孫宇寧，宋 婕，李曉娜，陳維毅，賀 瑞，楊繼忠，姚 蔚

(1.太原理工大學 生物醫(yī)學工程學院，太原 030024；2.山西省眼科醫(yī)院 a.準分子激光室，b.角膜病科，太原 030002；3.山西醫(yī)科大學 口腔醫(yī)學院，太原 030001)

圓錐角膜(Keratoconus)是一種角膜擴張性疾病，其主要特征是角膜中央變薄向前突出呈圓錐形，進而導致不規(guī)則散光和近視，影響視覺。圓錐角膜的發(fā)生機制尚不清楚。膠原是角膜細胞外基質的主要成分，承擔角膜的主要抗張強度。圓錐角膜中膠原含量和結構發(fā)生改變，角膜生物力學性能降低[1]。膠原蛋白的合成與降解異常是圓錐角膜發(fā)生的可能機制之一。與正常角膜相比，圓錐角膜患者基質層中膠原蛋白含量顯著降低，膠原降解相關蛋白基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)表達增加[1-2]。RNA測序和多重質譜分析結果顯示圓錐角膜中膠原合成、成熟以及分解代謝途徑發(fā)生變化，膠原合成基因的表達降低[3-5]。

圓錐角膜通常被認為是一種非炎性疾病，但研究發(fā)現(xiàn)圓錐角膜患者淚液中促炎因子，如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)、白介素(Interleukin，IL)-1/-4/-5/-6/-17、細胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)等均顯著高于正常人[5-9]，表明炎癥反應參與了圓錐角膜的發(fā)生。NISHTALA et al[8]推測炎癥是圓錐角膜基質畸形的決定性因素。炎性因子在角膜組織修復機制中發(fā)揮著重要的作用，角膜基質細胞中炎性因子釋放增加可能導致基質降解和基質細胞凋亡[10-11]，破壞角膜組織的結構和微環(huán)境，使角膜組織穩(wěn)態(tài)失衡，促進圓錐角膜發(fā)生發(fā)展。

IL-8又稱趨化因子CXCL8，可調節(jié)細胞遷移、細胞黏附以及血管生成等生理過程[12-13]。IL-8介導趨化反應和炎癥反應，參與角膜炎、角膜潰瘍、角膜瘢痕等多種眼部疾病的發(fā)生[14-15]。GHOSH et al[16]發(fā)現(xiàn)IL-8在圓錐角膜患者淚液中有較高含量，但其作用的分子機制還需進一步研究。

本研究通過siRNA干擾正常角膜成纖維細胞中IL-8的表達，采用實時熒光定量PCR、Western blot、ELISA、明膠酶譜等方法分析IL-8對膠原合成和降解的影響，探討IL-8調節(jié)角膜成纖維細胞膠原代謝的信號途徑，為揭示圓錐角膜的發(fā)病機制提供參考。

1 實驗材料和方法

1.1 角膜成纖維細胞的提取及培養(yǎng)

從山西省眼科醫(yī)院獲得角膜移植手術后廢棄的正常人角膜組織，經0.5 mg/mL Ⅱ型膠原酶消化后，離心，棄上清，加入成纖維細胞培養(yǎng)基(fibroblast medium，F(xiàn)M)(含體積分數(shù)2%胎牛血清，體積分數(shù)1%成纖維細胞生長因子，體積分數(shù)1%青霉素/鏈霉素)(ScienCell，USA)，于37 ℃、CO2體積分數(shù)5%的細胞培養(yǎng)箱內進行培養(yǎng)，當細胞融合率達到90%時進行傳代及凍存，傳代3～4次的細胞用于后續(xù)siRNA轉染。

1.2 siRNA序列的設計及細胞轉染

設計并合成針對人IL-8基因(Genbank NO.NM_000584)編碼區(qū)的3對靶向siRNA序列和對照序列(無特異性靶序列)(Gene Pharma，上海)，序列如表1所示。將提取的正常人角膜成纖維細胞以105個細胞/孔的密度接種于24孔培養(yǎng)板上，當細胞融合率達到70%～90%時，采用脂質體(Lip-2000，Invitrogen)轉染法將siRNA導入角膜成纖維細胞，siRNA最終濃度為80 nmol/L.轉染后36 h收集細胞用于基因表達分析，轉染72 h后收集細胞和上清，進行Western blot、ELISA、明膠酶譜等蛋白水平檢測。

表1 siRNA序列Table 1 siRNA sequences

1.3 實時熒光定量PCR(qPCR)檢測基因表達

收集的細胞中加入細胞裂解液，采用EastepSuper總RNA提取試劑盒(Promega，上海)提取總RNA.以提取的總RNA為模板，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser反轉錄試劑盒(Takara，大連)說明書將RNA反轉錄成cDNA.根據GenBank中的序列，使用Primer 6.0 軟件設計引物并由上海生工生物工程公司合成，引物名稱及序列如表2所示。以合成的cDNA為模板，通過qPCR(SYBR染料法，TB GreenTMPremic Ex TaqTM Ⅱ)(Takara，大連)檢測促炎因子基因(IL-8，IL-6，IL-1β)、膠原合成基因(COL1A2，COL3A1，COL5A3，COL6A1)、膠原降解相關基因MMP-2、血管內皮生長因子及其受體基因(VEGFA、VEGFR2)的表達，以管家基因GAPDH作為內參，目標基因的相對表達量采用相對定量法進行分析。

表2 qPCR引物Table 2 List of Primers for qPCR

1.4 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測總膠原含量

收集轉染72 h后細胞培養(yǎng)液上清，采用BCA蛋白定量試劑盒(凱基生物，南京)檢測蛋白濃度，采用ELISA法按照Human Col ELISA試劑盒(江萊生物，上海)說明書檢測細胞上清中的總膠原含量。

1.5 明膠酶譜檢測MMP-2活性

細胞培養(yǎng)液上清蛋白定量后通過含體積分數(shù)5%明膠的SDS聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)(體積分數(shù)10%)電泳分離，將凝膠轉移至體積分數(shù)2.5% Triton-X 100溶液中，震蕩洗滌3次，加入蛋白孵育液(50 mmol/L CaCl2，500 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris)37 ℃孵育16 h，凝膠置于考馬斯亮藍R250染色液中染色30 min后換至脫色液(體積分數(shù)40%甲醇，體積分數(shù)7.5%冰醋酸)中進行脫色，直至出現(xiàn)透明條帶。用Image J 1.8.0軟件進行灰度值分析。

1.6 Western blot檢測蛋白的表達

收集的細胞加入RIPA裂解液(Solarbio，北京)冰上裂解1 h后離心，收集上清，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。將定量的蛋白(50 ng)加入蛋白上樣緩沖液，混勻，沸水浴變性5 min，離心取上清，進行Western blot分析。樣本經體積分數(shù)10% SDS-PAGE電泳分離后轉移至PVDF膜(Millipore，美國)，質量分數(shù)5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h，洗膜。分別加入鼠抗人IL-8抗體(1∶500)、AKT抗體(1∶500)、ERK1/2抗體(1∶500)、β-Actin抗體(1∶500)(Servicebio，武漢)，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜5 min，加入與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗鼠二抗(1∶5 000)(Servicebio，武漢)室溫孵育1 h，使用ECL檢測試劑壓片曝光，以β-Actin作為內參，用Image J 1.8.0軟件以相對灰度值進行定量。

1.7 數(shù)據分析

每組實驗重復3次，數(shù)據用平均值±SD表示，使用Origin Pro 9.1作圖，使用SPSS 17.0軟件單因素方差分析(ANOVA)進行統(tǒng)計學分析。P<0.05表明樣本間有顯著性差異。

2 結果

2.1 IL-8 siRNA干擾效率

針對人IL-8基因(Genbank NO. NM_000584)編碼區(qū)設計3對特異性靶向siRNA序列，分別轉染人角膜成纖維細胞，通過分析干擾后IL-8基因的表達檢測siRNA干擾效率。結果顯示(圖1(a))，與對照組(無特異性靶序列)相比，轉染IL-8特異性siRNA序列后角膜成纖維細胞中IL-8基因的表達均被顯著抑制，其中si-IL8-1片段的干擾效率最高(98.9%，P<0.05).進一步利用Western blot檢測si-IL8-1片段干擾后IL-8蛋白的表達變化(如圖1(b)所示)，結果顯示，si-IL8-1片段轉染后IL-8的蛋白表達量顯著下降，約為對照組的69%(P<0.05).因此后續(xù)實驗使用si-IL8-1片段干擾人角膜成纖維細胞中的IL-8的表達。

2.2 IL-8對人角膜成纖維細胞膠原合成基因表達及膠原含量的影響

采用qPCR法檢測干擾IL-8后，角膜成纖維細胞中膠原合成基因COL1A2、COL3A1、COL5A3、COL6A1的表達，結果如圖2(a)所示，干擾IL-8后COL1A2、COL3A1、COL5A3、COL6A1基因的表達均顯著上升，分別為對照組的2.27，1.64，2.57，2.94，1.21倍(P<0.05).進一步采用ELISA法檢測干擾IL-8對角膜成纖維細胞外總膠原含量的影響，結果如圖2(b)所示，IL-8 siRNA轉染組總膠原的含量為對照組的9.2倍(P<0.05).降低角膜成纖維細胞中IL-8基因的表達能夠顯著提高總膠原的含量。

*代表與對照組有顯著性差異，P<0.05圖2 沉默IL-8對角膜成纖維細胞膠原合成基因表達(a)和膠原含量(b)的影響Fig.2 Effect of IL-8 silence on collagen synthesis gene expression (a) and collagen content (b) in corneal fibroblasts

2.3 IL-8對人角膜成纖維細胞MMP-2基因表達及活性的影響

與對照組相比，干擾IL-8后角膜成纖維細胞中明膠酶基因MMP-2的表達顯著下降(圖3(a)，下降43%，P<0.05).在此基礎上，通過明膠酶譜分析MMP-2的活性變化，結果如圖3(b)，與對照組相比，IL-8干擾后MMP-2的活性下降20%(P<0.05).

2.4 IL-8對下游信號途徑表達的影響

如圖4(a)所示，干擾IL-8后角膜成纖維細胞中VEGF-A(VEGFA)及其受體VEGFR2基因表達降低(P<0.05)，進一步采用Western blot法檢測VEGFR2下游AKT與ERK1/2信號途徑的變化，結果如圖4(b)所示，與對照組相比，干擾IL-8后角膜成纖維細胞中AKT和ERK1/2蛋白的表達均顯著下降(P<0.05).

*代表與對照組有顯著性差異，P<0.05圖3 IL-8對角膜成纖維細胞MMP-2基因表達(a)及蛋白活性(b)的影響Fig.3 Effect of IL-8 on MMP-2 gene expression (a) and protein activity (b) in corneal fibroblasts

*代表與對照組有顯著性差異，P<0.05圖4 干擾IL-8對下游信號途徑的影響Fig.4 Effect of IL-8 interference on downstream signaling pathways

2.5 IL-8對其他促炎因子表達的影響

通過qPCR法檢測干擾IL-8后，角膜成纖維細胞中促炎因子基因IL-1β、IL-6的表達變化，結果如圖5顯示，IL-1β、IL-6的表達均顯著降低，與對照組相比，IL-8干擾組中IL-1β、IL-6基因的相對表達量分別下降為93%，50%(P<0.05).

*代表與對照組有顯著性差異，P<0.05圖5 IL-8對角膜成纖維細胞促炎因子基因表達的影響Fig.5 Effect of IL-8 on the gene expression of other inflammatory factors in corneal fibroblasts

3 討論

盡管圓錐角膜被認為是一種非炎性疾病，但越來越多的研究者發(fā)現(xiàn)圓錐角膜患者淚液中促炎因子含量顯著升高[5-9,17]。ELISA檢測結果顯示圓錐角膜患者角膜細胞和淚液中IL-6、IL-8的含量較高[18]；LOH et al[19]采用細胞因子抗體芯片對圓錐角膜樣本進行分析發(fā)現(xiàn)：IL-1等炎性因子在圓錐角膜中含量顯著升高，炎癥相關信號途徑被激活，圓錐角膜可能是一種慢性炎癥性角膜疾病。作為一種重要的促炎因子，IL-8在圓錐角膜中的作用尚不明確。

圓錐角膜中膠原的形態(tài)和排列發(fā)生改變，膠原蛋白的合成和降解失衡，進而導致角膜生物力學性能下降，抗變形能力降低。COLs、MMPs等與膠原代謝相關的基因是圓錐角膜可能的易感基因[20]。圓錐角膜中膠原合成基因COL1、COL5A2、COL6A1的表達降低[5]。對圓錐角膜組織進行質譜、免疫組化等分析發(fā)現(xiàn)，圓錐角膜中Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ型膠原蛋白含量顯著減少[2，21]。本研究通過siRNA干擾角膜成纖維細胞中IL-8的表達，探討IL-8在角膜成纖維細胞膠原代謝過程中的作用，結果發(fā)現(xiàn)，干擾IL-8的表達能夠誘導角膜成纖維細胞中Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ型膠原合成基因COL1A2、COL3A1、COL5A3、COL6A1的表達，總膠原含量升高，表明IL-8負調控角膜成纖維細胞中膠原的合成。MMP-2參與膠原蛋白的降解，在圓錐角膜中具有較高的表達[1，11]。本研究結果顯示，降低IL-8的表達后角膜成纖維細胞中MMP-2基因的表達及酶活性均降低，表明IL-8參與角膜成纖維細胞中MMP-2介導的膠原降解過程。

研究表明，在口腔角質形成細胞中IL-1β、IL-6與IL-8共表達[22]。IL-1β、IL-6等炎癥因子可以促進角膜成纖維細胞中MMPs的表達[23-25]。本研究結果顯示，干擾IL-8可顯著降低IL-1β、IL-6兩種促炎因子表達，推測IL-8可通過調節(jié)其他促炎因子的表達調節(jié)角膜成纖維細胞中膠原的合成和降解。血管內皮生長因子(VEGF)可以激活其同源酪氨酸激酶受體VEGFR2從而促進細胞的增殖、存活和遷移。研究發(fā)現(xiàn)，IL-8通過激活PI3K/AKT通路促進結腸癌細胞增殖和遷移[26]。同時，IL-8也可以通過作用于其受體CXCR2來上調內皮細胞中的VEGF的基因和蛋白水平，并導致VEGFR2的自分泌激活[27]。VEGF可以影響內皮細胞中細胞信號轉導和炎性反應密切相關的ERK1/2信號通路[28]；此外，VEGF通過PI3K/AKT信號通路促進胎盤間充質干細胞的增殖和生長[29]；SONG et al[30]發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT信號通路參與腎臟組織中Ⅰ型膠原的表達調控。本研究結果顯示，干擾角膜成纖維細胞中IL-8的表達后，VEGFA及其受體VEGFR2的基因表達降低，其下游途徑關鍵蛋白AKT、ERK1/2的表達均顯著下降。表明IL-8調節(jié)角膜成纖維細胞中VEGF的表達，并通過PI3K/AKT、ERK信號通路負調控角膜成纖維細胞中膠原的合成，參與MMP-2介導的膠原降解過程(圖6).

圖6 IL-8在角膜成纖維細胞中作用的信號通路Fig.6 Proposed signaling pathway of IL-8 in corneal fibroblasts

本研究探討了正常角膜成纖維細胞中IL-8對膠原代謝的作用及其分子機制，IL-8及其下游信號通路在圓錐角膜病變中的作用還需進一步研究，本研究結果可為深入揭示圓錐角膜的發(fā)病機理提供參考。