王彬，齊縣偉，張憲亮

動脈粥樣硬化是臨床常見疾病之一，其發(fā)生發(fā)展與內(nèi)皮細(xì)胞損傷有關(guān)，內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂是心血管疾病的早期病理特征之一，研究表明內(nèi)皮細(xì)胞損傷可引起動脈粥樣硬化發(fā)生及發(fā)展[1]。氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）可以促使內(nèi)皮細(xì)胞損傷進(jìn)而促進(jìn)動脈粥樣硬化的發(fā)生，如何減輕內(nèi)皮細(xì)胞損傷成為預(yù)防及治療心血管疾病的重點研究[2,3]。微小RNA（miRNA）可調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過程，研究表明miRNA可參與oxLDL誘導(dǎo)的主動脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷過程[4]，積極探尋新型miRNA分子有助于揭示血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的分子機(jī)制。微小RNA-193a-3p（miR-193a-3p）在骨關(guān)節(jié)炎中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)可抑制炎癥因子的表達(dá)及細(xì)胞凋亡[5]。但miR-193a-3p在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制尚處未知。生物信息學(xué)分析顯示S100鈣結(jié)合蛋白A4（S100A4）可能是miR-193a-3p的靶基因，S100A4可促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，并可在動脈粥硬化斑塊內(nèi)上調(diào)表達(dá)[6,7]。但miR-193a-3p是否可通過調(diào)控S100A4表達(dá)而影響oxLDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷尚未可知。因此，本研究通過oxLDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞，觀察miR-193a-3p與S100A4的表達(dá)變化，探討其對細(xì)胞氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡的影響，為miR-193a-3p靶向調(diào)控S100A4治療動脈粥樣硬化的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株EVC-304（美國ATCC細(xì)胞庫）。oxLDL（上海魯汶生物科技有限公司）。杜氏改良培養(yǎng)基（DMEM）、胎牛血清（美國Gibco公司）；Lipofectamine 2000（美國Invitrogen公司）；Trizol試劑（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；反轉(zhuǎn)錄及SYBR熒光染料試劑盒（日本TaKaRa公司）；miR-193a-3p寡核苷酸模擬物（miR-193a-3p mimics）及陰性對照mimic NC序列（miR-NC）、S100A4小干擾RNA（si-S100A4）、亂序無意義陰性序列（si-NC）、miR-193a-3p特異性寡核苷酸抑制劑（anti-miR-193a-3p）、陰性對照序列（anti-miR-NC）（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）；pcDNA3.1（上?？吕咨锟萍加邢薰荆患?xì)胞凋亡試劑盒（美國Sigma公司）；兔抗人S100A4抗體（美國Santa Cruz公司）；兔抗人Bax、Bcl-2抗體（美國CST公司）；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（北京中杉金橋生物公司）；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；丙二醛（MDA）含量檢測試劑盒（北京吉美生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及實驗分組EVC-304細(xì)胞加入0.25%胰蛋白酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml，接種于24孔板（100 μl/孔），使用含有100 μg/ml的oxLDL的培養(yǎng)基處理細(xì)胞24 h[8]，命名為oxLDL組，將未經(jīng)任何處理的細(xì)胞作為Con組。分別將miR-NC、miR-193a-3p mimics、si-NC、si-S100A4、miR-193a-3p mimics與pcDNA、miR-193a-3p mimics與pcDNA-S100A4轉(zhuǎn)染至EVC-304細(xì)胞48 h，用含有100 μg/ml的oxLDL的培養(yǎng)基處理細(xì)胞24 h，分別命名為oxLDL+miRNC組、oxLDL+miR-193a-3p組、oxLDL+si-NC組、oxLDL+si-S100A4組、oxLDL+miR-193a-3p+pcDNA組、oxLDL+miR-193a-3p+pcDN A-S100A 4組。轉(zhuǎn)染過程參照Lipofectamine2000試劑說明書。

1.2.2 qRT-PCR檢測細(xì)胞中miR-193a-3p、S100A4 mRNA的表達(dá)水平采用Trizol法提取細(xì)胞中總RNA，應(yīng)用紫外分光光度計測定RNA濃度。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。參照熒光定量PCR試劑盒說明書配置反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：95℃ 2 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共循環(huán)40次。miR-193a-3p以U6為內(nèi)參，S100A4以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算miR-193a-3p、S100A4 mRNA的相對表達(dá)量。

1.2.3 檢測MDA含量與SOD、GSH-Px活性收集各組細(xì)胞，加入裂解液，冰上裂解2 h，離心收集上清液，采用硫代巴比妥酸法檢測MDA含量，采用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD活性，按照試劑盒說明書檢測GSH-Px活性。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率收集各組EVC-304細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌，收集細(xì)胞沉淀，加入500 μl Binding Buffer懸浮細(xì)胞，參照細(xì)胞凋亡檢測試劑盒依次加入5 μl Annexin V-FITC與5 μl PI，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 雙熒光素酶報告基因檢測miR-193a-3p的靶基因StarBase預(yù)測顯示S100A4的3’UTR區(qū)含有miR-193a-3p的結(jié)合位點，構(gòu)建野生型載體WT-S100A4、突變型載體MUT-S100A4，分別將WT-S100A4、MUT-S100A4與miR-NC、miR-193a-3p mimics共轉(zhuǎn)染至EVC-304細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，檢測各組熒光素酶活性。分別將miRNC、miR-193a-3p mimics、anti-miR-NC、antimiR-193a-3p轉(zhuǎn)染至EVC-304細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng) 48 h，收集細(xì)胞，采用蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測各組細(xì)胞中S100A4蛋白水平。

1.2.6 Western blot檢測S100A4、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)收集各組EVC-304細(xì)胞，加入適量RIPA蛋白裂解液，冰上裂解30 min，4℃條件下經(jīng) 12 000 r/min離心15 min，收集上清液。檢測蛋白濃度，SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)膜、封閉，加入S100A4、Bax、Bcl-2一抗稀釋液（1:1000），4℃孵育24 h，分別加入二抗稀釋液（1:2000），滴加ECL顯影，采用Quantityone軟件檢測條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以（±s）表示且均符合正態(tài)分布，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-193a-3p和S100A4在oxLDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的表達(dá)與Con組比較，oxLDL組血管內(nèi)皮細(xì)胞中miR-193a-3p的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），S100A4 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）（圖1，表1）。

圖1 S100A4蛋白表達(dá)

表1 miR-193a-3p和S100A4在oxLDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的表達(dá)（n=9）

2.2 miR-193a-3p過表達(dá)對oxLDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響與Con組比較，oxLDL組血管內(nèi)皮細(xì)胞中MDA含量顯著升高（P＜0.05），SOD、GSH-Px活性顯著降低（P＜0.05）；與oxLDL+miR-NC組比較，oxLDL+miR-193a-3p組血管內(nèi)皮細(xì)胞中MDA含量顯著降低（P＜0.05），SOD、GSH-Px活性顯著升高（P＜0.05）（表2）。

表2 miR-193a-3p過表達(dá)對oxLDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響（n=9）

2.3 miR-193a-3p過表達(dá)對oxLDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響與Con組比較，oxLDL組血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），Bax蛋白水平顯著升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平顯著降低（P＜0.05）；與oxLDL+miR-NC組比較，oxLDL+miR-193a-3p組血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），Bax蛋白水平顯著降低（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平顯著升高（P＜0.05）（圖2，表3）。

表3 miR-193a-3p過表達(dá)對oxLDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響（n=9）

圖2 miR-193a-3p過表達(dá)對oxLDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響（A：凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)；B：細(xì)胞凋亡流式圖）

2.4 抑制S100A4表達(dá)對oxLDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響與oxLDL+si-NC組比較，oxLDL+si-S100A4組血管內(nèi)皮細(xì)胞中MDA含量顯著降低（P＜0.05），SOD、GSH-Px活性顯著升高（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），Bax蛋白水平顯著降低（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平顯著升高（P＜0.05）（圖3，表4）。

表4 抑制S100A4表達(dá)對oxLDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響（n=9）

圖3 抑制S100A4表達(dá)對oxLDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響（A：S100A4和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)；B：細(xì)胞凋亡流式圖）

2.5 miR-193a-3p靶向調(diào)控S100A4的表達(dá)StarBase預(yù)測顯示miR-193a-3p與S100A4存在結(jié)合位點（圖4A）。雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染野生型載體WT-S100A4的細(xì)胞實驗中，miR-193a-3p組熒光素酶活性顯著低于miR-NC組（P＜0.05）；轉(zhuǎn)染突變型載體MUT-S100A4的細(xì)胞實驗中，miR-193a-3p組熒光素酶活性與miRNC組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表5）。Western blot檢測結(jié)果顯示，與miR-NC組比較，miR-193a-3p組細(xì)胞中S100A4蛋白水平顯著降低（P＜0.05）；與anti-miR-NC組比較，antimiR-193a-3p組細(xì)胞中S100A4蛋白水平顯著升高（P＜0.05）（圖4B，表6）。

表5 雙熒光素酶報告實驗（n=9）

表6 miR-193a-3p調(diào)控S100A4的表達(dá)（n=9）

圖4 miR-193a-3p靶向調(diào)控S100A4的表達(dá)（A: S100A4的3’UTR中含有與miR-193a-3p互補(bǔ)的核苷酸序列；B:S100A4蛋白表達(dá)）

2.6 S100A4過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-193a-3p過表達(dá)對oxLDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用與oxLDL+miR-193a-3p+pcDNA組比較，oxLDL+miR-193a-3p+pcDNA-S100A4組血管內(nèi)皮細(xì)胞中MDA含量顯著升高（P＜0.05），SOD、GSH-Px活性顯著降低（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），Bax蛋白水平顯著升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平顯著降低（P＜0.05）（圖5，表7）。

3 討論

oxLDL可引起內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷而促進(jìn)動脈粥樣硬化的發(fā)生及發(fā)展，調(diào)控miRNA表達(dá)可減輕內(nèi)皮細(xì)胞損傷及抑制炎癥因子的釋放[9,10]。但仍有部分miRNA在血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷過程中的分子機(jī)制尚未闡明，因而本研究積極探索新型miRNA分子并分析其對oxLDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響及其分子機(jī)制。

miR-193a-3p表達(dá)水平升高可抑制腸道炎癥反應(yīng)的發(fā)生[11]。研究表明miR-193a-3p表達(dá)量降低可促進(jìn)脂多糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及炎性損傷[12]。相關(guān)報道指出miR-193a-3p在阿爾茨海默病患者和阿爾茨海默病細(xì)胞模型中表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)miR-193a-3p可降低Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡[13]。與上述研究報道相似，本研究結(jié)果顯示miR-193a-3p在oxLDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，提示miR-193a-3p表達(dá)量降低可能促進(jìn)oxLDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。本研究結(jié)果顯示oxLDL處理后血管內(nèi)皮細(xì)胞中MDA含量升高，而SOD、GSH-Px活性降低，進(jìn)一步分析顯示miR-193a-3p過表達(dá)后明顯降低MDA含量，增強(qiáng)SOD、GSH-Px活性。研究表明氧化應(yīng)激是造成動脈粥樣硬化血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的重要分子機(jī)制，oxLDL可促使血管內(nèi)皮細(xì)胞中SOD、GSHPx活性降低，增加MDA含量，細(xì)胞中MDA含量與SOD、GSH-Px活性可間接反映細(xì)胞氧化損傷程度[14,15]。本研究結(jié)果提示miR-193a-3p過表達(dá)具有抗oxLDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的作用。研究表明氧化應(yīng)激水平升高還可能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Bcl-2屬于抑制細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白，其表達(dá)增強(qiáng)可抑制細(xì)胞凋亡，Bax是促凋亡蛋白，其表達(dá)增強(qiáng)可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，Bax與Bcl-2可通過調(diào)控線粒體膜通透性調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[16]。本研究結(jié)果顯示oxLDL處理后血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率顯著升高，而miR-193a-3p過表達(dá)能夠明顯降低血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率，還可抑制Bax表達(dá)，促進(jìn)Bcl-2表達(dá)，提示miR-193a-3p過表達(dá)可降低血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率而保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞。

S100A4表達(dá)量升高可促進(jìn)脂多糖誘導(dǎo)的小鼠子宮內(nèi)膜炎的發(fā)展[17]。研究表明S100A4表達(dá)量升高可促進(jìn)骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生及發(fā)展[18]。相關(guān)報道指出S100A4在不穩(wěn)定型心絞痛患者血漿中表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)量升高可增加心血管疾病發(fā)生的風(fēng)險[19]。與上述研究結(jié)果相似，本研究結(jié)果顯示oxLDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞中S100A4的表達(dá)量明顯增高，進(jìn)一步分析顯示抑制S100A4表達(dá)可明顯減弱oxLDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷，并可降低MDA含量及增強(qiáng)SOD、GSH-Px活性，還可抑制oxLDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，其主要機(jī)制可能是通過調(diào)控Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)而發(fā)揮作用。提示抑制S100A4表達(dá)可明顯抑制oxLDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷及細(xì)胞凋亡。研究通過雙熒光素酶報告實驗與Western blot實驗證實miR-193a-3p能夠靶向結(jié)合S100A4，還可負(fù)向調(diào)控S100A4的表達(dá)，進(jìn)一步研究顯示S100A4過表達(dá)可明顯減弱miR-193a-3p過表達(dá)對oxLDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用，提示miR-193a-3p過表達(dá)可能通過靶向調(diào)控S100A4的表達(dá)從而增強(qiáng)oxLDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞抗氧化能力，并可抑制細(xì)胞凋亡，從而對血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述，miR-193a-3p可靶向調(diào)控S100A4表達(dá)從而減輕oxLDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷及抑制細(xì)胞凋亡，可為揭示血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷修復(fù)的分子機(jī)制提供理論依據(jù)，還可為臨床上動脈粥樣硬化的靶向治療提供科學(xué)依據(jù)。