低吸附六孔板（Corning）；人EGF、人bFGF（Peprotech）；B-27（Thermo Fisher）；人胰島素（Meilunbio）；總蛋白提取試劑盒、蛋白濃度測(cè)定試劑盒、蛋白上樣緩沖液、PVDF膜、ECL發(fā)光試劑盒、細(xì)胞培養(yǎng)皿、六孔板、PBS、甲醇、4%多聚甲醛、結(jié)晶紫、TBS、吐溫等（碧云天）。

1.2 膀胱癌細(xì)胞培養(yǎng)、SHOX2 shRNA及SHOX2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

1.2.1 膀胱癌細(xì)胞培養(yǎng) 膀胱癌細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2溫育箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 SHOX2 shRNA轉(zhuǎn)染 提前1 d將T24細(xì)胞鋪于6 cm培養(yǎng)皿，在37 ℃、5%CO2溫育箱中孵育過(guò)夜。待細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%，更換含有8～10 μg/mL polybrene的新鮮培養(yǎng)基，添加1 mL慢病毒液，在37 ℃、5%CO2溫育箱中孵育過(guò)夜。

每次實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)組：對(duì)照組（Scramble）、實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2；實(shí)驗(yàn)組1：shSHOX2-1：正義鏈為5'-CCGGgg accaatttcaccctggaacCTCGAGgttccagggtgaaattggtccTT TTTG-3'，反義鏈為5'-AATTCAAAAAggaccaatttcaccc tggaacCTCGAGgttccagggtgaaattggtcc-3'；實(shí) 驗(yàn) 組2：shSHOX2-2，正義鏈為5'-CCGGggatgcgaaagggatggag gaCTCGAGtcctccatccctttcgcatccTTTTTG-3'，反義鏈為5'-AATTCAAAAAggatgcgaaagggatggaggaCTCGAGtc ctccatccctttcgcatcc-3'。質(zhì)粒載體為PLKO.1。

轉(zhuǎn)染后24 h更換為新鮮培養(yǎng)基，向培養(yǎng)基中添加終濃度為3.5 μg/mL的嘌呤霉素進(jìn)行篩選，藥篩24 h后更換新鮮培養(yǎng)基，提取各組細(xì)胞的蛋白質(zhì)，檢測(cè)各項(xiàng)相關(guān)指標(biāo)。

1.2.3 SHOX2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 提前1 d將T24細(xì)胞鋪于6 cm培養(yǎng)皿，在37 ℃、5%CO2溫育箱中孵育過(guò)夜。待細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%，將pc-DNA4-SFB-SHOX2和PEF-IRES-rtTA 1∶1 比例用轉(zhuǎn)染試劑PEI 共轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，每次實(shí)驗(yàn)設(shè)2 個(gè)組：對(duì)照組（Vector）、實(shí)驗(yàn)組（p-SHOX2），轉(zhuǎn)染12 h后更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，36 h后，終濃度為3.5 μg/mL的嘌呤霉素藥篩24 h后更換新鮮培養(yǎng)基，提取各組細(xì)胞的蛋白質(zhì)，檢測(cè)各項(xiàng)相關(guān)指標(biāo)。

1.3 Western blot

細(xì)胞總蛋白通過(guò)總蛋白提取試劑盒提取，加入蛋白上樣緩沖液，95 ℃下變性15 min，并保存于-20 ℃。凝膠電泳由10%SDS電泳液分離蛋白、濕法將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜；5%BSA室溫封閉1 h；加入一抗4 ℃孵育過(guò)夜；TBST 液洗膜3 次，洗5 min/次；加入二抗室溫孵育1 h；TBST液洗膜4次，洗5 min/次；ECL發(fā)光試劑盒顯影；GeneGnome XRQ化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)獲取圖像。

1.4 劃痕實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞以4×105/孔接種于6孔板，培養(yǎng)細(xì)胞使匯合度接近100%，用100 μL槍頭在6孔板內(nèi)畫(huà)1條寬度均勻的直線，使兩側(cè)細(xì)胞不相連接，PBS洗滌清除漂浮細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)基，放入37 ℃、5%CO2溫育箱中培養(yǎng)，分別于0、24 h在同一部位用倒置顯微鏡觀察并拍照，計(jì)算劃痕愈合率，劃痕愈合率=（0 h劃痕面積-24 h劃痕面積）/0 h劃痕面積，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)

用基質(zhì)膠包被Transwell小室底部膜，于4 ℃風(fēng)干，再水化基底膜。細(xì)胞提前用無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基饑餓處理12 h后，收集細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，將200 μL含1×105細(xì)胞數(shù)的懸液加入上室，下室加入500 μL含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，放入37 ℃、5%CO2溫育箱中培養(yǎng)24 h，取出小室，棄上室培養(yǎng)基，用干棉簽輕拭去上室細(xì)胞，4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，PBS洗滌，在顯微鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野拍照計(jì)數(shù)。

2016年調(diào)查顯示，對(duì)收入不滿意的各族裔比例都在10%左右，滿意度最高的是日裔醫(yī)生(72%)，其次是白人(59%)和菲裔(57%)。2017年57%的男性醫(yī)生和53%的女性醫(yī)生表示他們收入足夠支撐他們的目標(biāo)(2016年這個(gè)比例是52% vs.47%)。

1.6 懸浮成球?qū)嶒?yàn)

將細(xì)胞分散接種于超低吸附六孔板中（2000細(xì)胞/孔），使用無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基，其中添加20 ng/mL人EGF、20 ng/mL人bFGF、5 ng/mL胰島素、2%B-27。培養(yǎng)1～2周后，顯微鏡下觀察并計(jì)算腫瘤球數(shù)目。

1.7 克隆形成實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞分散接種于6孔板中（1000細(xì)胞/孔），培養(yǎng)1～2周。PBS洗滌后，4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，PBS洗滌。直接觀察，計(jì)算克隆數(shù)。

1.8 生物信息學(xué)分析

利用GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn/）網(wǎng)站對(duì)TCGA膀胱癌數(shù)據(jù)集進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析；使用基因集富集分析（GSEA,http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/index.jsp）軟件分析TCGA 膀胱癌數(shù)據(jù)集。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較用兩樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖片數(shù)據(jù)的采集及處理用Graphpad Prism5和Image J軟件進(jìn)行。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 SHOX2基因在膀胱癌組織中高表達(dá)并與不良預(yù)后相關(guān)

TCGA膀胱癌標(biāo)本數(shù)據(jù)分析顯示，與癌旁膀胱組織相比，SHOX2基因在膀胱癌組織中的表達(dá)量升高（P=0.01，圖1A），此趨勢(shì)在配對(duì)的膀胱癌組織中更為明顯（P=0.001，圖1B）。GEPIA網(wǎng)站Kaplan-Meier生存分析顯示，SHOX2基因表達(dá)水平與膀胱癌患者總體生存率呈負(fù)相關(guān)（P=0.01，圖1C）。

圖1 SHOX2基因在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)膀胱癌組織中高表達(dá)并與不良預(yù)后相關(guān)Fig.1 SHOX2 gene expression was significantly elevated in bladder cancer tissues based on TCGA-BLCA datasets and was associated with poor survival of the patients.A:Relative SHOX2 mRNA expression in bladder cancer tissues(n=408)and adjacent bladder tissues(n=19,*P=0.01).B:Relative SHOX2 mRNA expression in bladder cancer tissues(n=18)and paired adjacent tissues (n=18,**P=0.001).C:Kaplan-Meier survival analysis of overall survival of patients with bladder cancer with high and low SHOX2 expression level using GEPIA(P=0.01).

2.2 SHOX2基因表達(dá)水平與EMT及腫瘤干細(xì)胞特性呈正相關(guān)

SHOX2基因表達(dá)水平與EMT（P=0.01，P=0.03，圖2A）及腫瘤干細(xì)胞相關(guān)的基因集呈正相關(guān)（P=0.006，P=0.008，圖2B）。

圖2 SHOX2基因在GSEA數(shù)據(jù)庫(kù)中與膀胱癌的EMT及干細(xì)胞特性呈正相關(guān)Fig.2 SHOX2 gene expression is positively correlated with EMT-related and stemness-related gene signatures of bladder cancer based on GSEA database.A:Data from GSEA indicate significant correlations between SHOX2 gene expression and EMT-related gene signatures of bladder cancer (HALLMARK_EPITHELIAL_MESENCHYMAL_TRANSITION, P=0.002;GO_EPITHELIAL_TO_MESENCHYMAL_TRANSITION,P=0.03).B:SHOX2 gene expression was significantly correlated with stemness-related gene signatures of bladder cancer(BOQUEST_STEM_CELL_UP,P=0.006;LIM_MAMMARY_STEM_CELL_UP,P=0.008).

2.3 構(gòu)建SHOX2敲低、過(guò)表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞株

Western blot分析顯示，在轉(zhuǎn)染SHOX2 shRNA的膀胱癌細(xì)胞T24 中SHOX2 蛋白表達(dá)水平顯著降低（shSHOX2-1，P=0.004；shSHOX2-2，P=0.03，圖3A）；而轉(zhuǎn)染SHOX2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的T24細(xì)胞中，SHOX2的蛋白表達(dá)水平顯著升高（P=0.007，圖3B）。

圖3 SHOX2 shRNA及SHOX2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞后SHOX2蛋白的表達(dá)水平Fig.3 Expression of SHOX2 in T24 cells after transfection with SHOX2 shRNA or SHOX2 lentivirus.A:Effect of SHOX2 shRNA and scramble shRNA on SHOX2 expression in T24 cells detected by Western blotting (**P=0.004,*P=0.03 vs scramble).B:Effect of SHOX2 lentivirus and vector control on SHOX2 expression in T24 cells detected by Western blotting(**P=0.007).

2.4 SHOX2促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的遷移、侵襲

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，shSHOX2敲低組細(xì)胞劃痕面積愈合百分比與對(duì)照組Scramble 相比明顯減少（shSHOX2-1，P＜0.001；shSHOX2-2，P=0.02，圖4A）；過(guò)表達(dá)SHOX2 組細(xì)胞劃痕面積愈合百分比與對(duì)照組Vector相比明顯增加（P＜0.001，圖4B）。

Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，shSHOX2敲低組細(xì)胞穿透至下層的數(shù)量較Scramble 組明顯減少（shSHOX2-1，P=0.002；shSHOX2-2，P=0.003，圖4C）；過(guò)表達(dá)SHOX2組細(xì)胞穿透至下層的數(shù)量較Vector組明顯增加（P=0.004，圖4D）。

圖4 SHOX2促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的遷移、侵襲Fig.4 SHOX2 promotes migration and invasion of bladder cancer cells.A:Wound healing assay of T24 cells transfected with SHOX2 shRNA or scramble shRNA (Original magnification:×40) and quantitative analysis (***P＜0.001,**P=0.02 vs scramble).B:Wound healing assay of T24 cells transfected with SHOX2 lentivirus or the control vector (×40) and quantitative analysis (＊＊＊P＜0.001).C:Transwell assay in T24 cells transfected with SHOX2 shRNA or scramble shRNA(×200) and quantitative analysis (shSHOX2-1,**P=0.002 vs scramble;shSHOX2-2,**P=0.003 vs scramble).D:Transwell assay ofn T24 cells transfected with SHOX2 lentivirus or the control vector(×200)and quantitative analysis(**P=0.004).

2.5 SHOX2增強(qiáng)膀胱癌細(xì)胞的干細(xì)胞特性

懸浮成球?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，shSHOX2敲低組細(xì)胞形成腫瘤球的數(shù)目與對(duì)照組Scramble 相比減少（shSHOX2-1，P=0.002；shSHOX2-2，P=0.007，圖5A）；過(guò)表達(dá)SHOX2 組細(xì)胞形成腫瘤球的數(shù)目與對(duì)照組Vector相比增加（P=0.002，圖5B）。

克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，shSHOX2敲低組細(xì)胞克隆形成數(shù)與對(duì)照組Scramble相比減少（shSHOX2-1，P＜0.001；shSHOX2-2，P＜0.001，圖5C）；過(guò)表達(dá)SHOX2組細(xì)胞克隆形成數(shù)與對(duì)照組Vector相比增加（P＜0.001，圖5D）。

圖5 SHOX2增強(qiáng)膀胱癌細(xì)胞的干細(xì)胞特性Fig.5 SHOX2 enhances cancer stem cell-like characteristics of bladder cancer cells.A:Tumorsphere formation assay of T24 cells transfected with SHOX2 shRNA or scramble shRNA(×100)(shSHOX2-1,**P=0.002 vs scramble;shSHOX2-2,**P=0.007 vs scramble);B:Tumorsphere formation assay of T24 cells transfected with SHOX2 lentivirus or the control vector (×100) (**P=0.002).C:Colony formation assay of T24 cells transfected with SHOX2 shRNA or scramble shRNA(***P＜0.001 vs scramble);D:Colony formation assay of T24 cells transfected with SHOX2 lentivirus or the control vector(***P＜0.001 vs vector).

2.6 SHOX2通過(guò)TGF-β信號(hào)通路誘導(dǎo)EMT

在光鏡下觀察膀胱癌細(xì)胞T24的形態(tài)變化，結(jié)果顯示抑制SHOX2表達(dá)可使細(xì)胞呈現(xiàn)連接緊密的卵圓形的上皮樣形態(tài)（圖6A），而SHOX2過(guò)表達(dá)可使細(xì)胞呈現(xiàn)連接松散的長(zhǎng)條形的間充質(zhì)樣形態(tài)（圖6B）。

Western blot結(jié)果顯示，抑制SHOX2的表達(dá)可使膀胱癌細(xì)胞T24 中的EMT 標(biāo)志分子E-cadherin 蛋白（shSHOX2-1，P＜0.001；shSHOX2-2，P＜0.001，圖6C）表達(dá)水平升高、Vimentin 蛋白（shSHOX2-1，P＜0.001；shSHOX2-2，P=0.01，圖6C）表達(dá)水平降低，而過(guò)表達(dá)SHOX2的膀胱癌細(xì)胞中Vimentin蛋白（P=0.04，圖6D）表達(dá)水平升高。此外，抑制SHOX2的表達(dá)可使T24細(xì)胞中的TGF-β信號(hào)通路重要組件TβR-I蛋白（shSHOX2-1，P=0.03；shSHOX2-2，P=0.02，圖6C）表達(dá)水平降低，而過(guò)表達(dá)SHOX2的T24細(xì)胞中TβR-I蛋白（P=0.003，圖6D）表達(dá)水平升高。

圖6 SHOX2通過(guò)TGF-β信號(hào)通路誘導(dǎo)EMTFig.6 SHOX2 induces EMT through TGF-β signaling pathway.A:Morphology of T24 cells transfected with SHOX2 shRNA or scramble shRNA (× 200);B:Morphology of T24 cells transfected with SHOX2 lentivirus or the control vector (Original magnification:×200);C:Effect of SHOX2 shRNA and scramble shRNA on E-cadherin(***P＜0.001),vimentin(***P＜0.001,*P=0.01)and TβR-I(shSHOX2-1,*P=0.03;shSHOX2-2,*P=0.02)expressions in T24 cells detected by Western blotting;D:Effect of SHOX2 lentivirus and the control vector on vimentin(*P=0.04 vs vector)and TβR-I(**P=0.003 vs vector)expression in T24 cells detected by Western blotting.

3 討論

SHOX2最早在肺癌中被證實(shí)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，SHOX2的表達(dá)量在肺癌早期即可發(fā)生變化，多項(xiàng)研究表明SHOX2啟動(dòng)子甲基化可作為肺癌診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物［7-9］。有研究在原發(fā)性肝癌臨床手術(shù)標(biāo)本中對(duì)比分析SHOX2表達(dá)量和患者術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)SHOX2與肝癌的術(shù)后復(fù)發(fā)密切相關(guān)［13］。近年來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)表明SHOX2可以通過(guò)促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移來(lái)影響腫瘤的預(yù)后［10-12］。本研究通過(guò)分析TCGA膀胱癌標(biāo)本數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)SHOX2基因在膀胱癌組織中高表達(dá)，并與膀胱癌患者臨床預(yù)后不良密切相關(guān)，這支持了SHOX2 在膀胱癌中的致癌作用。同時(shí)，我們通過(guò)對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中膀胱癌樣本進(jìn)行GSEA富集分析，預(yù)測(cè)SHOX2可能的生物學(xué)功能。結(jié)果顯示，SHOX2基因表達(dá)水平與上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）及腫瘤干細(xì)胞特性呈正相關(guān)。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證SHOX2在膀胱癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能與作用機(jī)制，我們采用SHOX2 shRNA 及SHOX2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞T24，構(gòu)建SHOX2敲低、過(guò)表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞株。劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，下調(diào)SHOX2的表達(dá)后，T24細(xì)胞的遷移、侵襲能力明顯下降，而上調(diào)SHOX2的表達(dá)則顯著增強(qiáng)T24細(xì)胞的遷移、侵襲能力，這表明SHOX2可以促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的遷移及侵襲。EMT在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用［14,15］。EMT是指具有極性的上皮樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化為運(yùn)動(dòng)能力較強(qiáng)的間充質(zhì)樣細(xì)胞，從而使細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)中的移動(dòng)能力增強(qiáng)［16,17］，EMT對(duì)膀胱癌的侵襲轉(zhuǎn)移起著極為重要的作用［18,19］。有研究證實(shí)了SHOX2在食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中可以促進(jìn)EMT的發(fā)生［10］，本研究也發(fā)現(xiàn)，在膀胱癌細(xì)胞T24中抑制SHOX2的表達(dá)可使細(xì)胞呈現(xiàn)上皮樣形態(tài)，且EMT標(biāo)志分子E-cadherin蛋白表達(dá)水平升高、Vimentin蛋白表達(dá)水平降低；而過(guò)表達(dá)SHOX2 可使T24 細(xì)胞呈現(xiàn)間充質(zhì)樣形態(tài)，且Vimentin蛋白表達(dá)水平升高，說(shuō)明SHOX2在膀胱癌細(xì)胞中可以促進(jìn)EMT，這與我們的生物信息學(xué)分析結(jié)果一致。

腫瘤干細(xì)胞是指具有自我更新和多向分化潛能的腫瘤細(xì)胞亞群［20,21］，干細(xì)胞特性的維持與膀胱癌的侵襲轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)密切相關(guān)［22-24］。越來(lái)越多的證據(jù)表明，EMT過(guò)程可以使腫瘤干細(xì)胞富集，從而使腫瘤細(xì)胞的干細(xì)胞特性增強(qiáng)［25,26］。有研究發(fā)現(xiàn)，EMT也可以增強(qiáng)膀胱癌細(xì)胞的干細(xì)胞特性［27,28］。本研究通過(guò)懸浮成球?qū)嶒?yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)下調(diào)SHOX2的表達(dá)后，T24細(xì)胞的成球數(shù)和克隆形成數(shù)均下降，而上調(diào)SHOX2的表達(dá)則可顯著增加T24 細(xì)胞的成球數(shù)和克隆形成數(shù)，說(shuō)明SHOX2確實(shí)可以在一定程度上增強(qiáng)膀胱癌細(xì)胞的干細(xì)胞特性，與生物信息學(xué)分析結(jié)果一致。

TGF-β信號(hào)通路在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞EMT過(guò)程中起重要作用［29-31］，許多研究證明TGF-β信號(hào)通路可以促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞EMT［32-33］。有研究發(fā)現(xiàn)SHOX2在乳腺癌細(xì)胞中可以通過(guò)調(diào)控TGF-β信號(hào)通路中的重要組件TβR-I來(lái)誘導(dǎo)EMT過(guò)程［34］。本研究發(fā)現(xiàn)，在膀胱癌細(xì)胞T24中抑制SHOX2的表達(dá)可使TβR-I蛋白表達(dá)水平降低，而過(guò)表達(dá)SHOX2可使T24細(xì)胞中的TβR-I蛋白表達(dá)水平升高，說(shuō)明SHOX2可能參與調(diào)控TGF-β信號(hào)通路。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究認(rèn)為SHOX2可能通過(guò)激活TGF-β信號(hào)通路，參與調(diào)控EMT過(guò)程，進(jìn)而增強(qiáng)膀胱癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力和干細(xì)胞特性。

綜上所述，本研究首先通過(guò)生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)SHOX2基因在膀胱癌組織中高表達(dá)且與膀胱癌患者臨床預(yù)后不良相關(guān)，其生物學(xué)功能與EMT和腫瘤干細(xì)胞特性密切相關(guān)。通過(guò)功能缺失性及功能獲得性實(shí)驗(yàn)證實(shí)SHOX2能增強(qiáng)膀胱癌細(xì)胞遷移、侵襲能力及腫瘤干細(xì)胞特性，其作用機(jī)制可能與TGF-β信號(hào)通路參與調(diào)控的EMT有關(guān)。這表明針對(duì)SHOX2靶點(diǎn)的基因治療可能成為減少膀胱癌侵襲轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的潛在治療手段，但SHOX2是如何激活TGF-β信號(hào)通路，最終誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞EMT，值得進(jìn)一步研究。