張 哲，郭 帥，于學健，辛 亮，姚 粟*

類干酪乳酪桿菌（Lacticaseibacillus paracasei）屬于厚壁菌門（Firmicutes），芽孢桿菌綱（Bacilli），乳桿菌目（Lactococcus），乳桿菌科（Lactobacillaceae），乳酪桿菌屬（Lacticaseibacillus）。類干酪乳酪桿菌是典型的革蘭氏陽性細菌，廣泛存在于干酪、發(fā)酵乳、泡菜等發(fā)酵食品以及人體的口腔、腸道中，兼性厭氧、不運動、不產(chǎn)生芽胞，是典型的同型乳酸發(fā)酵乳酸菌，同時也是常見的益生菌候選菌株[1-3]。類干酪乳酪桿菌這一分類最早是在1989年由Collins 等[4]提出，將原干酪乳桿菌的4 個亞種歸為副干酪乳桿菌這一新的菌種，并指定ATCC 25302T 為其模式菌株，在2020年乳桿菌屬分類發(fā)生變化，副干酪乳桿菌歸為乳酪桿菌屬，并更名為類干酪乳酪桿菌[5]。

類干酪乳酪桿菌具有研究、使用歷史悠久，安全性高的優(yōu)點。在我國國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的《可用于食品的菌種名單》[6]以及歐盟食品安全委員會發(fā)布的QPS[7]（qualified presumpyion of safety）名單中，類干酪乳酪桿菌（副干酪乳桿菌）均位列其中。類干酪乳酪桿菌還具有良好的耐酸、耐膽鹽特性，經(jīng)過人體胃、腸道依舊能大量存活，發(fā)揮其益生特性[8]。近年來，類干酪乳酪桿菌不僅應用在干酪等傳統(tǒng)發(fā)酵制品中，在單菌株低溫發(fā)酵的活菌型乳酸菌飲料中應用也很廣泛。例如：每益添由類干酪乳酪桿菌LC-431 發(fā)酵而成，優(yōu)益C則選用類干酪乳酪桿菌LC-37，味全活菌型乳酸菌飲料選用了類干酪乳酪桿菌LC-01。3 種產(chǎn)品中活菌數(shù)均達到3×1011CFU。類干酪乳酪桿菌應用于活菌型乳酸菌飲料中，不僅擁有良好的發(fā)酵特性，還能在貯藏期保持高活菌數(shù)。

本研究以分離自西藏拉薩地區(qū)當雄縣龍仁鄉(xiāng)自然發(fā)酵酸牦牛奶中的具有良好消化液耐受性及安全性的類干酪乳酪桿菌PC-01 為對象，基于菌株在不同溫度、pH 值下生長情況及其碳源、氮源利用能力對其進行鑒定和生物學特性研究，同時評價其在活菌型乳酸菌飲料中的發(fā)酵特性，為該菌株后續(xù)開發(fā)利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌株 菌株PC-01 由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學“乳品生物技術與工程” 教育部重點實驗室提供，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.17537。對照菌株類干酪乳酪桿菌（Lacticaseibacillus paracasei）LC-01，購自科漢森（中國）有限公司。

1.1.2 試驗試劑 MRS 培養(yǎng)基、革蘭氏染色試劑盒，北京陸橋技術股份有限公司；蛋白胨、酪蛋白胨、酵母浸粉、大豆蛋白胨、牛肉膏、乳糖，北京奧博星生物技術有限責任公司；蔗糖，北京化工廠；半乳糖，北京索萊寶科技有限公司；葡萄糖、乳糖，廣東西隴化工廠；甘露糖，麥克林中國；瓊脂粉，青島海博生物技術有限公司；API 50 CHL 試劑條，生物梅里埃公司；溶菌酶、RNase A 溶液、Gold-View，北京全式金生物技術有限公司；高通量測序試劑套裝BGISEQ-500RS（PE100）、通用DNA 文庫制備試劑套裝（MGIEasy），深圳華大智造科技有限公司；Qubit?dsDNA HS Assay Kit、Qubit?ss-DNA Assay Kit，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；細菌基因組DNA 提取試劑盒E.Z.N.A.?Bacterial DNA Kit，Omega Bio-tek 公司；脫脂乳粉，新西蘭恒天然集團。

1.1.3 試驗儀器與設備 立式低速離心機，德國Eppendorf 公司；光學顯微鏡Olympus BH-2，奧林巴斯有限公司；pH 計Five Easy，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；恒溫培養(yǎng)箱BHG-8082 型，上海一恒科學儀器有限公司；高壓滅菌鍋HG-50，日本HIRAYAMA 公司；Q800R2 超聲打斷儀，美國Sonicator 公司；Qubit 3.0 核酸熒光定量儀，賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 活化與培養(yǎng) 將凍存于甘油管中的類干酪乳酪桿菌PC-01 以2%接種量接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，在37 ℃下靜置培養(yǎng)24 h，傳代2～3 次后使用?；?qū)龃嬗诟视凸苤械念惛衫胰槔覘U菌PC-01 取一接種環(huán)于MRS 瓊脂培養(yǎng)基上四區(qū)劃線，在37 ℃下靜置培養(yǎng)48 h 后選取單菌落劃線，傳代2～3 次后使用。

1.2.2 菌株PC-01 多相分類學鑒定 按照細菌基因組DNA 提取試劑盒E.Z.N.A.?Bacterial DNA Kit 操作規(guī)程提取各菌株基因組DNA，使用MGIEasy 通用DNA 文庫制備試劑套裝進行建庫，將符合出庫標準的文庫按照BGISEQ-500RS 高通量測序試劑套裝的說明書完成DNA 納米球的制備、加載和上機測序。使用SOAPnuke v1.5.6 對下機原始數(shù)據(jù)進行過濾，去除接頭序列、PCR 重復序列和低質(zhì)量堿基序列（Phred 得分<20），利用SPAdes v3.11.0 進行序列拼接，獲得組裝基因組序列[9-10]。以模式菌株類干酪乳酪桿菌類干酪亞種（Lacticaseibacillus paracasei subsp.paracasei）JCM 8130T（GCF_000829035.1）、類干酪乳酪桿菌堅韌亞種（Lacticaseibacillus paracasei subsp.tolerans）DSM 20258T（GCF_001436485.1）為參考菌株，利用fastaANI（v 1.3）軟件對測序菌株進行ANI 分析。

將菌株PC-01 通過四區(qū)劃線接種到MRS 瓊脂培養(yǎng)基上，于37 ℃培養(yǎng)48 h 后，觀察培養(yǎng)基上菌落的形態(tài)特征[11-12]。使用API 50CH 鑒定系統(tǒng)對菌株PC-01 底物利用能力進行測定[13]。

1.2.3 菌株PC-01 生物特性研究 挑取MRS 瓊脂培養(yǎng)基上新鮮單菌落接種到5 mL MRS 液體培養(yǎng)基中，在37 ℃下靜置培養(yǎng)24 h 后作為接種種子液。

菌株在不同溫度下生長能力測定：將種子液以2%接種量接種于5 mL MRS 液體培養(yǎng)基中，分別放置于15，25，30，35，37，45，50 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液在600 nm 下吸光值（OD600nm）。

菌株在不同pH 值下生長能力測定：將種子液以2%接種量接種于初始pH 值為2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0 和11.0 的MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液在600 nm 下吸光值（OD600nm）。

菌株的最適生長溫度及產(chǎn)酸能力測定：根據(jù)菌株在不同溫度下生長能力試驗結果，選擇菌株最適生長溫度區(qū)間。將種子液以2%接種量接種于5 mL MRS 液體培養(yǎng)基中，分別放置于30，32.5，35 及37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每隔4 h 測定發(fā)酵液的pH 值及600 nm 下吸光值（OD600nm），并對發(fā)酵液進行活菌計數(shù)，繪制菌株在不同溫度下的生長曲線。

不同碳源、氮源對菌株生長的影響：將種子液以2%接種量接種于單碳源（葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖、蔗糖、甘露糖）或單氮源（牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉、大豆蛋白胨、酪蛋白胨、硫酸銨）MRS 培養(yǎng)基中，于37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液在600 nm 下吸光值（OD600nm）[14-16]。

1.2.4 菌株PC-01 對活菌型乳飲料的發(fā)酵特性及產(chǎn)品的貯藏穩(wěn)定性

1.2.4.1 活菌型乳飲料的制備及類干酪乳酪桿菌的發(fā)酵特性 質(zhì)量分數(shù)13.5%的脫脂乳粉和質(zhì)量分數(shù)2.5%的葡萄糖于45 ℃水合30 min 后分裝，121 ℃7 min 滅菌褐變，將類干酪乳酪桿菌PC-01及類干酪乳酪桿菌LC-01 分別以5×106CFU/mL接入冷卻后的褐變?nèi)橹?，?7 ℃發(fā)酵120 h，制備發(fā)酵基料，同時測定第0，24，48，72，96，120 h 發(fā)酵基料pH 值。

將檸檬酸∶乳酸=1∶2 配置30%酸液，95 ℃滅菌5 min，冷卻至20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

將發(fā)酵基質(zhì)∶白砂糖∶蒸餾水=25∶12∶63 混合，并用酸液調(diào)pH 值至3.7，于20 MPa 均質(zhì)后無菌灌裝，將產(chǎn)品分別置于4，10 ℃貯藏[17]。

1.2.4.2 活菌型乳飲料的貯藏穩(wěn)定性 將4，10℃貯藏的活菌型乳酸菌飲料分別于0，7，14，21，28 d 取樣，測定pH 值、滴定酸度及活菌數(shù)[18]。

pH 值測定：將活菌型乳酸菌飲料放置室溫后，采用精密pH 計測定。

滴定酸度測定：將活菌型乳酸菌飲料放置室溫后，按照國標GB 5009.239-2016[19]所規(guī)定的“酚酞指示劑法”進行測定。

活菌數(shù)測定：采用稀釋涂布平板法進行測定。

2 結果與分析

2.1 菌株PC-01 多相分類學鑒定

菌株PC-01 在MRS 瓊脂培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)48 h，菌落呈乳白色，圓形，表面濕潤，不透明，邊緣整齊。在顯微鏡下觀察，革蘭氏染色陽性，菌體呈現(xiàn)桿狀，單個或成對成串出現(xiàn)，菌體大小為0.4～0.5 μm×0.6～2.7 μm。其利用碳源產(chǎn)酸能力見表1。

圖1 菌株PC-01 菌落形態(tài)（a）與菌株PC-01菌體形態(tài)（b）Fig.1 Colony morphology of strain PC-01（a）and bacteria morphology of strain PC-01（b）

表1 菌株PC-01 的API 分析結果Table 1 API analysis results of strain PC-01

對菌株PC-01 和參考菌株進行全基因組測序，測序結果顯示試驗菌株測序深度大于300×，全基因組序列Q30 均在90%以上，滿足后續(xù)組裝及分析要求。ANI 于2007年由Goris 等[20]提出，兩個基因組序列之間的整體相似性，可以通過比較兩基因組之間的平均核苷酸一致性指出，ANI 值95%～96%與DNA-DNA 雜交值的70%相對應，可作為細菌物種鑒定的有效方法。選取模式菌株類干酪乳酪桿菌類干酪亞種JCM 8130T 和類干酪乳酪桿菌堅韌亞種DSM 20258T 的全基因組序列作為參考序列進行ANI 分析，結果表明，菌株PC-01 與兩株模式菌株全基因組序列的ANI 值分別為98.17%和98.06%，菌株PC-01 鑒定為類干酪乳酪桿菌（原副干酪乳桿菌）。

2.2 菌株PC-01 生物學特性

菌株生長pH 值范圍試驗結果如圖2所示，在培養(yǎng)基的起始pH 值為3～9 時，菌株PC-01 均能生長。隨著起始pH 值的升高，發(fā)酵液中生物量先上升后下降，在起始pH 值為7.0 時，菌株PC-01 生長最旺盛。PC-01 生長pH 值范圍廣，且對酸堿有著良好的耐受性，PC-01 在pH 值為2.5 的模擬胃液中處理3 h 后，轉(zhuǎn)移至pH 值為8.0 的模擬腸液中繼續(xù)消化8 h，通過活菌計數(shù)，菌株PC-01在經(jīng)過消化液后存活率為88.6%，有良好的消化液耐受性。能以活菌狀態(tài)進入人體腸道是益生菌的基本要求。

圖2 不同起始pH 值下菌株PC-01 生物量Fig.2 Biomass of strain PC-01 at different initial pH

菌株生長溫度范圍試驗結果表明（圖3），菌株PC-01 生長溫度范圍為15～50 ℃。隨著培養(yǎng)溫度的升高，PC-01 的生物量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，最適生長溫度范圍為30～37 ℃，當培養(yǎng)溫度達到50 ℃及以上時，菌株幾乎不生長。根據(jù)PC-01 生長溫度范圍結果，選取30，32.5，35，37 ℃對菌株PC-01 進行生長曲線及產(chǎn)酸能力的測定。

圖3 不同培養(yǎng)溫度下菌株PC-01 生物量Fig.3 Biomass of strain PC-01 at different temperatures

通過菌株PC-01 在不同培養(yǎng)溫度下的活菌數(shù)繪制的菌株生長曲線（圖4a），可以看出，在30，32.5，35，37 ℃這4 個溫度下，菌株PC-01 均在培養(yǎng)4 h 后進入對數(shù)生長期。在35 ℃和37 ℃兩個培養(yǎng)溫度下，PC-01 于16 h 進入穩(wěn)定期；在30 ℃和32.5 ℃兩個培養(yǎng)溫度下，PC-01 于20 h 進入穩(wěn)定期。到達穩(wěn)定期后，30 ℃和32.5 ℃兩個溫度下培養(yǎng)液中的活菌數(shù)可以達到35 ℃和37 ℃兩個溫度下活菌數(shù)的2～3 倍。根據(jù)菌株PC-01 在4 個溫度下的產(chǎn)酸曲線（圖4b）可以看出，在前24 h，溫度越高，pH 值下降速率越快；在第36 h，4 個溫度下發(fā)酵液的pH 值均下降到3.8。菌株PC-01 在相對較低的生長溫度下生長更快且穩(wěn)定期活菌數(shù)更高，具有制備單菌株低溫長時間發(fā)酵活性乳酸菌飲料的潛力。

圖4 不同溫度下菌株PC-01 的生長曲線（a）和產(chǎn)酸曲線（b）Fig.4 Growth curve（a）and acid production curve（b）of strain PC-01 at different temperatures

以無碳源MRS 培養(yǎng)基為基礎，在不改變其它成分的情況下，添加20 g/L 單一碳源。結果如圖5a所示，菌株PC-01 在以半乳糖為碳源的MRS 培養(yǎng)基中生長24 h 后，發(fā)酵液的吸光度最高，達到2.42；同時在以葡萄糖、乳糖和甘露糖為碳源的MRS 培養(yǎng)基中，菌株生長情況也十分優(yōu)異，發(fā)酵液吸光度均在2.0 以上；菌株PC-01 對蔗糖的利用能力最差。

以無氮源MRS 培養(yǎng)基為基礎，在不改變培養(yǎng)基其它成分的條件下，添加25 g/L 單一氮源。結果如圖5b 所示，在以酵母浸粉為單一氮源的MRS培養(yǎng)基中，菌株PC-01 生長24 h 后發(fā)酵液的吸光度明顯高于其它氮源，可以達到3.0 以上；同時，PC-01 對牛肉粉和大豆蛋白胨的利用能力也很好，發(fā)酵液吸光度可以達到2.0 以上；PC-01 對酪蛋白胨、蛋白胨和硫酸銨的利用能力較差。

圖5 菌株PC-01 對不同碳源（a）和氮源（b）的利用能力Fig.5 The utilization ability of strain PC-01 to different carbon sources（a）and nitrogen sources（b）

2.3 菌株PC-01 對活菌型乳酸菌飲料的發(fā)酵特性及產(chǎn)品的貯藏穩(wěn)定性

將菌株PC-01 應用于活菌型乳酸菌飲料的發(fā)酵，以商業(yè)化發(fā)酵劑類干酪乳酪桿菌LC-01 為對照，以5×106CFU/mL 接種量進行接種，在37 ℃下恒溫發(fā)酵120 h。由圖6a 可以看出，在起始菌量相近的情況下，菌株PC-01 發(fā)酵褐色乳飲料中活菌數(shù)增加更快。在發(fā)酵過程中，LC-01 和PC-01 發(fā)酵乳pH 值變化情況趨于一致（圖6b），無顯著差異（P＞0.05）。

圖6 活菌型乳酸菌飲料發(fā)酵過程活菌數(shù)（a）和pH 值變化（b）Fig.6 Changes in the number of viable bacteria（a）and pH（b）during the fermentation process of living lactic acid bacteria beverage

將以PC-01 和LC-01 制備的活菌型乳酸菌飲料分別置于4，10，25 ℃下貯藏28 d，貯藏期內(nèi)飲料的pH 值及滴定酸度變化見圖7a、7b?？梢钥闯鲈诓煌馁A藏溫度下，PC-01 及LC-01 制備的飲料pH 值及滴定酸度變化趨勢一致。隨著貯藏時間的延長，溫度越高pH 值下降越快，同時滴定酸度上升越快，產(chǎn)品后酸化越明顯。在4 ℃及10 ℃的貯藏條件下，PC-01 及LC-01 制備的飲料在貯藏期內(nèi)產(chǎn)品pH 值均保持在3.0 以上。

根據(jù)活菌型乳酸菌飲料在貯藏期內(nèi)產(chǎn)品活菌數(shù)的變化（圖7c）可以看出，隨著貯藏時間的延長，在4 ℃及10 ℃的貯藏條件下，產(chǎn)品的活菌數(shù)有所下降但維持在一個穩(wěn)定的范圍內(nèi)，PC-01 與LC-01 發(fā)酵產(chǎn)品活菌數(shù)在貯藏期內(nèi)無顯著差異（P＞0.05）。PC-01 發(fā)酵產(chǎn)品在4 ℃及10 ℃的貯藏溫度下，活菌數(shù)由10.5×107CFU/mL 分別下降到5.72×107CFU/mL 和 5.52×107CFU/mL；商業(yè)化菌株LC-01 發(fā)酵產(chǎn)品在4 ℃及10 ℃的貯藏溫度下，活菌數(shù)由10.20×107CFU/mL 分別下降到5.86×107CFU/mL 和5.57×107CFU/mL。當貯藏溫度為25℃時，兩株菌株發(fā)酵產(chǎn)品在貯藏期內(nèi)活菌數(shù)顯著下降，在第28 天時，產(chǎn)品中活菌數(shù)相較4 ℃及10℃貯藏樣品下降了一個數(shù)量級。但3 個貯藏溫度下，兩組產(chǎn)品在貯藏期內(nèi)活菌數(shù)均高于國標GB 7101-2015[21]及國標GB 21732-2008[22]中所要求的活性乳酸菌飲料在貨架期內(nèi)最低乳酸菌含量1.00×106CFU/mL。

圖7 活菌型乳酸菌飲料在不同貯藏溫度下pH 值（a）、滴定酸度（b）和活菌數(shù)（c）變化Fig.7 Changes in pH（a），titrated acidity（b）and viable bacteria count（c）of the lactic acid bacteria beverage with live bacteria at different storage temperatures

3 結論

本研究通過多相分類學鑒定技術對分離自西藏拉薩地區(qū)當雄縣龍仁鄉(xiāng)自然發(fā)酵酸牦牛奶中的菌株PC-01 進行鑒定。結果表明，菌株PC-01 符合乳桿菌的典型特征，通過全基因組測序比對分析，該菌株鑒定為類干酪乳酪桿菌（原副干酪乳桿菌）。

通過對菌株PC-01 的生物學特性研究表明，該菌株對pH 值耐受范圍廣，在培養(yǎng)基起始pH 值為3～9 時生長良好，與其對人工胃腸液良好的耐受性相一致，這也是菌株發(fā)揮其潛在益生特性的必要條件。通過菌株PC-01 生長溫度范圍試驗及其在不同溫度下的生長曲線可知，菌株PC-01 的最適生長溫度為32.5 ℃，在該溫度下，PC-01 生長、產(chǎn)酸速度快，且到達穩(wěn)定期時活菌數(shù)高。通過菌株PC-01 對單一碳源、氮源MRS 培養(yǎng)基的發(fā)酵試驗表明，碳源方面，該菌株對半乳糖及葡萄糖的利用能力強；氮源方面，該菌株對酵母浸粉的利用能力最強。綜合上述生物學特性，菌株PC-01 在相對低溫條件下生長、產(chǎn)酸能力強，具有做單菌株低溫發(fā)酵活菌型乳酸菌飲料發(fā)酵劑的潛力。

本研究將菌株PC-01 用于發(fā)酵活菌型乳酸菌飲料，并以商業(yè)化菌株LC-01 為對照。在相同發(fā)酵時間下，菌株PC-01 與LC-01 產(chǎn)酸速率沒有顯著差異，在相同時間到達發(fā)酵終點，且發(fā)酵終產(chǎn)品活菌數(shù)更高。在4 ℃及10 ℃的貯藏條件下，兩組產(chǎn)品在貯藏期始終保持高活菌數(shù)。在不同貯藏溫度下，PC-01 發(fā)酵產(chǎn)品與LC-01 發(fā)酵產(chǎn)品pH值及滴定酸度隨時間變化趨勢一致。利用菌株PC-01 發(fā)酵活菌型乳酸菌飲料，可與市售商業(yè)化菌株達到相同的效果，PC-01 具有巨大市場應用潛質(zhì)。