烏日娜，李猛，岳強，宋秀榮，李曉瓊，徐立松

心肌纖維化指心肌正常組織結構中出現(xiàn)的以成纖維細胞增殖，細胞外基質(zhì)（ECM）尤其是膠原纖維的過度沉積為主要表現(xiàn)的疾病。它是多種心臟疾病發(fā)展到一定階段的共同病理生理改變，如缺血性心肌病、擴張型心肌病、高血壓性心臟病、糖尿病性心肌病，甚至心臟移植后出現(xiàn)的供體心臟衰竭[1-3]。隨著心臟持續(xù)的氧化應激反應和炎癥損傷，心肌纖維化逐漸占據(jù)主導地位，導致心肌重構和心臟功能紊亂，從而誘發(fā)心力衰竭和心律失常，甚至心源性猝死[4,5]。目前尚無有效手段可阻止心肌纖維化的發(fā)生和發(fā)展。因此了解心肌纖維化的發(fā)生相關機制及如何有效的逆轉(zhuǎn)心肌纖維化，一直是心血管領域研究的熱點問題。

目前有研究顯示：心肌成纖維細胞的活化與功能調(diào)節(jié)與自噬相關。自噬的主要作用是降解、清除細胞內(nèi)無效的細胞成分[6]。在生理情況下，自噬在所有細胞內(nèi)維持在一較低的水平，起到了維持細胞穩(wěn)態(tài)的作用。在養(yǎng)分不足、缺血缺氧、應激狀態(tài)等因素誘導下，細胞可啟動自噬以產(chǎn)生能量，并降解受損的細胞器，從而起到自我保護的作用。但過度的自噬激活可以導致細胞死亡。心臟中基礎水平的自噬對于心肌細胞的功能和穩(wěn)態(tài)的維持是至關重要的[7,8]。自噬在誘導纖維化反應中的意義為臨床治療心肌纖維化和心功能不全開拓了新的領域。高遷移率族蛋白1（HMGB1）是一個高度保守的核蛋白，存在于所有真核細胞中，可在多種炎癥介質(zhì)的刺激下主動分泌出胞，也可在細胞壞死或受損時被動釋放至胞外，參與啟動非感染性炎癥以及細胞凋亡和自噬[9]。Toll樣受體（TRL）家族分子（包括TRL1-TRL10）可在多種細胞內(nèi)表達，激活不同的配體，發(fā)揮相應的功能，TLR2和TLR4是TLR家族的兩個核心成員[9]，既往研究表明，HMGB1可以被免疫細胞或者心肌組織細胞所表達的模式識別受體（PRRs），如TLR2（Toll-like receptor 2）或TLR4（Toll-like receptor 4）所識別，引起心肌長時間大規(guī)模的慢性炎癥反應或免疫應答[10]。目前，對HMGB1與TLR4受體相互作用的生物學功能及信號通路的研究較為廣泛[11-13]，然而，關于HMGB1與TLR2受體相互作用的相關研究仍鮮有報道。

本研究欲在證明TLR2能否介導細胞外的HMGB1導致自噬抑制從而引起心肌纖維化，明確TRL2、HMGB1與心肌纖維化之間的關系，這為臨床治療心肌纖維化提供了理論依據(jù)和研究線索。

1 材料和方法

1.1 實驗動物SPF級C57BL/6（雄性，8周齡，平均體重20.5 g）購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。TLR2-/-（B6.129-Tlr2tm1Kir/J）小鼠購自南京大學模式動物研究所（合格證號：201503321）。飼養(yǎng)室恒溫（22～24℃）、恒濕（55%±5%），自由飲食，每天人工光照明暗各12 h。在母鼠哺乳條件下，準確記錄基因敲除小鼠出生時間，分籠（5只一籠），取8周齡的TLR2KO雄性小鼠（平均體重20.5 g），用于實驗。

1.2 實驗材料小鼠重組HMGB1蛋白購自美國Biolegend （San Diego，CA）。HMGB1蛋白抗體、α平滑肌肌動蛋白（α-SMA）抗體，Collagen I抗體購于英國Abcam公司。GAPDH、p-mTOR抗體、mTOR抗體購于美國Cell Signaling Technology公司。TLR2抗體購于美國R＆D公司。LC3Ⅱ/Ⅰ、P62抗體購于美國Sigma公司。Alexa Fluor 488和647抗體分別來自美國Invitrogen公司。HE染色試劑盒、天狼星染色試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司（上海）。異丙基腎上腺素A9525購自Sigma（U.S.）。

1.3 實驗方法

1.3.1 異丙腎上腺素誘導的小鼠心肌纖維化模型雄性C57BL/6和TLR2-/-小鼠（8周齡），平均體重20.4 g，ISO組于肩胛間皮下注射異丙腎上腺素（ISO），給藥濃度7 mg/kg，3/d，連續(xù)15 d[14]。對照組于肩胛皮下注射相同體積的生理鹽水，3/d，連續(xù)15 d。注射結束后15 d為終點（表1）。

表1 實驗分組情況

1.3.2 取材造模第30 d待小鼠進行超聲心動圖檢測后取材。小鼠處死前過夜禁食，稱體重。自劍突下縱行向上剪開胸腔，在大血管根部取出心臟，用冰生理鹽水心臟灌注，洗盡血液，肉眼觀察心臟大體形態(tài)，減除左、右心耳及殘余大血管后以濾紙濾干，垂直于心臟長軸將心臟切開，一部分置于4%福爾馬林溶液中固定保存，用于組織病理學檢測。一部分制成冰凍切片，剩余部分存于-80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.3.3 心臟成纖維細胞的分離與培養(yǎng)造模成功后各組小鼠用50 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉后，仰臥位固定于鼠板上，打開腹腔，經(jīng)肝門靜脈注射10000 U/kg肝素使其肝素化，防止凝血。無菌條件下取出心臟后立即懸掛在Langendorf[15]裝置上，首先使用KHB溶液（重碳酸鹽緩沖液）灌注5 min以去除殘留血細胞，再用酶溶液：0.7 mg/ml的Ⅱ型膠原酶+0.2 mg/ml的透明質(zhì)酸酶+0.1%的牛血清白蛋白（BSA）+25 mmol/L的氯化鈣（CaCl2）灌注10 min，有效的消化細胞外基質(zhì)，隨后在酶溶液中加入15 μl 100 mmol/L的CaCl2，繼續(xù)灌注5 min。灌注結束后取下心房，移除心房、心包以及多余的心臟組織，將剩下的心肌組織破碎后過篩網(wǎng)，制成單細胞懸液，1000 rpm離心10 min后，棄上清。沉淀用8 ml含10%胎牛血清（FBS）的M199培養(yǎng)基重懸，并接種于細胞培養(yǎng)皿中。1 h后，用PBS洗去殘留未貼壁的成纖維細胞，皿底為純度較高的成纖維細胞。用含10%FBS和抗生素（青霉素以及鏈霉素）的M199培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞。每7 d傳代一次。

1.3.4 超聲心動圖檢測心功能每只小鼠在處死前行經(jīng)胸壁超聲心動圖檢測。小鼠以10%水合氯醛30 ml/kg腹腔注射麻醉后，剔除頸、胸部的毛后進行超聲心動圖檢查，該實驗所有超聲心動圖檢測均由同一技術人員進行?？刂菩∈笮穆试?00 次/min左右，在生理狀態(tài)下獲得測量數(shù)值。采用加拿大Visual Sonics公司Vevo 770TM型高分辨率顯微超聲儀，選用RMV-716探頭，頻率為17.5 MHz。用二維切面超聲，選取受檢小鼠左側(cè)胸骨旁左室乳頭肌水平短軸切面結合M型和組織多普勒超聲進行檢查。通過M型模式測定并計算左室射血分數(shù)（LVEF），左室短軸縮短率 （LVFS），左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）。所有數(shù)值均測量三個連續(xù)心動周期，取其平均值，以求盡可能減少人為原因所致的誤差[16,17]。

1.3.5 形態(tài)學和組織學評價注射ISO后心肌細胞損傷及纖維化程度取小鼠新鮮心臟組織樣本，4%多聚甲醛固定后石蠟包埋用于組織學檢測。制成最大橫截面積3 μm切片的樣本，按照標準化程序用于HE染色和天狼星染色。應用高清晰彩色病理圖文分析系統(tǒng)Spot Advanced 3.0獲得高清晰的病理天狼猩紅圖片（400倍放大）。使用Image-Pro Plus 5.1測量每個視野天狼猩紅染色后膠原著色面積。每組分析8個標本，每個標本隨機選取15個視野，取均值代表一個動物膠原組織在心臟組織內(nèi)的含量和表達強度。通過非參數(shù)方差分析比較各組膠原面積。

1.3.6 免疫共沉淀和免疫熒光共定位法評價HMGB1與TLR2，α-SMA與p62間的相作用細胞和組織用含1 mmol/L的苯甲基磺酰氟和蛋白酶抑制劑的放射免疫沉淀法（RIPA）裂解液處理，BCA定量試劑盒檢測總蛋白含量，每孔上樣40 μg進行十二烷基硫酸鈉 聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，將膜與指定的一抗孵育過夜，然后與辣根過氧化物酶標記的二抗孵育過夜，然后使用增強的化學發(fā)光檢測系統(tǒng)（Amersham）進行信號檢測（USA）。從心臟或細胞勻漿中提取蛋白裂解物，使用C0-IP裂解液，輔以1 mmol/L PMSF和蛋白酶抑制劑混合物。4℃離心機1200 rpm離心30 min，取上清液于新的離心管中。每管取50 μl作為INPUT，INPUT加入12.5 μl 5×loading buffer 98℃變性10 min。剩余裂解液每管加入20 μl Protein A/G Plus-Agarose及1:100稀釋的P62抗體，混勻后，置于4℃冰箱緩慢搖動過夜。次日離心機300 rpm離心5 min，棄去上清液，每管加入500 μl Co-IP洗液洗4次。棄去上清液，加入30 μl 2×loading buffer，98℃變性10 min。變性后的INPUT和IP液8000 rpm離心 5 min即可上樣，進行SDS-PAGE電泳，并采用免疫印跡檢測P62及α-SMA，檢測兩者之間是否存在相互作用。

1.3.7 免疫熒光實驗及共聚焦顯微鏡將冰凍心臟組織切片（5 μm厚度）或蓋玻片培養(yǎng)的心臟成纖維細胞加入4%的多聚甲醛，室溫固定10 min，加入0.2% Triton X-100，室溫靜置10 min。使用3%的BSA室溫孵育45 min。用PBS稀釋的一抗（一抗：PBS=1:100），4℃冰箱孵育過夜。PBS2次洗滌后，切片或蓋玻片與用熒光素標記的經(jīng)過PBS稀釋的二抗（二抗：PBS=1:200），避光37℃孵育1 h。DAPI封片液室溫染色40 min。通過共聚焦顯微鏡（USA）獲得圖像，并使用Leica confocal software獲得分析結果。

1.3.8 電子顯微鏡觀察心臟的超微結果和自噬小體取材即刻置入3%多聚甲醛22.5%戊二醛固定，磷酸鹽緩沖液（PH7.2）沖洗; 再經(jīng)1%四氧化鋨室溫固定120 min；雙蒸水室溫沖洗3次，每次2 min；50%乙醇室溫10 min兩次-70%乙醇室溫10 min兩次-90%乙醇室溫10 min兩次-100%乙醇25℃10 min兩次，梯度乙醇脫水至環(huán)氧丙烷；環(huán)氧丙烷25℃固定10 min兩次；環(huán)氧丙烷：樹脂=1:1 28℃固定40 min；環(huán)氧丙烷：樹脂=1:3 28℃固定40 min；純樹脂28℃固定40 min；Epon812包埋，染色后，光學顯微鏡定位后，制備超薄切片，醋酸雙氧鈾、枸櫞酸鉛染色，用JEM-1400（JEOL，日本）透射電子顯微鏡觀察。

1.4 統(tǒng)計學分析應用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差的方式表達，如符合正態(tài)性分布則進行方差齊性檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；如不服從正態(tài)性分布，則轉(zhuǎn)化為常用對數(shù)后進行t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 TLR2KO改善ISO誘導的心功能不全對雄性野生型小鼠和TLR2基因敲除小鼠肩胛皮下注射異丙腎上腺素（ISO）15 d，在造模第30 d行超聲心動圖檢查發(fā)現(xiàn)，注射異丙腎上腺素后野生型小鼠左室射血分數(shù)（LVEF），左室短軸縮短率（LVFS）較對照組明顯減小，左心室舒張末期內(nèi)徑（LVIDd）較對照組顯著增大。而敲除TLR2基因的小鼠在注射ISO后，左室射血分數(shù)（LVEF），左室短軸縮短率（LVFS）與對照組相比變化不大，左心室舒張末期內(nèi)徑（LVIDd）較對照組亦無明顯變化（圖1）。

圖1 各組小鼠超聲心動圖檢測結果

2.2 TLR2KO抑制ISO誘導的心肌炎癥反應和心肌細胞丟失比較HE病理結果（圖2）和電鏡結果（圖3），可見WT+ISO組心肌損傷最重，心肌細胞的肌原纖維被破壞，線粒體發(fā)生腫脹和液泡化，灶性心肌細胞消失，細胞間隙擴大，心肌成纖維細胞和肌成纖維細胞增殖，膠原分泌成倍增加。而TLR2KO+ISO組炎癥改變小，心肌損傷較輕，心肌細胞丟失少，繼發(fā)纖維增生反應輕。

圖2 各組小鼠HE染色結果

圖3 電鏡下的心肌超微結構改變

2.3 TLR2KO抑制ISO誘導的心肌纖維化各組小鼠天狼星染色可見，WT+ISO小鼠心肌疤痕區(qū)膠原積聚較多，而TLR2KO小鼠心肌膠原分泌明顯減少，且兩者膠原面積分數(shù)比有差異（P＜0.01）（圖4）。膠原面積分數(shù)與心肌細胞的灶性壞死面積大小相關。經(jīng)免疫印跡實驗證實，WT+ISO組小鼠的心肌組織中collagen Ⅰ（Ⅰ型膠原）的表達與TLR2KO+ISO組比較明顯增加（圖5）。

圖4 各組小鼠天狼猩紅染色結果

圖5 各組小鼠心臟CollagenI、α-SMA、HMGB1蛋白表達情況

通過免疫印跡（圖1-6）和免疫熒光檢測（圖6），均提示W(wǎng)T+ISO小鼠的心肌組織中α-SMA的含量較對照組比較明顯升高，而TLR2KO+ISO小鼠心肌組織中α-SMA的含量較對照組稍有升高，但與WT+ISO比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。提示W(wǎng)T+ISO組心肌纖維化明顯，但TLR2KO+ISO組僅有輕度的纖維化。提示TLR2KO抑制ISO誘導的心肌纖維化。

圖6 免疫熒光檢測各組小鼠心臟α-SMA蛋白表達情況

2.4 HMGB1與TLR2的相互作用導致了心肌纖維化在免疫熒光共定位實驗中（圖7），發(fā)現(xiàn)心肌纖維化嚴重的WT+ISO組HMGB1含量增加，導致與TLR2相互作用增強，但因為TLR2基因被敲除，所以注射ISO的TLR2KO組僅有HMGB1表達增加，而無HMGB1與TLR2相互作用。

圖7 免疫熒光檢測HMGB1與TLR2的相互作用

2.5 ISO使小鼠心臟成纖維細胞中自噬流發(fā)生阻塞，而TLR2KO恢復了阻塞的自噬流通過免疫印跡的手段檢測各組小鼠心臟成纖維細胞中自噬標志性蛋白的表達：磷酸化的mTOR，mTOR，LC3Ⅱ/Ⅰ，可溶性的p62和不可溶性的p62。同時也檢測了TLR2和HMGB1的表達。與TLR2KO小鼠比較野生型小鼠在注射ISO后心臟成纖維細胞中可溶性的P62顯著的增加，提示自噬是活化的；然而磷酸化的mTOR和mTOR的比值也在增加，這提示自噬受到抑制；同時心臟成纖維細胞中LC3II/I的比值顯著的減小，更證實了自噬受到抑制。此外，與其他組相比，WT+ISO組不可溶性P62發(fā)生了堆積，更證實自噬流受到了阻塞。且與對照組比較，自噬流受到抑制的WT+ISO組的HMGB1及TLR2的表達均增強，而TLR2KO+ISO組僅HMGB1表達增強（圖8）。說明異丙腎上腺素使小鼠心臟成纖維細胞中自噬流發(fā)生阻塞，而TLR2KO恢復了阻塞的自噬流。

圖8 各組小鼠心臟成纖維細胞中TLR2、HMGB1、p-mTOR、mTOR、LC3、可溶性P62及非可溶性P62蛋白表達情況

2.6 ISO使小鼠心肌細胞中自噬小體數(shù)目減少電鏡下可觀察到心肌細胞中的自噬小體，心肌細胞中的線粒體自噬，在富含肌絲中的肌成纖維細胞中也可觀察到自噬小體（圖9 Ac），及成纖維細胞中的自噬小體，同時發(fā)現(xiàn)野生型的小鼠在注射ISO后心臟組織的自噬小體數(shù)量明顯少于其他組，而TLR2基因敲除小鼠在注射ISO后心臟組織中的自噬小體較野生組顯著增加，且差異有統(tǒng)計學意義。

3 討論

心肌纖維化指心肌正常組織結構中出現(xiàn)的以成纖維細胞增殖，細胞外基質(zhì)（ECM）-尤其是膠原纖維的過度沉積為主要表現(xiàn)的疾病。它是心室重構的主要病理表現(xiàn)，與多種心臟疾患的病理生理改變相關，如心房顫動、缺血性心肌病、擴張型心肌病、高血壓性心臟病、糖尿病性心肌病、心臟瓣膜病、心肌淀粉樣變性、貧血性心臟病，甚至心臟移植后出現(xiàn)的供體心臟衰竭[18]。心肌纖維化發(fā)生發(fā)展的分子機制包括炎癥反應，線粒體的損傷，心肌細胞的凋亡，心臟成纖維細胞的增殖，以及成纖維細胞向肌成纖維細胞表型的轉(zhuǎn)換[19,20]和膠原纖維的沉積。隨著心臟持續(xù)的氧化應激反應和炎癥損傷，心肌纖維化逐漸占據(jù)主導地位，導致心肌重構和心臟功能的紊亂，從而誘發(fā)心衰和各種心律失常，甚至心源性猝死[4]。然而，目前沒有任何有效的手段可以阻止心肌纖維化的發(fā)生和發(fā)展。因此了解心肌纖維化的發(fā)生相關機制及如何有效的逆轉(zhuǎn)心肌纖維化，一直是心血管領域研究的熱點問題。

研究發(fā)現(xiàn)細胞外HMGB1的新角色——通過與天然免疫受體TLR2的相互作用引起心肌纖維化，提示我們可通過阻斷細胞外HMGB1或TLR2受體的生物學功能來治療心肌纖維化。雖然之前的研究表明自噬是心肌纖維化的發(fā)病機制中不可缺少的防御機制[2,9]，但胞外的HMGB1對自噬活動的抑制和自噬相關促纖維化蛋白的降解的阻礙卻無相關報道。

在本研究中，異丙腎上腺素導致HMGB1聚集在心臟細胞膜表面，并且增強了與細胞膜表面TLR2受體的相互作用，導致了心肌纖維化。而將TLR2基因沉默后，雖然細胞間隙中HMGB1表達增強，但因無法與TLR2受體相互作用，而阻止了心肌纖維化。更重要的是，在體實驗發(fā)現(xiàn)心肌纖維化的成纖維細胞中的自噬流發(fā)生了阻塞，且自噬小體的數(shù)量減少，而體外實驗則證明細胞外的HMGB1導致成纖維細胞內(nèi)自噬流的阻塞是濃度依賴型的，以及心臟成纖維細胞中I型膠原和α-SMA的也發(fā)生了濃度依賴型堆積。表明將HMGB1作為治療靶點，為抗纖維化治療提供了更大的潛在前景。

作為損傷相關分子模式家族（DAMPs）的重要成員，HMGB1是一個多功能的，普遍存在于細胞內(nèi)和細胞外的蛋白質(zhì)[21]，它在各種生理和病理過程中起關鍵作用，包括細胞的增殖、分化、EMT、凋亡和死亡，及免疫和各種代謝過程[21,22]。HMGB1基因剔除大鼠出生后不久即死亡，說明HMGB1對動物生存不可或缺。HMGB1參與多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展，并在多種心血管病理組織中高表達。HMGB1在動脈粥樣硬化斑塊中表達升高，HMGB1可促進斑塊的形成與發(fā)展[23,24]。受損的血管內(nèi)皮主動或者被動釋放HMGB1，促進炎癥，趨化單核/巨噬細胞和血管平滑肌細胞向內(nèi)皮遷移，促進斑塊的形成。在斑塊晚期，HMGB1可加速斑塊進展導致血栓形成[25]。急性冠脈綜合征患者血清HMGB1的濃度較非冠心病患者明顯升高，并且與發(fā)生心血管事件的風險呈正相關[26]。在臨床研究中發(fā)現(xiàn)，急性心?；颊哐錒MGB1的水平與心血管急性事件的再發(fā)生有相關性。Giallauria等發(fā)現(xiàn)心梗后進行康復訓練的患者較未進行康復訓練的患者HMGB1水平低，他們發(fā)生心肌重構、心血管事件死亡率和全因死亡率均明顯低于HMGB1水平仍高的患者[27,28]。HMGB1與心力衰竭的發(fā)生發(fā)展密切相關[29]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，心衰患者中HMGB1水平與其他心衰標志物如BNP、NYHA分級、射血分數(shù)等具有相關性。HMGB1水平不僅在心衰患者中表達升高，并且與心衰的嚴重程度相關[30]。在1型糖尿病患者中，HMGB1水平與全因死亡率、心血管事件發(fā)生率呈獨立相關性[31]。在2型糖尿病患者中，血清HMGB1水平的升高與心血管事件的發(fā)生密切相關[32]。

但HMGB1在自噬與心臟纖維化過程中的作用目前還尚未看到相關報道。胞外的HMGB1需與細胞膜表面相應的膜受體結合才能發(fā)揮其生物學效應，這包括了Toll樣模式識別受體（TLRs）和晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）[32]。TLR家族有很多成員，目前已鑒定出TLR2、TLR4、TLR9可與胞外HMGB1結合而產(chǎn)生效應。其中TLR4作為LPS（內(nèi)毒素脂多糖）受體被廣泛熟知，TLR2則主要在革蘭氏陰性細菌和真菌引起的炎癥中起作用。TLR2和TLR4基因敲除小鼠證實有減少心肌梗死面積，減輕心臟炎癥反應和改善心功能的作用[33,34]。本研究中，我們觀察到心肌纖維化與HMGB1轉(zhuǎn)移至細胞膜表面和細胞間隙有關，而沉默TLR2基因相當于阻斷HMGB1與TLR2的相互作用，從而改善心肌纖維化，這表明細胞外HMGB1可能是心肌纖維化發(fā)病機制中的危險因素。

為了明確纖維化和自噬的相關性，我們進一步檢測了異丙腎上腺素誘導的小鼠纖維化模型中自噬的標記性蛋白。p62是自噬途徑中經(jīng)典的貨車蛋白，參與自噬途徑中各種蛋白及分子的降解過程[35,36]。通過免疫印跡實驗發(fā)現(xiàn)可溶性及不可溶性p62的表達均增強，提示自噬流受到阻塞，p62發(fā)生堆積，無法將待降解底物轉(zhuǎn)運至自噬溶酶體。磷酸化mTOR與非磷酸化mTOR比例的顯著減少和LC3Ⅱ與LC3Ⅰ比例的明顯減少也提示成纖維細胞中自噬流被阻斷。由于α-SMA被認為是組織纖維化的標志，我們假設阻斷的自噬流導致了α-SMA的堆積是通過p62與α-SMA的相互作用來完成的。實際上，通過免疫共沉淀和免疫熒光共定位實驗，發(fā)現(xiàn)不論在體內(nèi)或者體外α-SMA和p62間都存在相互作用。說明沉默TLR2基因或阻斷HMGB1后恢復了阻塞的自噬流，加速了貨車蛋白p62對α-SMA的轉(zhuǎn)運和降解，減輕了α-SMA的聚集，逆轉(zhuǎn)了成纖維細胞的表型轉(zhuǎn)換，從而改善了心臟纖維化。而α-SMA和p62之間過多的相互作用也是自噬功能障礙的重要結果。

綜上所述，我們的研究結果表明異丙腎上腺素引起的心臟損傷促使HMGB1釋放到細胞外。細胞外的HMGB1與TLR2受體相互作用導致心臟成纖維細胞中的自噬功能障礙使p62發(fā)生堆積，堆積的p62反過來又阻礙了α-SMA的降解，導致了心肌纖維化。因此，將HMGB1作為治療靶點，具有重要的臨床意義和藥物研發(fā)價值。