劉 慧 ，肖金超 ，張慶捷，蒲 健，譚 丹，李勇軍，王愛民，鄭 林，黃 勇*

1.貴州醫(yī)科大學貴州省藥物制劑重點實驗室/藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州 貴陽 550004

2.貴州醫(yī)科大學藥學院，貴州 貴陽 550004

3.貴州益佰制藥股份有限公司，貴州 貴陽 550008

4.貴州醫(yī)科大學民族藥與中藥開發(fā)應用教育部工程研究中心，貴州 貴陽 550004

金骨蓮膠囊（Jingulian Capsules，JGLC）源于經(jīng)典苗藥組方，由大血藤、八角楓、透骨香、漢桃葉和金鐵鎖5味藥材為主要原料，采用水煮、濃縮等工藝精制而成的復方中藥制劑，為治療風濕痹癥的全國苗藥獨家品種和貴州益佰制藥股份有限公司的拳頭產(chǎn)品[1-2]。具有祛風除濕、消腫止痛之功效（苗醫(yī)：抬奧、抬蒙、僵見風）。收載于《國家中成藥標準匯編》[3]和《國家基本醫(yī)療保險藥品目錄》[4]。臨床上主要用于風濕痹癥所致的關節(jié)腫痛、屈腫不利的治療，療效獨特[5-7]。現(xiàn)行質(zhì)量標準僅對大血藤、透骨香和金鐵鎖進行薄層色譜鑒別，以及對漢桃葉中富馬酸進行含量限定（不低于0.01%），難以體現(xiàn)制劑的整體特性和內(nèi)在品質(zhì)。為了更全面地評價JGLC的質(zhì)量，本研究采用HPLC法建立了12批JGLC指紋圖譜，共標定了19個共有峰，經(jīng)鑒定其中的9個色譜峰分別為富馬酸、沒食子酸、原兒茶酸、紅景天苷、綠原酸、香草酸、表兒茶素、鵝掌楸苷、滇白珠苷A。在指紋圖譜相似度評價的基礎上，結合化學模式識別分析方法對12批JGLC進行質(zhì)量研究，旨在為該制劑建立更系統(tǒng)、全面的質(zhì)量控制標準提供借鑒與參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Ultimate 3000型高效液相色譜儀，美國Thermo Fisher Scientific公司，包括系統(tǒng)控制器、輸液泵（LPG-3400SD）、柱溫箱（TCC-3000SD）、溫控樣品室（WPS-300SL）、UV-DAD檢測器（DAD-3000）、脫氣組件、低壓梯度組件、Chromeleon 7色譜數(shù)據(jù)工作站和自動進樣器；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；EL-240型電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；WP-UP-IV-20型超純水機，四川沃特爾科技發(fā)展有限公司。

1.2 試藥

JGLC，規(guī)格：每粒裝0.25 g，批號分別為180502、191001、191007、191005、190409、190410、191002、200708、200711、200707、200706、200710，依次編號為S1～S12，貴州益佰制藥股份有限公司；大血藤（產(chǎn)地湖北，批號YL-17920190401）、透骨香（產(chǎn)地貴州，批號YL-17520190401）、漢桃葉（產(chǎn)地貴州，批號JYL-20191006）、八角楓（產(chǎn)地河南，批號YL-17720190401）、金鐵鎖（產(chǎn)地貴州，批號YL-17820190302）藥材均由貴州益佰制藥股份有限公司提供，經(jīng)貴州醫(yī)科大學藥學院生藥學教研室龍慶德教授鑒定，大血藤為木通科植物大血藤Sargentodoxa cuneata(Oliv.) Rehd.et Wils.的干燥藤莖；透骨香為杜鵑花科植物滇白珠Gaultherla yunnaensis(Pranech) Rehd.的干燥全株；漢桃葉為五加科植物白花鵝掌柴Schefflera leacantheVig.的干燥帶葉莖枝；八角楓為八角楓科植物八角楓Alanglum chinese(Lour.) Hars及瓜木Alanglum platanifolum(Steb.et Zuce.) Harms的干燥枝根（白金條）；金鐵鎖為石竹科植物金鐵鎖Psammosilene tunicoidesW.C.Wu et C.Y.Wu的干燥根。富馬酸（批號181120，質(zhì)量分數(shù)≥99%）、紅景天苷（批號181020，質(zhì)量分數(shù)≥98%）對照品購于北京世紀奧科生物技術有限公司；沒食子酸（批號110831-201906，質(zhì)量分數(shù)91.5%）、綠原酸（批號110753-201716，質(zhì)量分數(shù)99.3%）對照品購于中國食品藥品檢定研究院；原兒茶酸（批號MUST-20110310，質(zhì)量分數(shù)99.78%）對照品購于成都曼思特生物科技有限公司；香草酸（批號AF20020852，質(zhì)量分數(shù)99.29%）、表兒茶素（批號AF8030805，質(zhì)量分數(shù)98%）、鵝掌楸苷（批號AF91002701，質(zhì)量分數(shù)≥98%）對照品購于成都埃法生物科技有限公司；滇白珠苷A（批號20190223，質(zhì)量分數(shù)＞98%）對照品為實驗室自制。乙腈、甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

采用ACE Excel 5 C18-PFP（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液；梯度洗脫：0～40 min，5%～20%乙腈；40～50 min，20%～25%乙腈；50～55 min，25%～35%乙腈；體積流量為0.8 mL/min；進樣量為10 μL；柱溫為40 ℃；檢測波長為210 nm。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 分別精密稱取富馬酸、沒食子酸、原兒茶酸、紅景天苷、綠原酸、香草酸、表兒茶素、鵝掌楸苷、滇白珠苷A對照品適量，加入甲醇，制成質(zhì)量濃度分別為1.120、1.002、1.038、1.046、1.182、0.402、1.032、0.950、1.116 mg/mL的對照品溶液。

精密移取各單一對照品溶液適量，用50%甲醇逐步稀釋，最終配制成含富馬酸、沒食子酸、原兒茶酸、紅景天苷、綠原酸、香草酸、表兒茶素、鵝掌楸苷、滇白珠苷A質(zhì)量濃度分別為17.920、8.016、24.912、16.736、37.824、6.432、16.512、30.400、17.856 μg/mL的混合對照品溶液，置于4 ℃冰箱冷藏備用。

2.2.2 供試品溶液 取JGLC內(nèi)容物1.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（300 W、40 kHz）30 min，取出，冷卻后稱定質(zhì)量，50%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，取適量溶液過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 單味藥材溶液 分別稱取JGLC處方藥材大血藤、透骨香、漢桃葉、八角楓、金鐵鎖各約50 g，根據(jù)制劑的處方工藝分別制備各單味藥材樣品。按“2.2.2”項下方法制備藥材溶液，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取同一份樣品（批號191001），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行檢測，連續(xù)進樣分析6次，記錄所得圖譜，以15號峰鵝掌楸苷為參照峰（分離度良好，峰面積較大且為所有批次共有），計算主要色譜峰相對保留時間和相對峰面積的RSD。結果顯示各色譜峰的相對保留時間的RSD為0.01%～0.08%，相對峰面積的RSD為0.30%～2.69%，說明該儀器精密度良好。

2.3.2 重復性試驗 取同一份樣品（批號191001），按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行檢測分析，以15號峰鵝掌楸苷為參照峰，計算主要色譜峰相對保留時間和相對峰面積的RSD。結果顯示，各色譜峰的相對保留時間的RSD為0.02%～0.37%，相對峰面積的RSD為0.56%～4.73%，說明該分析方法重復性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取同一份樣品（批號191001），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h進行檢測，以15號峰鵝掌楸苷為參照峰，計算主要色譜峰相對保留時間和相對峰面積的RSD。結果顯示，各色譜峰的相對保留時間的RSD為0.03%～0.42%，相對峰面積的RSD為1.12%～4.77%，說明供試品溶液在24 h穩(wěn)定性良好。

2.4 指紋圖譜的建立及相似度評價

2.4.1 指紋圖譜的建立 取12批JGLC（S1～S12），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行檢測，記錄色譜圖。將色譜圖以AIA格式導入《中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版）進行分析，以S1號樣品的色譜圖為參照圖譜，設定時間窗寬度為0.1 min，對12批制劑進行多點校正后自動峰匹配，12批制劑的指紋圖譜疊加圖見圖1，共標定了19個共有峰，其中15號色譜峰（鵝掌楸苷）保留時間適中、分離度良好，峰面積較大，作為參照峰（S）。以中位數(shù)法生成對照指紋圖譜（R），結果見圖1。

圖1 12批JGLC的HPLC指紋圖譜疊加圖 (A) 及其對照指紋圖譜 (R)Fig.1 HPLC superimposed fingerprint of 12 batches of JGLC (A) and its reference fingerprint (R)

2.4.2 共有峰的指認 按“2.1”項下色譜條件分別測定供試品溶液和混合對照品溶液，見圖2。通過各峰的保留時間及化學成分的紫外光譜圖對比，共指認了9個成分，分別為2（富馬酸）、3（沒食子酸）、6（原兒茶酸）、7（紅景天苷）、9（綠原酸）、12（香草酸）、13（表兒茶素）、15（鵝掌楸苷）、16（滇白珠苷A）號峰。

圖2 混合對照品溶液 (B) 和JGLC溶液 (C) 的HPLC圖Fig.2 HPLC chromatogram of mixed reference substances solution (B) and JGLC solution (C)

2.4.3 共有峰的歸屬 通過將單味藥材溶液和JGLC溶液的HPLC色譜圖進行比較，對指紋圖譜共有峰進行藥材歸屬，見圖3。1號為5味藥材共有；2、8、11號峰來源于漢桃葉；5、7、10、12、15號峰來源于大血藤；16、17、19號峰來源于透骨香；3號為八角楓和大血藤共有；13號為大血藤和透骨香共有；4、9、14、18號峰為大血藤和漢桃葉共有；6號為大血藤、漢桃葉和透骨香共有。結果表明制劑與單味藥材的相關性良好。

圖3 JGLC及單味藥材溶液HPLC圖Fig.3 HPLC chromatogram of JGLC and its single herb solution

2.4.4 指紋圖譜相似度評價 采用《中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版）對12批JGLC的指紋圖譜進行相似度計算，見表1。12批制劑的相似度均在0.910以上，說明該制劑各批次之間相似度良好，質(zhì)量較穩(wěn)定。

表1 12批JGLC相似度評價結果Table 1 Results of similarity evaluation of 12 batches of JGLC

2.5 化學模式識別

2.5.1 層次聚類分析（hierarchical clustering analysis，HCA）[8-9]運用SPSS 20.0軟件，以12批JGLC的19個共有峰的相對峰面積為變量，采用Ward法，以歐氏距離作為度量標準進行HCA，見圖4。當歐氏距離為20時，12批樣品共聚為2類：S1～S7聚為一類；S8～S12聚為另一類。當歐氏距離為10時，12批樣品共聚為3類：S1～S4、S7批次樣品聚為第1類；S5～S6批次樣品聚為第2類；S8～S12聚為第3類。

圖4 12批JGLC (S1～S12) 指紋圖譜的聚類分析樹狀圖Fig.4 Dendrogram of hierarchical clustering analysis of 12 batches of JGLC (S1—S12)

2.5.2 主成分分析（principal component analysis，PCA）[10]以12×19峰面積數(shù)據(jù)矩陣為數(shù)據(jù)，運用SIMCA 11.0軟件對12批JGLC進行PCA，特征值、方差貢獻率及累計方差貢獻率見表2。提取的前3個主成分的累積方差貢獻率達到85.324%，表明前3個主成分能夠反映JGLC的基本特征和大部分信息。圖5為PCA得分圖，將12批樣品分為3類，結果與HCA基本一致，也進一步驗證了聚類分析的分類結果。

圖5 12批JGLC樣品的PCA得分圖Fig.5 PCA score plot of 12 batches of JGLC

表2 JGLC PCA特征值與累積方差貢獻率Table 2 Eigenvalue and total variance of PCA of JGLC

根據(jù)變量離原點的距離判定變量對主成分的權重影響，離遠點越遠則表明該變量對主成分的影響權重越大[11]。由載荷散點圖（圖6）分析得到5、14、9（綠原酸）、2和10號色譜峰對主成分1的貢獻率較大；16（滇白珠苷A）、17、18、19、11、15（鵝掌楸苷）號色譜峰對主成分2的貢獻較大。

圖6 12批JGLC主成分模型載荷圖Fig.6 Loading plot of 12 batches of JGLC

2.5.3 正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）[12-13]將12批樣品的19個共有峰峰面積導入SIMCA 11.0，對12批樣品進行OPLS-DA，在該模型下R2X為0.829，R2Y為1.000，Q2為0.907，均大于0.5，表明該模型具有較好預測能力[14-15]。為驗證所建模型是否存在過擬合現(xiàn)象，進一步采用200次響應排序檢驗，結果所有通過隨機排序計算得到的R2和Q2值均小于原始值，且Q2回歸直線與Y軸有負截距圖（圖7），說明模型是有效的，不存在過度擬合[16]，可用于JGLC差異標志物的篩選。12批樣品共分為3類（圖8）與聚類分析和PCA分類結果一致。

圖7 OPLS-DA模型的200次響應排序檢驗Fig.7 200 response permutation tests for OPLS-DA model

圖8 12批JGLC OPLS-DA得分圖Fig.8 OPLS-DA score plot for 12 batches of JGLC

為進一步篩選出導致12批樣品產(chǎn)生差異的成分，通過提取OPLS-DA模型中19個變量的重要值（variable importance in projection，VIP），以VIP＞1為標準[17]，篩選出15（鵝掌楸苷）、14、6（原兒茶酸）、18、16（滇白珠苷A）、19、9（綠原酸）號峰（圖9）可能是導致樣品之間產(chǎn)生差異的主要原因，具有一定的標志性作用，該結果與PCA載荷圖中尋找的重要性權重變量基本一致。

圖9 JGLC的OPLS-DA的VIP值圖Fig.9 VIP plot of OPLS-DA for JGLC

3 討論

在供試品溶液制備方法考察時，分別考察了不同提取方式（超聲、加熱回流），不同提取溶劑（甲醇、75%甲醇、50%甲醇、25%甲醇、無水乙醇、75%乙醇、50%乙醇、25%乙醇和水），不同提取時間（15、30、60 min）對JGLC有效成分提取的影響，綜合色譜峰數(shù)量及響應值，確定采用50%甲醇為提取溶劑，超聲提取30 min，作為供試品的處理方法。

中藥指紋圖譜是一種綜合的、可量化提供化學成分特征的色譜圖，可通過表征中藥復雜成分及內(nèi)在質(zhì)量的關系來較為全面地反映所含化學成分的種類及數(shù)量，從而評價中藥質(zhì)量的一致性及穩(wěn)定性，在中藥材及中藥復方制劑的質(zhì)量評價中已被廣泛應用[18-21]。本研究首次采用HPLC法建立了12批JGLC的指紋圖譜，標定了19個共有峰并結合組方單味藥材溶液的色譜圖進行比較，19個共有峰均得以歸屬，表明制劑與藥材具有良好的關聯(lián)性。提示可以從藥材源頭入手，以便更好地控制制劑的穩(wěn)定性和均一性。通過與對照品進行比對，鑒定了9個色譜峰，分別為富馬酸、沒食子酸、原兒茶酸、紅景天苷、綠原酸、香草酸、表兒茶素、鵝掌楸苷和滇白珠苷A。相似度評價結果顯示各批次間的相似度均大于0.910，說明12批JGLC的相似度良好，質(zhì)量較穩(wěn)定。

從HCA結果來看，在不同年份及月份生產(chǎn)的JGLC中的化學成分含量存在一定的差異，可能與制劑所用的原藥材來源、采收季節(jié)以及原藥材批間質(zhì)量差異有關。隨后進行了無監(jiān)督的PCA，該分類結果與聚類分析一致，也進一步驗證了聚類分析的結果。在對JGLC進行一致性評價的同時進行了差異性評價，通過VIP法篩選出了對樣品組分影響較大的成分，發(fā)現(xiàn)15（鵝掌楸苷）、14、6（原兒茶酸）、18、16（滇白珠苷A）、19、9（綠原酸）號峰為差異標志物，提示在今后該藥品的生產(chǎn)過程中應重點關注這7個成分的變化，進而保證藥品的質(zhì)量，然而14、18、19號峰尚未知，后續(xù)將會進一步采用液質(zhì)聯(lián)用等手段對未識別的成分進行鑒定，以便更好地對JGLC進行質(zhì)量控制。

綜上所述，本實驗所建立的JGLC指紋圖譜方法簡單、準確度高，可用于該藥品的質(zhì)量控制研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突