姚利利，席 俊，陳慧彬，陳 陽(yáng)，皮江一，李 潘

大豆是人類食物過(guò)敏源之一[1]。調(diào)查表明，一般人群的大豆過(guò)敏患病率可能高達(dá)0.5%，而兒童高達(dá)13%[2]。據(jù)報(bào)道，至少有19 種大豆蛋白與大豆過(guò)敏患者的人血清IgE 結(jié)合，其中包含大豆球蛋白。大豆球蛋白結(jié)構(gòu)復(fù)雜，為六聚體結(jié)構(gòu)（兩層三聚體組成），三聚體內(nèi)部各多肽鏈通過(guò)二硫鍵和氫鍵配對(duì)交替連接在一起[3]。大豆球蛋白（Gly m 6）的變應(yīng)原特性被廣泛描述[4]。研究發(fā)現(xiàn)86%大豆過(guò)敏的患者的IgE 與Gly m 6（大豆球蛋白）結(jié)合[5]。關(guān)于大豆過(guò)敏蛋白的致敏表位鑒定一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)，而純度高的目標(biāo)抗體更有利于篩選和鑒定抗原表位。層析法和非層析法常用于抗體的純化，一般非層析法后再進(jìn)行層析純化[6]。效果較佳的硫酸銨沉淀法為非層析法之一，收率達(dá)91%[7]。免疫親和層析利用抗體和抗原的相互作用來(lái)純化抗體[8]。該方法被用來(lái)促進(jìn)低致敏性產(chǎn)品的開發(fā)[9-10]?？乖蛘呖贵w偶聯(lián)在柱填料上，具有高度選擇性和較好的純化效果[11-12]。本試驗(yàn)將大豆球蛋白偶聯(lián)在免疫親和層析柱填料上作為配基，進(jìn)樣的抗血清提前經(jīng)硫酸銨沉淀，待目標(biāo)抗體與大豆球蛋白充分反應(yīng)吸收后洗脫2 次。首次非特異性洗脫物主要為其它非特異性抗體和雜蛋白，經(jīng)特異性洗脫的為目標(biāo)抗體。該親和層析具有純化過(guò)程簡(jiǎn)單、快速、產(chǎn)品純度高等優(yōu)點(diǎn)。該方法的應(yīng)用將有利于大豆球蛋白過(guò)敏原的深入研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆球蛋白、抗大豆球蛋白多抗血清，實(shí)驗(yàn)室自制；CNBr activities sephrose 4B（免疫親和層析柱），美國(guó)GE 公司；親和層析柱、HRP 標(biāo)記羊抗兔IgG、0.45 μm 濾膜，北京索萊寶科技有限公司；紫外檢測(cè)儀，上海青浦滬西儀器廠；Multiskan 酶標(biāo)儀、Nanodrop ND-2000 超微量核酸蛋白測(cè)定儀，美國(guó)Thermo 公司。

1.2 試劑配制

試劑的配制參照文獻(xiàn)[13]，[14]的方法，試劑溶解均用超純水，1 mmol/L HCl：取16.424 μL 的濃鹽酸滴加入200 mL 超純水并混勻。偶聯(lián)液：取2.19 g NaHCO3，7.3 g NaCl 溶解并用2 mol/L HCl定容為250 mL，調(diào)pH 值至8.3。封閉液：取1.21 g Tris 溶解定容至100 mL 并調(diào)pH 值至8.0。平衡緩沖液：取1.45 g Na2HPO4·12H2O、0.1 g KH2PO4、4.0 g NaCl，0.1 g KCl 溶解并定容至500 mL。洗脫液：取0.75 g G1y，調(diào)pH 值至2.7 并定容至100 mL。再生A 液：取16.4 g 醋酸鈉，5.84 g NaCl，溶解后定容至200 mL，并調(diào)pH 值至4.0。再生B 液：取2.42 g Tris，5.84 g NaCl 定容至200 mL 并調(diào)pH 值至8.0。Tris 中和液：取Tris 6.09 g 溶解并調(diào)pH 值為9.0，定容至50 mL。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 以大豆球蛋白為配基制備免疫親和層析柱試驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[13，14]并改進(jìn)，取CNBr-activitied-Sephrose-4B 干粉0.6 g，用1 mmol/L HCl溶脹20 min，并用50 mL 1 mmol/L HCl 沖洗，用偶聯(lián)液洗滌柱子，獲得柱材約2 mL。用偶聯(lián)緩沖液溶解大豆球蛋白粉末后過(guò)0.45 μm 水系濾膜（防止不溶性蛋白堵塞柱子），加入柱材與之充分混合，置于搖床上3 h，用偶聯(lián)液洗滌未偶聯(lián)蛋白，并收集全部沖洗液后測(cè)定蛋白濃度，計(jì)算柱容量。加入過(guò)量封閉液（含BSA），室溫?fù)u晃2 h，充分封閉未結(jié)合活性位點(diǎn)。長(zhǎng)時(shí)間不用時(shí)，可加入0.02%NaN3抑菌，4 ℃保存。

1.3.2 免疫親和層析純化大豆球蛋白多克隆抗體參照文獻(xiàn)[13]的方法并加以改進(jìn)：（1）上樣，封閉后將介質(zhì)轉(zhuǎn)入3 mL 柱子，用平衡緩沖液洗滌平衡柱體，取硫酸銨分級(jí)沉淀后的兔抗血清0.77 mL，過(guò)0.45 μm 水系濾膜，將多抗緩慢加入柱子內(nèi)，充分混合；（2）洗滌和洗脫，用平衡緩沖液洗脫未結(jié)合的蛋白，自然流出，待非特異性洗脫至基線，用洗脫液特異性洗脫，同樣自然流出，收集洗脫液。由于較低pH 值會(huì)破壞抗體活性，因此加入少量中和緩沖液用于保護(hù)抗體；（3）柱子的再生，用再生A、B 液循環(huán)3 次洗滌，再用PBS 平衡緩沖液洗滌平衡（洗滌均5 倍柱床體積）。

1.3.3 純化前、后抗血清的純度鑒定 對(duì)原血清、硫酸銨沉淀后的血清和免疫親和層析后的血清樣品純度分析，將血清上樣質(zhì)量濃度調(diào)至2 mg/mL，參照文獻(xiàn)[15]配置蛋白電泳膠。取出凝膠室溫染色3 h，脫色液脫色后用Tanon 2500 凝膠成像儀分析。

1.3.4 純化后抗體的效價(jià)測(cè)定 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）是一種快速，高度靈敏且特異的血清學(xué)檢測(cè)方法[16]。參照文獻(xiàn)[17]的方法進(jìn)行間接ELISA 測(cè)定抗血清效價(jià)，設(shè)置試驗(yàn)所需的孔板數(shù)，CBS（碳酸鹽緩沖液pH 9.6，0.05 mol/L）將大豆球蛋白稀釋為2.5 μg/mL，4 ℃包被過(guò)夜，100 μL/孔，用PBST 洗板，拍干、37 ℃封閉（1% BSA）2 h，洗板，拍干、一抗為洗脫峰收集液與穿透峰收集液依次倍比稀釋，孵育1 h，洗板，拍干、加酶標(biāo)二抗（1∶5 000 倍稀釋），100 μL/孔，37 ℃孵育30 min，洗板，拍干、避光顯色15 min、加入50 μL/孔H2SO4終止反應(yīng)；酶標(biāo)儀測(cè)定每孔OD450值。

1.3.5 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 測(cè)定純化前、后抗體特異性 參考文獻(xiàn)[18]的方法進(jìn)行純化前、后抗體特異性的鑒定，通過(guò)分析原血清、硫酸銨初步純化血清、硫酸銨初步純化再過(guò)柱3 種血清進(jìn)行特異性對(duì)比，分析半數(shù)抑制率IC50（抗血清的敏感性）和交叉反應(yīng)率（CR）的變化情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫親和層析柱的柱容量測(cè)定

溶脹后的CNBr-activated Sepharose 4B 與0.5 mL 質(zhì)量濃度為17.7 mg/mL 的大豆球蛋白偶聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后，用至少5 倍于凝膠體積偶聯(lián)液洗滌未偶聯(lián)蛋白，至檢測(cè)洗出液的OD280＜0.02。收集全部的洗滌液用超微量核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)洗滌出的蛋白15 mL 質(zhì)量濃度為0.025 mg/mL，因此偶聯(lián)在凝膠上的大豆球蛋白約為8.48 mg，即偶聯(lián)率達(dá)96%。

2.2 免疫親和層析結(jié)果

硫酸銨沉淀后的多抗血清進(jìn)入親和柱時(shí)，與親和柱上連接的大豆球蛋白配基結(jié)合，不與大豆球蛋白抗原特異性結(jié)合的雜蛋白被洗掉，即為圖1中的穿透峰。由于本試驗(yàn)中上樣濃度較高，樣品自然流下（未施加壓力），因此，親和層析圖譜上穿透峰較高、較寬，經(jīng)核酸蛋白定量檢測(cè)儀測(cè)定蛋白含量為4.08 mg/mL。當(dāng)用pH 2.7 的洗脫液洗脫時(shí)，得到圖中標(biāo)注的洗脫峰，得到目標(biāo)抗體6 mL，經(jīng)質(zhì)量濃度測(cè)定為0.3 mg/mL 的目標(biāo)抗體。圖中未標(biāo)注的峰為操作過(guò)程中的氣泡峰。

圖1 抗血清過(guò)柱純化圖Fig.1 Antiserum purification column

2.3 純化前、后大豆球蛋白特異性抗體SDSPAGE

IgG 抗體是由一條重鏈和一條輕鏈構(gòu)成，顯示為兩條蛋白條帶，由圖2可以看出，未經(jīng)任何處理的血清含有較多的雜蛋白（泳道1），經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀后（泳道2），血清純度得到提高，大部分雜蛋白被除去，但仍含有少量的雜蛋白。4 泳道為雜蛋白，除含有部分非抗體蛋白外，可以看出雜蛋白中還含有部分非抗大豆球蛋白目標(biāo)抗體。將硫酸銨分級(jí)沉淀后的抗體過(guò)柱純化后（泳道3），泳道中已基本不含雜蛋白，因此，得到高純度的抗大豆球蛋白目標(biāo)抗體。

圖2 抗血清純化前、后SDS-PAGEFig.2 SDS-PAGE before and after purification of antiserum

2.4 免疫親和層析抗體的間接ELISA 檢測(cè)

對(duì)穿透峰（非特異性洗脫）和洗脫峰（特異性洗脫）收集液進(jìn)行間接ELISA 測(cè)定：結(jié)果見表1，由表1可知洗脫峰中的大部分為抗大豆球蛋白目標(biāo)抗體，洗脫峰收集液稀釋至128 倍后間接ELISA 結(jié)果顯示為陽(yáng)性，穿透峰收集液（雜蛋白）稀釋兩倍之后即為陰性，結(jié)果表明大部分的雜蛋白和非目標(biāo)抗體基本被去除，免疫親和層析成功洗脫出大豆球蛋白特異性抗體。

表1 抗血清過(guò)柱非特異性洗脫與特異性洗脫的ELISA 鑒定Table 1 ELISA identification of non-specific elution and specific elution of antiserum by column

2.5 免疫親和層析前、后抗體特異性鑒定結(jié)果

由表2可以看出，純化前、后抗血清的敏感性變化不大，過(guò)柱后的抗血清敏感性最好，抗血清在過(guò)柱純化后與花生分離蛋白基本不存在交叉反應(yīng)，芝麻蛋白與純化前、后的抗血清都無(wú)交叉反應(yīng)，在純化前，抗血清與β-伴大豆球蛋白的交叉反應(yīng)率（CR）為8.6%，經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀后CR 有所降低，經(jīng)過(guò)柱后的抗血清CR 為0.5%，這可能與偶聯(lián)到柱填料上的蛋白的純度有關(guān)（會(huì)含有少量的β-伴大豆球蛋白），結(jié)果表明，試驗(yàn)得到了特異性好的抗大豆球蛋白目標(biāo)抗體。

表2 抗血清純化前、后特異性鑒定Table 2 Specific identification of antiserum before and after purification

3 結(jié)論

本試驗(yàn)抗血清在經(jīng)過(guò)硫酸銨初步純化后與免疫親和層析柱偶聯(lián)來(lái)制備免疫親和柱，利用抗原抗體相互作用對(duì)多抗血清純化并進(jìn)行免疫學(xué)特性鑒定。制備抗大豆球蛋白抗體時(shí)，除含有特異性抗體外,還有球蛋白等雜質(zhì),因此對(duì)動(dòng)物免疫血清純化是必要的[19]。硫酸銨分級(jí)沉淀會(huì)除去雜蛋白，但去除不完全，僅為初步純化，因此通過(guò)SDSPAGE 所呈現(xiàn)出來(lái)的電泳圖會(huì)含有較多的雜蛋白以及非抗大豆球蛋白抗體，抗體經(jīng)過(guò)柱純化后，經(jīng)檢測(cè)，純度得到很大提高。將過(guò)柱所得到的非特異性洗脫液和特異性洗脫液進(jìn)行間接ELISA 試驗(yàn)，非特異性洗脫液（雜蛋白）中所含的抗體基本不與孔板中所包被的大豆球蛋白結(jié)合而呈陽(yáng)性反應(yīng)，特異性洗脫的抗體在經(jīng)128 倍稀釋后與大豆球蛋白仍呈陽(yáng)性反應(yīng)。間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 對(duì)抗血清特異性鑒定結(jié)果顯示，抗血清與β-伴大豆球蛋白的交叉反應(yīng)率很低，試驗(yàn)成功獲得了純度高、敏感性好、特異性強(qiáng)的抗大豆球蛋白目標(biāo)抗體。