盧海強(qiáng)，陳 偉，黃 蕾，谷新晰，田洪濤

目前，有機(jī)磷類 （organophosphorus insecticides，OPs）和氨基甲酸酯類（carbamate insecticides，CBs）農(nóng)藥的不合理使用已嚴(yán)重威脅到農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量安全[1-3]。如何快速、靈敏及低成本的檢測農(nóng)副相關(guān)產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留，對于保障我國的食品安全具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前測定有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的方法主要有3 類，分別是色譜法[4]、免疫法[5]和酶抑制法[6]。其中酶抑制劑法檢測成本較低，可用于農(nóng)副產(chǎn)品生產(chǎn)的現(xiàn)場檢測，成為最有發(fā)展?jié)摿Φ臋z測方法，而乙酰膽堿酯酶是酶抑制法的核心材料。乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase，E.C.3.1.1.7）是生物神經(jīng)傳導(dǎo)中的關(guān)鍵酶，也是有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥作用的靶位點(diǎn)[7-8]。當(dāng)前，酶抑制劑法推廣的瓶頸主要是較高的酶制劑生產(chǎn)成本及酶對有機(jī)磷農(nóng)藥所表現(xiàn)出的較低的敏感性。

一般來說，酶制劑發(fā)展可分為3 個階段：第1階段是酶制劑主要從動物、植物和微生物體中直接提取[9-10]；第2 個階段是利用基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)酶基因的高效表達(dá)，擺脫原材料的束縛，降低酶的生產(chǎn)成本[11-12]；而第3 個階段主要是對酶制劑分子進(jìn)行改造，使它的催化效率、穩(wěn)定性及酶學(xué)性質(zhì)向著有利于實(shí)際應(yīng)用需求的方向改變，稱為酶的分子進(jìn)化[13]。目前，乙酰膽堿酯酶處于第1 階段發(fā)展末期和第2 階段初期的過渡階段，即大量的乙酰膽堿酯酶主要從生物體直接提取獲得，而該類方法獲得乙酰膽堿酯酶產(chǎn)量低、成本高，難以滿足檢測的需要。目前，眾多科研工作者對多種物種如魚、家蠶和菜葉蛾等來源的乙酰膽堿酯酶基因進(jìn)行克隆表達(dá)[14-16]，發(fā)現(xiàn)它們對有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的敏感性存在較大差異，其中魚源乙酰膽堿酯酶表現(xiàn)出較好的應(yīng)用潛力[17-18]。2009年，Sato等[19]選用pPICZα A 載體和P.pastoris X-33 宿主完成了對鯉魚來源的乙酰膽堿酯酶基因的克隆表達(dá)，然而，酶的表達(dá)量偏低（181 mU/mL ± 31 mU/mL）。2019年，Liang[20]等采用細(xì)胞表面展示技術(shù)對CpAChE 進(jìn)行研究，取得較好的效果，然而，該酶表達(dá)量不高的問題依然制約其在食品農(nóng)藥殘留檢測中的應(yīng)用。

本研究以鯉魚乙酰膽堿酯酶基因（CpAChE）為研究對象，依據(jù)畢赤酵母的密碼子偏好性對該基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，獲得乙酰膽堿酯酶優(yōu)化基因CpAChEopt。采用pPIC9K 及畢赤酵母（Pichia pastoris）GS115 表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行高效表達(dá)。通過對重組CpAChE 的酶學(xué)性質(zhì)表征及其對有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥敏感性的研究，為乙酰膽堿酯酶在食品農(nóng)藥殘留檢測中的應(yīng)用提供依據(jù)。利用分子對接模擬重組乙酰膽堿酯酶與克百威的作用，尋找潛在的結(jié)合殘基，為后續(xù)酶的定向改造提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Easy Taq DNA 聚合酶、dNTPs（2.5 mmol/L）、T4 DNA 連接酶和限制性內(nèi)切酶Ecol I、Not I 和BglⅡ，TaKaRa 公司；質(zhì)粒小提中量試劑盒、DNA回收試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司；二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）、典化硫代乙酰膽堿，索萊寶生物科技有限公司；有機(jī)磷農(nóng)藥、氨基甲酸酯類農(nóng)藥，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所；其它化學(xué)試劑為分析純。

1.2 菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基

巴斯德畢赤酵母GS115、質(zhì)粒pPIC9k 和大腸桿菌DH5α 由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

LB 培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母抽提物5 g，NaCl 1 g，pH 7.0，定容至1 L，滅菌備用。

YPD 培養(yǎng)基：酵母浸膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，定容至1 L，滅菌備用。

BMGY 培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/L，酵母抽提物10 g/L，磷酸鉀緩沖液 （pH 6.0，100 mmol/L），YNB 13.4 g/L，0.016 μmol/L 生物素，甘油10 g/L。

BMMY 培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/L，酵母抽提物10 g/L，磷酸鉀緩沖液 （pH 6.0，100 mmol/L），YNB 13.4 g/L，0.016 μmol/L 生物素，甲醇10 g/L。

1.3 方法

1.3.1 乙酰膽堿酯酶基因的優(yōu)化與合成 為提高乙酰膽堿酯酶（AChE）在巴斯德畢赤酵母GS115中的表達(dá)量，依據(jù)密碼子使用數(shù)據(jù)庫（http：//cazusa.or.jp/codon）信息，優(yōu)化乙酰膽堿酯酶基因（AB361595）低頻氨基酸密碼子（<10‰），且對基因各區(qū)段GC 含量進(jìn)行優(yōu)化，使GC 含量均保持在50%左右。在目的基因5' 端和3' 端分別添加EcoR I （GAATTC） 酶切位點(diǎn)和Not I（GCGGCCGC）酶切位點(diǎn)，優(yōu)化后的乙酰膽堿酯酶基因（CpAChEopt）由金斯瑞生物科技公司合成。

1.3.2 重組菌株的構(gòu)建 分別將pUC57-CpAChEopt 質(zhì)粒和pPIC9K 質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切（EcoR I 和Not I），利用膠回收試劑盒對酶切產(chǎn)物進(jìn)行回收，并進(jìn)行CpAChEopt 和pPIC9K 片段的連接反應(yīng)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K-CpAChEopt，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)中。采用通用引物5’AOX 和3’AOX 對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌液PCR 驗(yàn)證，將陽性轉(zhuǎn)化子送至北京中科希林生物科技有限責(zé)任公司進(jìn)行測序。將測序正確的菌株進(jìn)行培養(yǎng)，利用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒pPIC9KCpAChEopt，使用限制性內(nèi)切酶Bgl Ⅱ?qū)χ亟M質(zhì)粒pPIC9K-CpAChEopt 進(jìn)行線性化，線性化產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化至P.paster GS115 宿主中，參照畢赤酵母表達(dá)手冊進(jìn)行陽性轉(zhuǎn)化子的篩選。

1.3.3 重組菌株誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE 分析 挑取陽性轉(zhuǎn)化子至YPD 培養(yǎng)基（50 mL）中培養(yǎng)12 h（30 ℃，250 r/min）后，取2 mL 轉(zhuǎn)接至200 mL BMGY 中，在搖床30 ℃培養(yǎng)48 h 后（8 000 g 離心10 min 收集細(xì)胞） 重懸于100 mL 甲醇體積分?jǐn)?shù)為0.5%的BMMY 培養(yǎng)基中誘導(dǎo)72 h，每間隔24 h補(bǔ)加甲醇，離心收集發(fā)酵液，即為粗酶液，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)分析。

1.3.4 乙酰膽堿酯酶活性的測定 酶活測定參照Ellman 等[21]的方法并進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整：取50 μL 適當(dāng)稀釋的酶液和50 μL 碘化硫代乙酰膽堿，在pH 8.0（磷酸鹽緩沖液，0.1 mol/L）的緩沖液中，25 ℃反應(yīng)10 min 后，加入50 μL 的SDS（10%）溶液終止反應(yīng)，隨后加入50 μL DTNB（2 mmol/L）進(jìn)行顯色，顯色穩(wěn)定后在波長412 nm 處測定吸光值。

酶活單位（IU）：以每分鐘水解1 μmol 碘化硫代乙酰膽堿的酶量定義為1 個酶活單位（IU）。

1.3.5 重組乙酰膽堿酯酶的酶學(xué)性質(zhì)測定

1.3.5.1 pH 值對重組酶活性的影響 將重組乙酰膽堿酯酶酶液分別在pH 5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5 和9.0 條件下進(jìn)行催化反應(yīng)，測定重組酶CpAChE 的酶活力，以酶活力最高值為100%計算，分析該酶的pH 值反應(yīng)范圍。將重組酶CpAChE 在pH 2.0～12.0 的條件下，0 ℃處理1 h，對照組為未進(jìn)行處理的酶，參照1.3.4 節(jié)方法測定酶活力，以酶活力最高值為100%計算分析其pH值耐受性。

1.3.5.2 溫度對重組酶活性的影響 將重組酶CpAChE 在最適pH 值下，分別在10，20，25，30，35，40，45 ℃的溫度條件下測定重組酶CpAChE 的酶活力，以酶活力最高值為100%計算，分析該酶的溫度反應(yīng)范圍。將重組酶在15，25，35，45 ℃的溫度條件下，孵育0，10，20，30，60 min 后，測定剩余酶活力，以酶活力最高值為100%計算分析其熱穩(wěn)定性。

1.3.5.3 有機(jī)試劑及金屬離子對重組酶活性的影響 在最適合反應(yīng)條件下，分別測定丙酮、乙醇、尿素、CTAB、吐溫、SDS 和9 種金屬離子下的CpAChE 酶活力，探究化學(xué)試劑和金屬離子對酶活性的影響，為該酶的應(yīng)用提供必要的指導(dǎo)。

1.3.6 重組酶農(nóng)藥敏感性和動力學(xué)參數(shù)的測定農(nóng)藥敏感性試驗(yàn)參考何紹志等[22]方法：取50 μL適當(dāng)稀釋酶液，25 μL 碘化硫代乙酰膽堿溶液（8 mmol/L）和75 μL 不同濃度農(nóng)藥溶液（pH 8.0）混合均勻，25 ℃反應(yīng)10 min 后，加入50 μL 的SDS（10%）溶液終止反應(yīng)，隨后加入50 μL 的DTNB（2 mmol/L）進(jìn)行顯色，顯色穩(wěn)定后在412 nm 處測定吸光值ΔAx。對照為不添加農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)酶活測定值ΔA0。根據(jù)下式計算抑制率：（ΔA0-ΔAX）/ΔA0×100%，并計算農(nóng)藥對CpAChE 的抑制中濃度IC50。配制0.5，1，2，4，8，10 mg/mL 的ATCHI 底物溶液，依據(jù)Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)法計算動力學(xué)參數(shù)Km及Vmax。

1.3.7 重組酶與克百威的分子對接 利用BLAST 程序從NCBI 的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中找到與CpAChE 序列相似且結(jié)構(gòu)已知的乙酰膽堿酯酶，將其結(jié)構(gòu)作為模板，利用Discovery studio 2.5中的MODELER module 模塊對CpAChE 進(jìn)行同源建模；并用PROCHECK、ERRAT 和ProSA 軟件對所得模型的質(zhì)量進(jìn)行評估，獲得CpAChE 的三維結(jié)構(gòu)模型。從NCBI 網(wǎng)站化學(xué)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（http：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov） 獲得小分子克百威（CID：2566，MF：C12H15NO3）的結(jié)構(gòu)，用Autodock中的Libdock 模塊進(jìn)行分子對接，采用Pymol 軟件進(jìn)行對接模型的可視化分析。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析及處理 每次試驗(yàn)平行測定3次，利用Excel 2010 和SPSS 19.0 等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙酰膽堿酯酶基因分析

乙酰膽堿酯酶基因（CpAChE）經(jīng)密碼子優(yōu)化后，GC 含量由33%～66%調(diào)整為45%～55%范圍內(nèi)，密碼子適應(yīng)指數(shù)（CAI）由0.67 優(yōu)化為0.88，優(yōu)化前后的序列一致性為77%。乙酰膽堿酯酶CpAChE 由前22 氨基酸的信號肽和催化區(qū)域組成，其中膽堿結(jié)合位點(diǎn)為Trp108，推測該酶分子可形成3 對二硫鍵，分別是Cys 91-Cys 118、Cys 275-Cys290、Cys 427-Cys580。大多數(shù)乙酰膽堿酯酶在C 端含有T 肽，主要起連接各個單鏈分子形成聚合物體的作用，而大量證據(jù)表明，T 肽結(jié)構(gòu)阻礙基因的異源高效表達(dá)[23]。

2.2 重組酶的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE 分析

參照畢赤酵母表達(dá)手冊要求進(jìn)行重組菌株的培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)測定，發(fā)酵上清液的乙酰膽堿酯酶酶活為7.4 U/mL，是Sato 等[19]報道的該酶表達(dá)量的40 倍，這表明利用密碼子優(yōu)化實(shí)現(xiàn)了酶的高效表達(dá)。酶液經(jīng)SDS-PAGE 分析，結(jié)果如圖1所示。在約50 ku 處出現(xiàn)目標(biāo)蛋白條帶，而這與CpAChE 的蛋白理論分子質(zhì)量（66.84 ku）存在一定的差異。這很可能與P.pastoris GS115 菌株所分泌內(nèi)源性蛋白酶降解有關(guān)。經(jīng)分析，該氨基酸序列存在3 個“Lys-Arg”蛋白酶酶切位點(diǎn)和3 個“Arg-Arg”蛋白酶酶切位點(diǎn)。該蛋白分子經(jīng)Endo H 處理后，片段大小并未發(fā)生變化，表明N 糖基化并未對該酶進(jìn)行后修飾加工。

圖1 重組乙酰膽堿酯酶CpAChE 的SDS-PAGE電泳分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of the recombinant CpAChE

2.3 重組酶CpAChE 酶學(xué)性質(zhì)分析

參考周思多等[23]的報道，以SDS 為終止劑開展重組酶CpAChE 的酶學(xué)性質(zhì)研究，結(jié)果如下。經(jīng)測定（圖2a），重組酶CpAChE 的最適反應(yīng)pH 值為8.0，當(dāng)pH 值低于5.0 時，該酶活性無法被檢測到。由于當(dāng)pH 值大于9.0 之后，底物降解所造成的本底干擾非常嚴(yán)重，因此堿性條件下的乙酰膽堿酯酶活性還需進(jìn)一步探究。經(jīng)pH 穩(wěn)定性測定（圖2b），發(fā)現(xiàn)該酶在堿性條件（pH 7.0，11.0）下能使酶活性保持在95%以上，相對穩(wěn)定，而該酶在pH 2.0，6.0 處理1 h 后，CpAChE 剩余酶活性低于80%，且隨著pH 值的降低而減弱。重組酶CpAChE 的最適反應(yīng)溫度為25°C，其活性反應(yīng)溫度范圍為10～45°C（圖2c），結(jié)果表明該酶非常適合常溫反應(yīng)。重組酶CpAChE 在15 ℃和25 ℃條件下，處理1 h 酶活性保持不變，活力穩(wěn)定 （圖2d）。隨著溫度的提高，該酶的穩(wěn)定性越來越差，在35 ℃處理1 h 后，CpAChE 相對酶活僅損失20%，而45 ℃處理20 min 后，CpAChE 活性完全喪失。

圖2 乙酰膽堿脂酶CpAChE 的酶學(xué)性質(zhì)分析Fig.2 The characterization of recombinant CpAChE

2.4 化學(xué)試劑及金屬離子對重組酶活性的影響

酶在實(shí)際應(yīng)用時，除了受自身的性質(zhì)影響外，往往受到具體的環(huán)境因素的干擾，而化學(xué)試劑及金屬離子就是比較重要的外界因素。由表1可知，多種有機(jī)試劑及表面活性劑對酶活力的影響存在差異，且不同濃度也存在差異。丙酮、乙醇、尿素、CTAB、吐溫80 和SDS 均對重組酶CpAChE 活性有抑制作用，抑制作用隨著試劑濃度的提高而增強(qiáng)，而乙醇對重組酶CpAChE 活性抑制作用相對較弱。經(jīng)對9 種金屬離子對重組酶CpAChE 活性的影響分析發(fā)現(xiàn)，Mg2+、K+、Ca2+和Li+離子對該酶活性有較強(qiáng)的促進(jìn)作用，其中Mg2+（5 mmol/L）的促進(jìn)最為明顯，使該酶活力提高約1.7 倍，而Cu2+、Fe3+和Zn2+離子則對該酶表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用。

表1 有機(jī)溶劑及金屬離子對CpAChE 活性的影響Table 1 Effects of various organic solvents and metal ions on the activity of recombinant CpAChE

2.5 重組酶CpAChE 對農(nóng)藥的敏感性測定

重組酶CpAChE 與16 種有機(jī)磷和氨基甲酸類農(nóng)藥的敏感性如表2所示，結(jié)果表明不同農(nóng)藥對CpAChE 活性抑制存在差異，16 種農(nóng)藥對CpAchE 的IC50由小到大順序?yàn)椋嚎税偻?涕滅威<甲拌磷<敵敵畏<仲丁威<久效磷<樂果<毒死蜱<對硫磷<倍硫磷<西維因<馬拉硫磷<葉蟬散<殘殺威<速滅威<抗蚜威。8 種有機(jī)磷農(nóng)藥對CpAchE 的IC50差異較小，而氨基甲酸酯類農(nóng)藥對CpAChE 的IC50差異較大，其中CpAChE 對克百威的敏感性最強(qiáng)，IC50為0.176 μg/mL，而對速滅威和抗蚜威的敏感性很弱，IC50分別為17.0 μg/mL 和182.7 μg/mL。由IC15結(jié)果可知，重組酶對上述16 種農(nóng)藥的檢查范圍為0 至3.0 μg/mL 不等，而對克百威檢查最為敏感，綜上可以確定重組CpAChE 可以用于多種有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的檢測。在一級反應(yīng)時間之內(nèi)（10 min），重組CpAChE 的動力學(xué)常數(shù)Km和Vmax分別為1.639 mg/mL 和8.071 μmol/min/mg。

表2 重組乙酰膽堿酯酶對農(nóng)藥敏感性分析Table 2 Sensitivity and the limit of detection of recombinant CpAChE to pesticides

（續(xù)表2）

2.6 乙酰膽堿酯酶與克百威分子對接模型分析

以數(shù)據(jù)庫中的乙酰膽堿酯酶（PDB：1f8u，PDB：2w6c，PDB：2x8b 和PDB：4bdt） 作為模板，利用Discovery studio 2.5 中的MODELER module 模塊對CpAChE 進(jìn)行同源建模，得到的模型經(jīng) Ramachandran 圖評估，該模型蛋白中的83.0%氨基酸在核心區(qū)域?yàn)椋ˋ，B，L 區(qū)），11.7%的氨基酸分布在允許區(qū)域（a，b，l，p 區(qū)），3.2%的氨基酸分布在額外接受區(qū)域（～a，～b，～l，～p 區(qū)），僅有2.2%的殘基落在不允許區(qū)域內(nèi)（空白區(qū)），約98%以上的氨基酸構(gòu)象合理，表明所構(gòu)建的氨基酸構(gòu)型穩(wěn)定。用Profile-3D 對分子模型中氨基酸序列的相容性進(jìn)行評價表明，92.7%的氨基酸Verify score 大于0.2，氨基酸殘基側(cè)鏈合理，上述分析表明模型的構(gòu)建是成功的。

配體克百威和受體膽堿酯酶CpAChE 模型對接，通過CDOCKER ENERGY 打分后，選擇最適的結(jié)合構(gòu)象，由圖3可知，配體克百威分子進(jìn)入到了CpAChE 分子的活性口袋[24]。由于配體分子在結(jié)合物中的結(jié)合構(gòu)象的不同，從而使得它們形成相互作用的活性位點(diǎn)周圍的氨基酸殘基以及相互作用強(qiáng)弱均不同。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，重組乙酰膽堿酯酶CpAChE 與底物克百威3? 范圍內(nèi)的氨基酸共19 個，其中以范德華力發(fā)揮作用的氨基酸16個，分別是Asp96、Ile105、Trp108、Asn109、Gly142、Gly143、Gly144、Glu224、Tyr155、Ser225、Ala226、Phe315、Phe356、His495、Gly496 和Ile499，而以氫鍵作用力發(fā)揮作用的氨基酸是Tyr146、Ser147 和Tyr355，是與克百威作用的最為關(guān)鍵的氨基酸。由此可見，二者在結(jié)合過程中所產(chǎn)生的范德華力和氫鍵可使小分子克百威與CpAChE 緊密結(jié)合，進(jìn)而競爭性抑制CpAChE 酶活性。

圖3 乙酰膽堿酯酶CpAChE 的分子模型及與克百威結(jié)合位點(diǎn)分析Fig.3 Molecular model of the recombinant CpAChE and docking results with carbofuran

3 討論

自發(fā)現(xiàn)乙酰膽堿酯酶（AChE）可用于農(nóng)藥殘留的檢測之后[25-27]，人們對乙酰膽堿酯酶的挖掘，提高酶的靈敏性和降低生產(chǎn)成本等方面的研究從未停止過。乙酰膽堿酯酶主要來自脊椎動物和非脊椎動物，而大量研究表明不同來源的乙酰膽堿酯酶對農(nóng)藥的敏感性存在較大差異，其中脊椎動物中的魚類普遍對OPs 和CBs 殺蟲劑有較強(qiáng)敏感性[28]。Chuiko[29]通過對來自白鮭科、狗魚科、鱸科和鯉科類的11 種魚的AChE 研究發(fā)現(xiàn)，鯉科魚較其它3 類魚不僅表現(xiàn)出較高的酶活性，同時靈敏性也非常突出。雖然鯉科魚類的AChE 性質(zhì)突出，但是由于問題的復(fù)雜性及相關(guān)技術(shù)的不成熟，近十年，鯉魚來源乙酰膽堿酯酶的研究才進(jìn)入到分子時代，這與非脊椎動物為代表的果蠅、家蠶和線蟲來源的AChE 等研究深度還有一定的差距。

迄今為止，包括昆蟲、動物細(xì)胞和植物在內(nèi)的表達(dá)系統(tǒng)已成功對AChE 進(jìn)行了表達(dá)，但由于操作的復(fù)雜性和較高的生產(chǎn)成本致使其并不適合大規(guī)模生產(chǎn)乙酰膽堿酯酶[30-32]。巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）系統(tǒng)[33]能夠?qū)ν庠椿虍a(chǎn)物進(jìn)行修飾，如糖基化和生成二硫鍵等，遺傳操作簡便，僅使用純試劑進(jìn)行培養(yǎng)，如甲醇、葡萄糖或甘油、生物素、無機(jī)鹽和水。此外，巴斯德畢赤酵母細(xì)胞可以高密度培養(yǎng)，分泌的內(nèi)源性蛋白水平低，且在AOX1 啟動子控制下高水平表達(dá)異源蛋白，使得巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)廣泛被用于真核基因的表達(dá)。該系統(tǒng)中的表達(dá)載體主要有pPICZα A、pPSC3k 和pPIC9K 等，常用的宿主菌主要有GS115、X-33 和KM71 等，畢赤酵母中不同的表達(dá)質(zhì)粒和宿主的組合差異會對酶的表達(dá)量和性質(zhì)造成顯著影響[34]，重組乙酰膽堿酯酶CpAchE 在SDS-PAGE 分析中，目標(biāo)條帶大小與理論大小存在差異，其原因很可能是巴斯德畢赤酵母的內(nèi)源蛋白酶切割CpAchE 所致。乙酰膽堿酯酶基因CpAChE 中存在多個Kex2 蛋白酶酶切位點(diǎn)（6處），同時CpAChE 中存在6 個潛在的N 糖基化位點(diǎn)未受到宿主的糖基化修飾，使得蛋白的分子質(zhì)量大小與理論值存在差異，而這與Sato 等[19]研究結(jié)果存在差異，表明不同的宿主和載體可對酶的性質(zhì)造成不同影響。本研究采用pPIC9K 質(zhì)粒和GS115 宿主對優(yōu)化后鯉魚乙酰膽堿酯酶基因CpAChE 進(jìn)行重組表達(dá)，使鯉魚乙酰膽堿酯酶CpAChE 的表達(dá)量提高了40 倍。

CpAChE 對本研究中檢測的16 種有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥中的14 種表現(xiàn)出一定的敏感性（IC50值均<4 μg/mL）?？傮w而言，CpAChE 對氨基甲酸酯類農(nóng)藥表現(xiàn)出更強(qiáng)的敏感性，其中對克百威表現(xiàn)出最高的敏感性，這與Dembele 等[35]報道相一致。分子對接分析中發(fā)現(xiàn)，克百威分別與受體CpAChE 中的Tyr146、Ser147 和Tyr355 形成氫鍵，這些氫鍵網(wǎng)絡(luò)增強(qiáng)了克百威與CpAchE 的結(jié)合能力，因此加強(qiáng)了與底物競爭CpAChE 能力。除此之外，有機(jī)小分子和蛋白質(zhì)等生物大分子之間的疏水作用力和范德華力也發(fā)揮重要作用。

本研究利用巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)對優(yōu)化的乙酰膽堿酯酶基因進(jìn)行了高效表達(dá)，該酶可用于常見農(nóng)藥殘留的檢測，其中對克百威的檢測最為靈敏，克百威主要通過與重組CpAChE 形成穩(wěn)定的復(fù)合體達(dá)到抑制酶活性的效果，而Tyr146、Ser147 和Tyr355 很可能在其中發(fā)揮更加重要的作用。