陳玲，王學(xué)方，李智寧，范毅，寧二娟，李健，李曉

（河南省科學(xué)院河南省生物技術(shù)開發(fā)中心，河南省納普生物技術(shù)有限公司，河南鄭州450008）

1 材料與方法

1.1 材料

信陽毛尖：信陽市浉河區(qū)青云茶葉專業(yè)合作社提供；β-葡萄糖苷酶（≥200U/g）、果膠酶（≥60000U/mL）、纖維素酶（≥11 000 U/g）、中性蛋白酶（≥50 000 U/g）：夏勝生物科技開發(fā)有限公司。癸酸乙酯（純度99%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；二氯甲烷、無水硫酸鈉（均為分析純）：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GC-MS QP2010Ultra氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：日本島津公司；同時蒸餾萃?。╯imultaneous distillation and extraction，SDE） 提取器、HH-4Y電熱恒溫水浴鍋：上海啟前電子科技有限公司；SHSL調(diào)溫電熱套：上海樹立儀器儀表有限公司；SB-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：日本東京理化器械株式會社；ME204電子分析天平：梅特勒-托利多國際股份有限公司；SANYO醫(yī)用低溫箱：日本三洋公司。

1.3 方法

1.3.1 氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析條件

GC 條件：Rxi-5MS（30.0 m×0.25 mm，0.25 μm）石英毛細(xì)管柱。 進(jìn)樣口溫度250℃，載氣為He氣，柱流量為1.5 mL/min，升溫程序：初始溫度為100℃，先以10℃/min升至260℃，再以20℃/min升溫至300℃（保持 10 min），分流比 5∶1。

MS條件：離子源為電子轟擊電離源（EI），離子化電壓70 eV，離子源溫度250℃，質(zhì)譜掃描范圍40 amu～500 amu，檢測器電壓0.88 kV。

1.3.2 提取制備方法

β-葡萄糖苷酶輔助提取香氣成分：綠茶粉碎，過40目篩，取20 g，置于圓底燒瓶中，加200 g蒸餾水，加0.5%β-葡萄糖苷酶，調(diào)pH值至4.5～5.0，50℃保溫酶解1 h，加1 mL癸酸乙酯（濃度98.83 g/mL），放置于電熱套上，連接SDE裝置，另一端連接另一圓底燒瓶，燒瓶中加入30 mL二氯甲烷，放置于水浴鍋上，水浴鍋溫度設(shè)置55℃，電熱套加熱使水保持微沸，同時蒸餾萃取2 h，萃取液采用無水硫酸鈉和冷凍結(jié)合除水，然后用低溫減壓濃縮，溫度為30℃，除去溶劑，稱重，加2 mL二氯甲烷溶解，0.45 μm濾膜過濾即得，樣品冷凍保存。

果膠酶、蛋白酶及纖維素酶輔助提取香氣成分處理方法同上。

開展基于校企合作的大學(xué)生職前培訓(xùn)，高校和企業(yè)可以實現(xiàn)資源共享，使教學(xué)和企業(yè)培訓(xùn)融為一體。根據(jù)企業(yè)真實需求結(jié)合市場導(dǎo)向采取適當(dāng)培訓(xùn)措施和培訓(xùn)策略，可以有效增強(qiáng)職場綜合素質(zhì)的培養(yǎng)，提高大學(xué)生的職業(yè)能力和職業(yè)素養(yǎng)，從而切實提高就業(yè)核心競爭力，解決學(xué)生就業(yè)困境，使畢業(yè)生能快速實現(xiàn)由學(xué)生向社會人的角色轉(zhuǎn)變。基于校企合作的大學(xué)生職前培訓(xùn)作為現(xiàn)階段有效的培訓(xùn)方式，始終都要堅持以學(xué)生為本位，從學(xué)生的切身利益出發(fā)，做好培訓(xùn)規(guī)劃。校企合作開展職前培訓(xùn)不可一蹴而就，更不是一朝一夕就可以見到成效的，需要高校、企業(yè)、政府和社會的共同努力。

空白為不加酶，不經(jīng)過酶解，其它步驟同上。

1.4 數(shù)據(jù)處理

定性分析：利用NIST 2014譜庫和保留時間、保留指數(shù)對所得到的質(zhì)譜圖進(jìn)行檢索定性，挑選出匹配度大于等于80%的峰號；根據(jù)分子質(zhì)量、化學(xué)式以及分子結(jié)構(gòu)確定各個出峰物質(zhì)的名稱。

定量分析：根據(jù)各組分色譜峰面積占樣品總峰面積（不含癸酸乙酯內(nèi)標(biāo)）的含量進(jìn)行定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酶輔助提取的香氣成分

采用不同的酶分別對信陽毛尖進(jìn)行酶解，然后采用SDE法提取其香氣成分，提取液經(jīng)過除水，30℃低溫減壓蒸干，稱重，結(jié)果見表1。

表1 不同酶輔助提取的香氣成分得率Table 1 The yield of aroma components extracted by different enzymes

由表1看出，β-葡萄糖苷酶輔助提取信陽毛尖香氣成分得率最高，其次是中性蛋白酶，果膠酶和纖維素酶輔助提取的香氣成分得率低于空白對照。

2.2 不同酶輔助提取的香氣成分比較

用β-葡萄糖苷酶、果膠酶、中性蛋白酶、纖維素酶分別對信陽毛尖進(jìn)行酶解，采用不加酶提取作為空白對照，然后采用SDE法提取其香氣成分，用GC-MS進(jìn)行檢測，定性和定量結(jié)果見表2。

表2 各種酶輔助提取下的香氣成分及相對含量Table 2 Aroma components and relative contents under the assisted extraction of various enzymes

續(xù)表2 各種酶輔助提取下的香氣成分及相對含量Continue table 2 Aroma components and relative contents under the assisted extraction of various enzymes

續(xù)表2 各種酶輔助提取下的香氣成分及相對含量Continue table 2 Aroma components and relative contents under the assisted extraction of various enzymes

續(xù)表2 各種酶輔助提取下的香氣成分及相對含量Continue table 2 Aroma components and relative contents under the assisted extraction of various enzymes

由表2看出，5種提取方法共提取檢測出108個成分，共有成分23種。添加這4種酶后，二環(huán)己基甲酮、δ-杜松烯、反式橙花叔醇、苯甲酸-3-己烯酯、（-）-異雪松醇、（+）-Epicubenol、茉莉酸甲酯、tau-Muurolol、α-蓽澄茄醇、植烷、植酮、鄰苯二甲酸二異丁酯等綠茶中主要呈香成分[11-12]相對含量比空白提取時都有增加。

在信陽毛尖香氣成分提取時加入β-葡萄糖苷酶后，增加的主要香氣成分有：橙花醇、2，5-辛二酮、壬酸、吲哚、2，4-二叔丁基苯酚、順菖蒲烯、（Z）-己酸-3-己烯酯、茉莉酮、橙化基丙酮等共24個成分。其中橙花醇、茉莉酮、（Z）-己酸-3-己烯酯是信陽毛尖中主要的呈香成分[13-15]。添加β-葡萄糖苷酶后，香葉醇、反式橙花叔醇、苯甲酸-3-己烯酯、（-）-異雪松醇、（+）-Epicubenol、δ-杜松烯、茉莉酸甲酯、tau-Muurolol、α-蓽澄茄醇、植烷、植酮、鄰苯二甲酸二異丁酯等相對含量比空白提取時都有提高。信陽毛尖中主要呈香成分[13-15]香葉醇、反式橙花叔醇、δ-杜松烯、鄰苯二甲酸二異丁酯，相對含量與空白相比分別提高了19.5%、30.0%、81%、91.3%，香葉醇的含量僅在添加β-葡萄糖苷酶時有增加，這與β-葡萄糖苷酶能水解茶葉中的糖苷鍵，釋放香葉醇的結(jié)果一致[16-17]。

在信陽毛尖香氣成分提取時加入果膠酶后，增加的主要香氣成分有：（Z，E）-金合歡醇、2，5-辛二酮、壬酸、吲哚、（Z）-己酸-3-己烯酯、茉莉酮、橙化基丙酮、丙位癸內(nèi)酯、α-法尼烯、順菖蒲烯、降植烷、反式金合歡醇等共31種，消失了18種香氣成分，大部分是酯類和烷烴類。信陽毛尖中主要呈香成分有：反式橙花叔醇、δ-杜松烯、鄰苯二甲酸二異丁酯，相對含量與空白相比分別提高了8.2%、49.0%、65.2%。

在信陽毛尖香氣成分提取時加入中性蛋白酶后，增加的主要香氣成分有：2，5-辛二酮、壬酸、吲哚、（Z）-己酸-3-己烯酯、茉莉酮、橙化基丙酮、香葉基芳樟醇、2，4-二叔丁基苯酚、α-法尼烯、順菖蒲烯、Naphthalene等共37種。芳樟醇類化合物是信陽毛尖中的主要呈香成分和相對含量較高的成分[18-19]，香葉基芳樟醇僅在添加中性蛋白酶后含量有所增加，這可能和本試驗選取的材料中芳樟醇類化合物含量低有關(guān)，但也說明了添加中性蛋白酶后可以輔助芳樟醇類化合物溶出。信陽毛尖中主要呈香成分反式橙花叔醇、δ-杜松烯、鄰苯二甲酸二異丁酯，相對含量與空白相比分別提高了11.3%、63.0%、47.8%。

在信陽毛尖香氣成分提取時加入纖維素酶后共測得香氣成分62個，增加的主要香氣成分有：2，5-辛二酮、壬酸、吲哚、（Z）-己酸-3-己烯酯、茉莉酮、橙化基丙酮、2，4-二叔丁基苯酚、α-法尼烯、順菖蒲烯、降植烷、反式金合歡醇等共31種。信陽毛尖中主要呈香成分反式橙花叔醇、δ-杜松烯、鄰苯二甲酸二異丁酯的相對含量和空白對比分別提高了16.7%、65.0%、100%。

2.3 香氣成分構(gòu)成分析

各香氣成分構(gòu)成分析見表3。

由表2和表3看出，添加β-葡萄糖苷酶、果膠酶、中性蛋白酶、纖維素酶后香氣成分總數(shù)較空白都有增加，其中添加中性蛋白酶后增加的香氣成分最多，增加了36.7%；添加了4種酶后，醇類、酸類、萜烯類、酮類、烷烴類及其它類香氣成分相對含量較空白也有一定增加，但是酯類成分的相對含量降低很多，酯類成分個數(shù)降低卻不明顯，這可能和添加酶后，植醇的相對含量大量增加有關(guān)。植醇是葉綠素的一個側(cè)鏈，喬克威等[20]研究采用葉綠素酶脫除葉綠素鏈上的植醇，效果很好。本試驗結(jié)果說明β-葡萄糖苷酶、果膠酶、中性蛋白酶、纖維素酶可能具有輔助水解葉綠素成植醇的功能。酸類物質(zhì)大多呈現(xiàn)不愉悅氣味，不利于茶葉香氣品質(zhì)，添加4種酶后，酸類成分都有增加，這可能是和酶能輔助水解部分酯類有關(guān)。

表3 香氣種類分析Table 3 Analysis of aroma types

3 結(jié)論

在信陽毛尖香氣成分提取過程中，添加β-葡萄糖苷酶、果膠酶、中性蛋白酶、纖維素酶，都能提高信陽毛尖中的香氣成分種類，其中添加中性蛋白酶后香氣成分種類增加最多，綠茶中的主要香氣成分二環(huán)己基甲酮、δ-杜松烯、反式橙花叔醇、苯甲酸-3-己烯酯、（-）-異雪松醇、（+）-Epicubenol、茉莉酸甲酯、tau-Muurolol、α-蓽澄茄醇、植烷、植酮、鄰苯二甲酸二異丁酯、棕櫚酸甲酯、鄰苯二甲酸二丁酯、棕櫚酸乙酯、葉綠醇的相對含量都有提高。β-葡萄糖苷酶輔助提取信陽毛尖香氣成分得率最高，其次是中性蛋白酶。因此在信陽毛尖香氣成分提取時添加β-葡萄糖苷酶和中性蛋白酶，既可以增加香氣成分種類，又可以提高香氣成分得率。