楊富蘭

由于胰腺癌的早期癥狀不明顯，因此絕大多數(shù)患者在診斷時(shí)已處于晚期，胰腺癌的高轉(zhuǎn)移潛力是影響胰腺癌預(yù)后不良的重要因素，因此，對(duì)胰腺癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制進(jìn)行分析是開發(fā)新治療方法的基礎(chǔ)[1]。微小RNA(microRNA，miRNA)在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用，研究顯示miR-625可通過靶向抑制其靶基因的表達(dá)在乳腺癌中發(fā)揮抑癌作用[2]。長非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是一類長度>200個(gè)核苷酸、不具有蛋白質(zhì)翻譯功能的長鏈RNA。LncRNA可以通過靶向miRNA調(diào)節(jié)信使RNA(message RNA，mRNA)降解和翻譯[3]。LINC01133是新發(fā)現(xiàn)的一種具有促癌作用的LncRNA，在肺癌中，LINC01133水平升高并且可能與患者不良預(yù)后有關(guān)，提示LINC01133具有促進(jìn)腫瘤發(fā)展的作用[4]。G1/S-特異性周期蛋白-D1(Cyclin D1，CCND1)是調(diào)控細(xì)胞增殖的重要蛋白，有研究結(jié)果也顯示CCND1具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的作用[5]。本文分析LINC01133通過靶向miR-625調(diào)控CCND1促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞遷移、侵襲的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器 人胰腺癌細(xì)胞系SW1990(ATCC公司，美國)。DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen公司，美國)。LINC01133和CCND1過表達(dá)質(zhì)粒和miR-625類似物(mimic)以及相應(yīng)的陰性對(duì)照(negative control，NC)(Thermo Fisher公司，美國)。Lipofectamine 2000(Invitrogen公司，美國)。雙熒光素酶報(bào)告試劑盒和相應(yīng)的1000 System熒光檢測儀(Promega公司，美國)。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(Cell Counting Kit-8，CCK-8)試劑盒(Beyotime生物技術(shù)研究所，中國)。Transwell小室(BD Biosciences公司，美國)。PCR引物由Genewiz公司(中國)設(shè)計(jì)和合成。Trizol試劑(Invitrogen公司，美國)。逆轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒和SYBR Green PCR Master Mix qPCR試劑盒(Roche公司，瑞士)。ABI 7500 PCR檢測系統(tǒng)(Life technology公司，美國)。RIPA裂解緩沖液(Beyotime公司，中國)。BCA蛋白測定試劑盒和ECL試劑盒(北京Applygen公司，中國)。CCND1、GAPDH抗體和二抗(Abcam公司，美國)。PVDF膜(Bio-Rad公司，美國)。

1.2 生物信息學(xué)分析 通過工具網(wǎng)站GEPIA分析TCGA數(shù)據(jù)庫的宮頸癌患者LINC01133水平與宮頸癌進(jìn)展情況和與CCND1水平之間的關(guān)系。然后分析LINC01133與患者預(yù)后間的關(guān)系。然后預(yù)測LINC01133靶向miR-625和miR-625靶向CCND1的結(jié)合位點(diǎn)。

1.3 方法

1.3.1 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)：將細(xì)胞分為NC組和mimic組，并分別通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NC-pMIR-REPORT和miR-625 mimic-pMIR-REPORT。在驗(yàn)證miR-625靶向CCND1時(shí)，分別將野生型的CCND1(CCND1-wt)或突變的CCND1(CCND1-mut)克隆到pMIR-REPORT熒光素酶載體中。在驗(yàn)證LINC01133時(shí)靶向miR-625時(shí)，分別將LINC01133-wt和LINC01133-mut克隆到pMIR-REPORT熒光素酶載體中。將SW1990細(xì)胞接種在6孔板中，然后使用Lipofectamine 2000分別將克隆和突變的序列轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。使用熒光素酶報(bào)告檢測儀評(píng)估熒光素酶活性。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組與轉(zhuǎn)染：將SW1990細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃，5% CO2，相對(duì)濕度100%。將細(xì)胞分為4組，即對(duì)照組、LINC01133組、LINC01133+mimic組和mimic組。使用Lipofectamine 2000試劑盒進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，其中mimic組和LINC01133+mimic組組通過轉(zhuǎn)染miR-625 mimic質(zhì)粒以過表達(dá)miR-625，mimic+LINC01133組和LINC01133組轉(zhuǎn)染LINC01133質(zhì)粒過表達(dá)CCND1。對(duì)照組轉(zhuǎn)染兩種NC質(zhì)粒，在轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 qPCR檢測LINC01133、miR-625和CCND1 mRNA：通過qPCR檢測LINC01133、miR-625和CCND1 mRNA水平。通過Trizol獲得細(xì)胞中總RNA，然后檢測RNA的純度和濃度。使用cDNA試劑盒將1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA(42℃下60 min，70℃下5 min，然后4℃保存)。使用SYBR Green PCR Master Mix進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)(在95℃/10 min，40個(gè)循環(huán)，94℃/15 s，60℃/1 min,60℃/1 min，4℃保存)。GAPDH作為mRNA和LncRNA的內(nèi)參，U6作為miRNA的內(nèi)參，通過比較循環(huán)閾值(ΔΔCt)用于分析RNA的表達(dá)。

1.3.4 Western blot：通過Western blot檢測CCND1 蛋白的表達(dá)水平。在液氮下將細(xì)胞研磨，在液氮保護(hù)下使用RIPA裂解緩沖液裂解，并使用BCA蛋白測定試劑盒測量總蛋白含量。然后使用SDS-PAGE分離等量的總蛋白(120 V下電泳90 min)，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(50 V,120 min)，在含有5%脫脂牛奶的封閉溶液中封閉。然后將PDVF膜與一抗(1∶1 000稀釋)在4℃孵育過夜，然后加入1∶5 000稀釋的HRP偶聯(lián)二抗在室溫下孵育1 h。使用ECL試劑盒可視化蛋白條帶，并使用ImagePD軟件使用GAPDH作為內(nèi)參對(duì)蛋白條帶的灰度進(jìn)行定量。

1.3.5 CCK-8檢測細(xì)胞活力：將2×104個(gè)細(xì)胞接種在96孔板(每孔100 μl)，在培養(yǎng)第48 h加入10 μl CCK-8試劑并在37℃下培養(yǎng)，通過酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光度計(jì)算相對(duì)細(xì)胞活力。

1.3.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移：將4組細(xì)胞消化后分別接種在6孔板中，每孔1×106個(gè)，然后在37℃，5% CO2，相對(duì)濕度100%條件下培養(yǎng)直至90%左右匯合。然后使用200 μl移液槍頭從上至下做劃痕，將劃掉的細(xì)胞洗去。然后在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h。使用倒置顯微鏡觀察并獲得圖像，測量細(xì)胞前緣移動(dòng)距離的百分比(=兩端前緣移動(dòng)距離/劃痕寬度×100%)。

1.3.7 Transwell檢測細(xì)胞侵襲：在Transwell小室的上室加入基質(zhì)膠，底室加入完全培養(yǎng)基，然后將3×104個(gè)細(xì)胞加入至上室培養(yǎng)48 h。48 h后洗去未侵入底室的細(xì)胞。然后將細(xì)胞使用20%甲醇固定，并用0.2%結(jié)晶紫染色。在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)每個(gè)視野侵入底部室的細(xì)胞數(shù)目。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)分析結(jié)果 TCGA數(shù)據(jù)庫中，胰腺癌患者的LINC01133水平顯著高于正常膀胱組織(P<0.05)。并且高水平的LINC01133與更低的生存率和無進(jìn)展生存期有關(guān)(P<0.05)。見圖1。

2.2 LINC01133直接靶向miR-625 通過雙熒光霉素實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-625 mimic和LINC01133-wt的細(xì)胞的熒光酶素活性顯著降低(P<0.05)。見圖2，表1。

表1 LINC01133直接靶向miR-625的雙熒光素酶報(bào)告結(jié)果(相對(duì)熒光強(qiáng)度)

2.3 4組細(xì)胞中LINC01133和miR-625水平比較 LINC01133組和LINC01133+mimic組LINC01133水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，mimic組的miR-625水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。LINC01133組miR-625水平顯著低于對(duì)照組，LINC01133+mimic組的miR-625水平顯著高于LICN01133組(P<0.05)。miR-625可逆轉(zhuǎn)LINC01133對(duì)miR-625的抑制作用。見表2。

表2 4組細(xì)胞中LINC01133和miR-625水平比較

2.4 4組細(xì)胞活力比較 與對(duì)照組[(100.00±2.45)%]比較，LINC01133組的細(xì)胞活力[(127.69±3.78)%]顯著升高(P<0.05)，mimic組的細(xì)胞活力[(80.32±2.06)%]顯著降低(P<0.05)，LINC01133+mimic組的細(xì)胞活力顯著低于LINC01133組[(102.54±2.55)%](P<0.05)。

2.5 4組細(xì)胞遷移能力比較 LINC01133組的細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，mimic組的細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，LINC01133+mimic組的細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著低于LINC01133組(P<0.05)。見表3，圖3、4。

圖3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測4組細(xì)胞遷移能力

表3 4組細(xì)胞遷移和侵襲能力比較

2.6 miR-625直接靶向抑制CCND1 通過雙熒光霉素實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-625 mimic和CCND1-wt的細(xì)胞的熒光酶素活性顯著降低(P<0.05)。并且mimic組的CCND1 mRNA和蛋白的水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。見表4，圖5、6。

圖5 miR-625直接靶向CCND1的結(jié)合位點(diǎn)

圖6 Western blot檢測CCND1蛋白的表達(dá)

表4 miR-625直接靶向CCND1的雙熒光素酶報(bào)告結(jié)果(相對(duì)熒光強(qiáng)度)

2.7 4組CCND1 mRNA和蛋白水平比較 LINC01133組的CCND1 mRNA和蛋白水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，mimic組的CCND1 mRNA和蛋白水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，LINC01133+mimic組的CCND1 mRNA和蛋白水平顯著低于LINC01133組(P<0.05)。見表5，圖7。

圖7 Western blot檢測CCND1蛋白的表達(dá)

表5 4組CCND1 mRNA和蛋白水平比較

3 討論

2018年的一項(xiàng)全球性的癌癥統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，2017年胰腺癌的新發(fā)病例458 918例，占所有腫瘤的2.5%，2017年死于胰腺癌的患者共432 242例，占所有腫瘤的4.5%[6]。胰腺癌為臨床上常見的消化道腫瘤，具有惡性高、預(yù)后差的特點(diǎn)，胰腺癌患者5年的生存率僅10%左右[7]。內(nèi)窺鏡超聲檢查/磁共振成像檢查和計(jì)算機(jī)斷層掃描是檢測胰腺癌的常用手段。胰腺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致預(yù)后不佳和患者死亡的主要因素，探究胰腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的機(jī)制具有重要意義。

miRNA在腫瘤中的作用被廣泛揭示，miRNA可通過堿基配對(duì)的方式直接靶向靶基因的mRNA的3’端的非翻譯區(qū)域，并引起mRNA的降解和翻譯抑制，從而轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)行為[8]。而miRNA的功能又受到LncRNA的靶向調(diào)控，LncRNA可以通過競爭內(nèi)源性RNA的方式作為“海綿”“吸附”miRNA，從而抑制miRNA的生物學(xué)功能，從而調(diào)節(jié)miRNA在mRNA降解和翻譯中的作用[9]。LncRNA通過靶向miRNA調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)也是調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞發(fā)生和發(fā)展的重要機(jī)制之一。LINC01133是一種新發(fā)現(xiàn)的與腫瘤相關(guān)的LncRNA，Zeng等[10]研究顯示LINC01133可作為“海綿”吸附miR-422a并促進(jìn)骨肉瘤的進(jìn)展。Zheng等[11]研究顯示在肝細(xì)胞癌中，LINC01133可通過激活PI3K/AKT通路促進(jìn)細(xì)胞惡性增殖。并且LINC01133會(huì)通過靶向miR-4784促進(jìn)其靶基因AHDC1的表達(dá)，從而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[12]。也有研究顯示在結(jié)直腸癌和乳腺癌等中，LINC01133具有抑癌作用[13,14]。本研究中，我們首先通過生物信息學(xué)分析了LINC01133在胰腺癌中的表達(dá)特點(diǎn)，結(jié)果顯示其顯著高于正常膀胱組織，并且高水平的LINC01133與更低的生存率和無進(jìn)展生存期有關(guān)。并且進(jìn)一步的研究結(jié)果也顯示過表達(dá)LINC01133促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的活力、遷移和侵襲的能力。這說明在胰腺癌中，LINC01133具有促進(jìn)胰腺癌進(jìn)展的作用。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)LINC01133直接靶向miR-625，并且miR-625直接靶向抑制CCND1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平。此外，通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了過表達(dá)LINC01133抑制miR-625的水平并上調(diào)CCND1 mRNA和蛋白的表達(dá)，并且過表達(dá)miR-625會(huì)阻斷LINC01133對(duì)miR-625的抑制作用和對(duì)CCND1的促進(jìn)作用，這提示在胰腺癌細(xì)胞中，存在LINC01133/miR-625/CCND1調(diào)節(jié)途徑。并且進(jìn)一步的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示了miR-625抑制細(xì)胞活力、遷移和侵襲，并且阻斷了LINC01133對(duì)細(xì)胞生長、遷移和侵襲的促進(jìn)作用。Wang等[15]研究顯示下調(diào)miR-625會(huì)通過靶向促進(jìn)SOX2的表達(dá)促進(jìn)食道癌細(xì)胞的增殖和侵襲。Gong等[16]發(fā)現(xiàn)miR-625可通過靶向抑制ALDH1A1逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞的多藥耐藥性。并且miR-625的作用受到LncRNA的靶向調(diào)控[17]。CCND1不但具有調(diào)控細(xì)胞周期和細(xì)胞生長的做用，還具有促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的作用[18,19]，說明LINC01133促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的機(jī)制可能通過靶向調(diào)節(jié)miR-625/CCND1實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，在胰腺癌中，LINC01133具有促癌作用，并且LINC01133可能通過靶向miR-625促進(jìn)CCND1的表達(dá)水平，從而促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞生長、遷移和侵襲。