馬金爽，韋少睜，王瀟哲，陳園園，劉紅*

（1.海南師范大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，海南?？?71158；2.海口市熱帶特色藥食同源植物研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南?？?71158）

蛋黃果為山欖科植物，原產(chǎn)于美洲，廣泛分布于南美洲和亞熱帶，中國(guó)海南、廣東、廣西均有種植[1-2]。蛋黃果果實(shí)近圓形，有一至四粒堅(jiān)硬的種子[3]。果肉呈黃色，可以鮮食，也可用于制作冰淇淋、蛋羹、奶昔和果醬[4]。蛋黃果含有豐富的維生素C、蛋白質(zhì)、淀粉、酚類物質(zhì)，具有重要的生物活性[5-6]。植物多酚能夠有效地清除自由基，可以減少冠心病、癌癥的發(fā)生，是一種天然的抗氧化劑[7]。蛋黃果是一種優(yōu)質(zhì)的熱帶水果，關(guān)于蛋黃果的研究多集中于栽培及營(yíng)養(yǎng)成分、抗氧化等方面[8-9]，關(guān)于果肉和種子多酚提取工藝與抗氧化比較的研究還尚未見報(bào)道。

植物多酚的提取率與溫度、時(shí)間和溶劑等多因素有關(guān)。本文首先利用超聲波法輔助提取蛋黃果的果肉和種子多酚，然后采用單因素試驗(yàn)方法，考察提取時(shí)間、提取溫度、料液比和提取劑濃度對(duì)果肉和種子多酚提取率的影響，最后再采用響應(yīng)曲面法對(duì)果肉和種子多酚的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以獲得最佳提取條件[10-11]。本研究通過響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取蛋黃果的果肉和種子多酚的工藝條件，評(píng)價(jià)果肉和種子多酚的抗氧化活性，為蛋黃果的營(yíng)養(yǎng)保健加工提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蛋黃果：市售；福林酚試劑、DPPH：美國(guó)Sigma公司；抗壞血酸、石油醚、水楊酸、鄰苯三酚（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

DHG-9070A恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海申賢恒溫設(shè)備廠；LGJ-10冷凍干燥箱：北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器；XO-5200DTS超聲波清洗儀：南京先歐儀器制造有限公司；722可見分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司；H50循環(huán)水冷卻恒溫器：北京萊伯泰科技儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

優(yōu)選成熟的蛋黃果，用手剝離果肉和種子。將果肉打漿、冷凍干燥后粉碎，過60目篩；將種子置于50℃的烘干箱中烘干，粉碎，過60目篩。使用石油醚脫去上述兩種粉中脂肪，再置于40℃烘箱中干燥，儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

配制濃度為0.1 mg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，準(zhǔn)確量取 0.00、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL 于 7 個(gè)25 mL容量瓶，分別加2mL蒸餾水搖勻，分別加2mol/L福林酚試劑1.0mL，靜置8 min，加入10%的無水碳酸鈉溶液3 mL，定容，避光水?。?5℃）2 h，在765 nm處測(cè)定吸光度，繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線[12]?；貧w方程為Y=84.6785X-0.00161，R2=0.998 7。

1.2.3 多酚的提取與測(cè)定

以一定濃度的乙醇為提取劑，分別稱量1.0 g果肉和種子粉末于錐形瓶中，在超聲功率200 W、提取時(shí)間100 min、提取溫度 50 ℃、料液比 1∶20（g/mL）的條件下對(duì)多酚進(jìn)行提取，過濾，定容于50 mL容量瓶，取樣品液1 mL按照上述操作測(cè)定吸光度，計(jì)算多酚提取率。計(jì)算公式如下。

式中：X為多酚提取率，%；m為樣品質(zhì)量，g；c為提取液多酚的質(zhì)量濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；n為稀釋倍數(shù)。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

以蛋黃果果肉和種子多酚提取率為指標(biāo)，考察并分析提取劑（乙醇）濃度（30%、40%、50%、60%、70%）、提取時(shí)間 （40、60、80、100、120、140 min）、 提取溫度（30、40、50、60、70、80 ℃）以及料液比[1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g/mL）]等單一因素對(duì)多酚提取率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素提取試驗(yàn)結(jié)果，選擇多酚提取時(shí)間、提取溫度、乙醇濃度作為自變量，蛋黃果的果肉和種子多酚提取率作為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，經(jīng)擬合二次多項(xiàng)回歸方程最終確定最佳多酚提取工藝。

1.2.6 多酚的抗氧化活性研究

1.2.6.1 多酚的提取制備

按照響應(yīng)面法優(yōu)化的最佳條件提取蛋黃果的果肉和種子多酚，分別配制不同濃度的樣品液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）進(jìn)行抗氧化活性試驗(yàn)。

1.2.6.2 抗氧化性測(cè)定

DPPH自由基清除率的測(cè)定：參照Brand-Williams等[13]方法稍作修改，準(zhǔn)確量取2 mL的樣品液和2 mL 1 mmol/L DPPH溶液，搖勻并于25℃避光反應(yīng)30 min，測(cè)定517 nm處的吸光度，計(jì)算清除率。

·OH清除率的測(cè)定：根據(jù)RE等[14]方法稍作修改，加入各2 mL的6 mmol/LFeSO4、水楊酸和H2O2溶液，避光水?。?7℃）反應(yīng)1 h。測(cè)定520 nm處的吸光度，計(jì)算清除率。

O2-自由基清除率的測(cè)定：參照王宗君等[15]方法稍作修改。取2 mL樣品，依次加入5 mL的0.05 mol/L Tris-HCl緩沖溶液、1 mL 0.05 mol/L鄰苯三酚溶液和0.2mL的0.05mol/LHCl溶液，反應(yīng)10min，記錄325nm處的吸光度，計(jì)算清除率。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)重復(fù)3次。響應(yīng)面設(shè)計(jì)利用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行處理，其余均采用Origin 8.5軟件作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對(duì)果肉和種子多酚提取率的影響

乙醇濃度對(duì)多酚提取率的影響見圖1。

圖1 乙醇濃度對(duì)多酚提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction of polyphenols

影響多酚提取效果的一項(xiàng)重要因素是乙醇溶液濃度[16]，隨著乙醇濃度的增加，多酚提取率呈先升后降的趨勢(shì)。乙醇濃度在30%～40%，種子多酚提取率明顯上升，在40%之后逐漸下降。果肉多酚提取率在乙醇濃度30%～50%呈直線上升，而后緩慢下降。因?yàn)橹参矬w內(nèi)的水溶性多酚分布在細(xì)胞的液泡中，而非水溶性的多酚物質(zhì)存在于細(xì)胞壁上，且多與蛋白質(zhì)或多糖類物質(zhì)以氫鍵結(jié)合。低體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，而高體積分?jǐn)?shù)的乙醇會(huì)引起蛋白質(zhì)變性，阻止多酚類物質(zhì)的傳質(zhì)過程，從而降低多酚的提取率。因此，選擇50%和40%的乙醇溶液分別作為果肉和種子多酚的提取溶劑。

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)果肉和種子多酚提取率的影響

提取時(shí)間對(duì)多酚提取率的影響見圖2。

圖2 提取時(shí)間對(duì)多酚提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction of polyphenols

為了研究提取時(shí)間對(duì)果肉和種子多酚提取率的影響，設(shè)置提取時(shí)間為40 min～140 min。 提取時(shí)間的延長(zhǎng)，有利于果肉和種子多酚的提取率的提高，而提取時(shí)間超過100 min，果肉和種子多酚提取率隨之下降。超聲輔助提取植物多酚時(shí)可加速植物多酚從細(xì)胞壁中釋放從而影響多酚提取率，植物多酚的結(jié)構(gòu)受提取時(shí)間過長(zhǎng)影響而遭到破壞，引起植物多酚提取率顯現(xiàn)明顯下降的趨勢(shì)[17]。因此，果肉和種子多酚的最佳提取時(shí)間為100 min。

2.1.3 提取溫度對(duì)果肉和種子多酚提取率的影響

提取溫度對(duì)多酚提取率的影響見圖3。

圖3 提取溫度對(duì)多酚提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction of polyphenols

提取溫度高低直接影響多酚提取率，由圖3可知，溫度在30℃～60℃，果肉和種子多酚提取率呈上升趨勢(shì)，當(dāng)溫度達(dá)到60℃時(shí)，果肉和種子多酚提取率達(dá)到最大值。溫度影響分子運(yùn)動(dòng)速度，升高溫度加快多酚提取率的提高。當(dāng)提取溫度高于60℃時(shí)，種子和果肉多酚提取率均有下降。多酚在較高溫度可能發(fā)生氧化或者降解[18]，因此，果肉和種子多酚的最佳提取溫度為60℃。

2.1.4 料液比對(duì)果肉和種子多酚提取率的影響

料液比對(duì)果肉和種子多酚提取率如圖4所示。

圖4 料液比對(duì)多酚提取率的影響Fig.4 Effect of ratio of material to water on extraction of polyphenols

料液比在 1∶10（g/mL）～1∶30（g/mL）時(shí)，果肉和種子多酚提取率呈上升趨勢(shì)，這是由于隨著溶劑量的增加，多酚易于擴(kuò)散、溶解。當(dāng)料液比為 1∶30（g/mL）時(shí)，果肉和種子多酚的提取率最大，繼續(xù)增加溶劑量，果肉和種子多酚的提取率稍有下降，較為平緩，這可能是提取過程中有一些多糖等雜質(zhì)干擾[19]。因此，選擇料液比1∶30（g/mL）作為果肉和種子多酚的提取條件。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化多酚的提取工藝

2.2.1 模型擬合和統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，多酚提取率與三因素（乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度）有關(guān)，因此，響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取蛋黃果的果肉和種子多酚的自變量設(shè)為乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度，三因素三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)以及試驗(yàn)結(jié)果（種子/果肉）見表1。

表1 Box-benkhen試驗(yàn)設(shè)計(jì)和多酚提取率Table 1 Box-benkhen design and extraction yield of polyphenols

得到的二次多項(xiàng)式回歸模型方程為：Y種子=2.60+0.012A+0.012B+0.01C+0.013AB-0.002 5AC+0.023BC-0.22A2-0.15B2-0.13C2；Y果肉=0.69+0.043A+0.013B+0.020C-0.030AB+0.065AC+0.005BC-0.13A2-0.082B2-0.13C2。

果肉多酚提取工藝回歸模型的方差結(jié)果見表2。

表2 果肉回歸模型方差分析Table 2 Analysis of variance of the pulp regression model

模型的顯著性與F值和p值有關(guān)[20]。果肉多酚提取模型的 F 值=67.68，p＜0.000 1，R2=0.988 6，R2adj=0.974 0，顯示模型顯著且擬合程度較好；果肉多酚模型的C.V.%為3.63%，表明試驗(yàn)值的精確性和可靠性較好。果肉回歸模型中一次項(xiàng) A，二次項(xiàng) A2、B2、C2，交互項(xiàng) AC 為極顯著性差異（p＜0.01）；一次項(xiàng)C、交互項(xiàng)AB表現(xiàn)為顯著性差異（p＜0.05），而一次項(xiàng)B、交互項(xiàng)BC為不顯著（p＞0.05），表明乙醇濃度對(duì)果肉多酚提取率影響較小，結(jié)合F值可知各因素的影響大小為提取溫度（A）＞提取時(shí)間（C）＞乙醇濃度（B）。

種子多酚回歸模型的方差結(jié)果見表3。

表3 種子回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of the seed regression model

種子多酚提取模型的F值為238.18，p＜0.000 1，模型極顯著。種子多酚模型的R2為0.996 7，R2adj為0.992 6，顯示模型擬合程度較好，試驗(yàn)值和預(yù)測(cè)值接近；并且種子多酚模型的C.V.%為0.59%，表明試驗(yàn)值的精確性和可靠性強(qiáng)。種子回歸模型中一次項(xiàng)A、B，交互項(xiàng) BC 為顯著性差異（p＜0.05）， 二次項(xiàng) A2、B2、C2為極顯著性差異（p＜0.01），一次項(xiàng) C、交互項(xiàng)AB、AC為不顯著（p＞0.05），說明提取時(shí)間對(duì)種子多酚提取率影響較小，結(jié)合F值可知提取溫度（A）和乙醇濃度（B）對(duì)種子多酚提取率的影響大小一致，均大于提取時(shí)間（C）。綜上分析，蛋黃果種子多酚所建立的提取模型可信度較高，可用于預(yù)測(cè)種子多酚的提取量。

2.2.2 響應(yīng)曲面圖分析

兩因素交互作用的響應(yīng)面等高線圖見圖5～圖6。

圖5 乙醇濃度和提取溫度交互作用對(duì)果肉多酚提取率影響的等高線圖和響應(yīng)曲面圖Fig.5 Contour and response surface plot for the interactive effect of ethanol concentration and extraction temperature on the yield of polyphenols from pulp

圖6 提取時(shí)間和乙醇濃度交互作用對(duì)種子多酚提取率影響的等高線圖和響應(yīng)曲面圖Fig.6 Contour and response surface plot for the interactive effect of extraction time and ethanol concentration on the yield of polyphenols from seeds

響應(yīng)曲面圖直觀地顯示各因素之間交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響[21]。由圖5可知，提取時(shí)間固定在0水平時(shí)，隨著乙醇濃度和提取溫度的增加，果肉多酚提取率呈先增后減趨勢(shì)，提取溫度比乙醇濃度對(duì)果肉多酚提取率的曲線較為陡峭，表明提取溫度對(duì)多酚提取過程影響更大。由等高線橢圓形圖可知，乙醇濃度和提取溫度2種因素的交互作用對(duì)果肉多酚提取率有顯著的影響。

由圖6可知，提取溫度在0水平時(shí)，當(dāng)增加乙醇濃度和提取時(shí)間時(shí)，種子多酚提取率呈先增后減趨勢(shì)且下降趨勢(shì)非常明顯，其中乙醇濃度和提取時(shí)間對(duì)種子多酚提取率的曲線陡峭程度相似，說明兩因素對(duì)種子多酚提取率的影響程度相近。由等高線橢圓形圖可以看出，乙醇濃度和提取時(shí)間的交互作用對(duì)種子多酚提取率比果肉多酚提取率影響大。

2.2.3 最佳條件的確定與模擬的驗(yàn)證

經(jīng)過試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析得出果肉和種子多酚的最佳提取溫度分別為61.94、60.29℃，最佳乙醇濃度分別為50.44%和40.46%，提取時(shí)間分別為102.49、100.84 min，預(yù)測(cè)值分別為0.71%和2.69%；顯然，果肉多酚和種子多酚最佳提取時(shí)間和提取溫度的工藝條件接近。根據(jù)實(shí)際情況對(duì)參數(shù)進(jìn)行修正，修正后果肉和種子多酚的最佳工藝分別為提取溫度62℃和60℃，乙醇濃度50%和40%，提取時(shí)間102 min和101 min；按最佳工藝條件重復(fù)試驗(yàn)3次，得到果肉和種子多酚實(shí)際提取率分別為0.74%和2.65%，試驗(yàn)值接近于預(yù)測(cè)值，模型可行。

2.3 多酚的抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除能力

多酚對(duì)DPPH自由基的清除活性見圖7。

圖7 多酚對(duì)DPPH自由基的清除活性Fig.7 Scavenging activity of polyphenols on DPPH·

由圖7可知，果肉多酚、種子多酚和VC對(duì)DPPH自由基的清除能力隨著樣品質(zhì)量濃度的增加而增加，其中果肉多酚受濃度影響較大，此結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[22-25]。同一濃度下，VC的清除效果最好，種子多酚次之，果肉多酚的清除能力最弱。當(dāng)濃度為1.0 mg/mL時(shí)，VC、種子多酚、果肉多酚的清除率分別為96.36%、87.50%、65.31%，由此表明，果肉和種子多酚都具顯著的DPPH自由基清除能力，且種子多酚的DPPH自由基清除能力強(qiáng)于果肉。

2.3.2 OH自由基清除能力

多酚對(duì)OH自由基的清除能力見圖8。

圖8 多酚對(duì)OH自由基的清除能力Fig.8 Scavenging activity of polyphenols on·OH

由圖8可知，果肉多酚、種子多酚和VC對(duì)OH自由基的清除能力隨著樣品質(zhì)量濃度的增加而增加，其中種子多酚受濃度影響最大。當(dāng)濃度在0.2 mg/mL～0.4 mg/mL時(shí)，果肉和種子多酚的清除能力相差不大，在0.4 mg/mL之后，種子多酚的清除能力遠(yuǎn)高于果肉，但都弱于VC。當(dāng)濃度為1.0 mg/mL時(shí)，VC、種子多酚、果肉多酚的清除率分別為89.11%、63.11%、22.64%，由此表明，種子多酚具有較強(qiáng)的OH自由基清除能力，高于果肉。

2.3.3 O2-自由基清除能力

多酚對(duì)O2-自由基的清除能力見圖9。

圖9 多酚對(duì)O2-自由基的清除能力Fig.9 Scavenging activity of polyphenols on O2-·

由圖9可知，果肉多酚、種子多酚和VC對(duì)O2-自由基的清除能力隨著樣品質(zhì)量濃度的增加而增加，其中果肉多酚和VC受濃度影響較大。當(dāng)濃度在0.2 mg/mL～0.8 mg/mL時(shí)，種子多酚的清除能力要高于果肉多酚，在0.8 mg/mL之后，果肉和種子多酚的清除能力相接近，相比于果肉和種子多酚，VC的清除能力更高。當(dāng)濃度為1.0 mg/mL時(shí)，VC、種子多酚、果肉多酚的清除率分別為96.33%、19.97%、19.92%，由此表明，果肉和種子多酚都具有一定的O2-自由基清除能力[26-27]，且相差不大。

3 結(jié)論

采用超聲波輔助法提取蛋黃果的果肉和種子多酚，并利用響應(yīng)面法優(yōu)化果肉和種子多酚的提取條件。果肉多酚最佳工藝條件為提取溫度62℃，乙醇濃度 50%，提取時(shí)間 102 min，料液比 1∶30（g/mL），提取率為0.74%；種子多酚最佳工藝條件為提取溫度60℃，乙醇濃度 40%，提取時(shí)間 101 min，料液比 1∶30（g/mL），提取率為2.65%；此外，通過體外抗氧化活性試驗(yàn)來探究果肉和種子多酚的抗氧化能力。結(jié)果表明，果肉和種子多酚對(duì)DPPH自由基、OH自由基、O2-自由基均有清除能力，且種子多酚的清除能力較強(qiáng)。蛋黃果種子中多酚的含量要高于果肉，且種子多酚的抗氧化能力也強(qiáng)于果肉。蛋黃果的果肉和種子提取工藝模型可行性高，抗氧化性能優(yōu)越。