楊盈悅，朱羽莊，梅光明，李晉成

（1.浙江海洋大學(xué) 食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 舟山316021；2.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江 舟山316021；3.浙江省海水增養(yǎng)殖重點實驗室，浙江舟山316021；4.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院，北京100141）

孔雀石綠和結(jié)晶紫是人工合成的三苯甲烷類染料，由于價格低廉且具有較好的驅(qū)蟲和殺菌效果，曾在水產(chǎn)養(yǎng)殖中被廣泛用于環(huán)境消毒和治療水霉病、腮霉病等［1-2］?？兹甘G和結(jié)晶紫容易代謝轉(zhuǎn)化為化學(xué)性質(zhì)更穩(wěn)定、毒性更強(qiáng)的隱色孔雀石綠和隱色結(jié)晶紫，在生物體和環(huán)境中代謝緩慢、殘留時間長。研究表明，孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝物均致癌、致畸和致突變［3-4］，因此，包括我國在內(nèi)的很多國家都將孔雀石綠和結(jié)晶紫列為禁用藥物［5］。由于孔雀石綠和結(jié)晶紫曾被廣泛使用，造成部分養(yǎng)殖環(huán)境被污染，經(jīng)常有養(yǎng)殖戶反映，在養(yǎng)殖過程中并未使用孔雀石綠類藥物，卻在產(chǎn)品中被檢出，推測可能由環(huán)境中的歷史殘留引起。目前，對孔雀石綠的監(jiān)測主要集中在水產(chǎn)品終端［6-8］，對漁業(yè)養(yǎng)殖水體環(huán)境中的孔雀石綠類污染狀況關(guān)注較少。為監(jiān)測并掌握孔雀石綠污染情況，保障養(yǎng)殖水產(chǎn)品的質(zhì)量安全，有必要建立一套對養(yǎng)殖水體中孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝物的檢測方法。

水體中孔雀石綠的常用檢測方法有液相色譜法［9-11］、酶聯(lián)免疫法［12］、液質(zhì)聯(lián)用法［13-15］、熒光探針法［16?17］、納米電化學(xué)傳感器法［18］等。其中，液質(zhì)聯(lián)用法無論在定性判斷上或在定量的準(zhǔn)確性上均具絕對優(yōu)勢，其他方法存在特異性不強(qiáng)、容易出現(xiàn)假陽性和檢測限較高等缺點，且現(xiàn)有方法中可檢測到的目標(biāo)物很少能覆蓋孔雀石綠和結(jié)晶紫及其代謝物4種組分。本文以二氯甲烷液液萃取結(jié)合活塞式中性氧化鋁分散固相萃取凈化，以氘代同位素物為內(nèi)標(biāo)物，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，實現(xiàn)了對養(yǎng)殖水體中孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝物殘留量的快速準(zhǔn)確檢測，為對漁業(yè)養(yǎng)殖水體的環(huán)境監(jiān)測提供了方法和分析手段。

1 實 驗

1.1 儀器與試劑

實驗所用儀器為ACQUITY H-Class UPLC–xevo TQS串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Waters公司）；Centrifuge 5810高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；R-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司出品）；MS2漩渦混合器（德國IKA公司）。

實驗所用試劑為Milli-Q超純水系統(tǒng)制備的高純水；乙腈（色譜純，Merk公司）；甲酸（色譜純，sigma公司）；乙酸銨（色譜純，美國TEDIA公司）；鹽酸羥胺（分析純，上海國藥集團(tuán)公司）；孔雀石綠（MG）、隱色孔雀石綠（LMG）、結(jié)晶紫（CV）和隱色結(jié)晶紫（LCV）標(biāo)準(zhǔn)品（純度均在98%以上）（德國Dr公司）；氘代孔雀石綠（MG_D5）、氘代隱色孔雀石綠（LMG_D6）、氘代結(jié)晶紫（CV_D6）、氘代隱色結(jié)晶紫（LCV_D6）標(biāo)準(zhǔn)品（純度均在98%以上）（德國WITEGA公司）；中性氧化鋁SPE填料（100～300目）、C18SPE填料（40～63μm）和PSA QuEChERS專用填料（40～63μm）（上海安譜公司）。

1.2 溶液配制

目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)儲備液和混合外標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)使用液的配置：分別準(zhǔn)確稱取適量的MG、LMG、CV、LCV標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶液溶解并定容，配成濃度為100μg·mL-1的目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-18℃冷凍保存。再用乙腈將4種目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋為0.1μg·mL-1的混合目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)使用液，于-18℃避光保存。

內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)儲備液和混合內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)使用液的配置：分別準(zhǔn)確稱取適量的MG_D5、LMG_D6、CV_D6和LCV_D6標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶解并定容，配成濃度為100μg·mL-1的內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-18℃冷凍保存。再用乙腈將4種內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋為0.1μg·mL-1的混合內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)使用液，于-18℃避光保存。

1.3 實驗方法

1.3.1 水樣預(yù)處理

按采樣點均勻分布原則，在每個養(yǎng)殖水域采集3個水樣，各500 mL，充分混合后抽濾，去除懸浮物等固形物。

量取水樣100 mL，置于500 mL分液漏斗中，加入20μL濃度為0.1μg·mL-1的混合內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)使用液和2 mL 20%的鹽酸羥胺溶液，再加入50 mL二氯甲烷，劇烈振搖萃取5 min，靜置30 min，分層后取下層二氯甲烷于150 mL梨形瓶中，再向分液漏斗加入50 mL二氯甲烷，重復(fù)萃取一次（若分層不明顯，取其下層液于50 mL離心管中，6 000 r·min-1離心3 min，再取下層液），將兩次萃取的二氯甲烷合并置于40℃水浴減壓濃縮至近干，用1 mL乙腈復(fù)溶，拉動活塞式分散固相萃取凈化柱（裝填中性氧化鋁粉末50 mg，預(yù)先用2.5 mL乙腈沖洗柱子）抽取復(fù)溶液，推動活塞并接收流出液，再加入5.0 mmoL·L-1乙酸銨溶液并定容至2.0 mL，過0.22μm有機(jī)相濾膜后供UPLC-MS/MS儀測定。

1.3.2 色譜及質(zhì)譜條件

色譜條件：Acquity UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7μm）；柱溫40℃；進(jìn)樣量5μL；流動相由5 mmol·L-1乙酸銨緩沖溶液（用甲酸調(diào)節(jié)p H為4.5，A）和乙腈（B）組成；梯度洗脫程序：0～1.50 min、5%～50%A（線 性 改 變），1.50～3.50 min、5%A，3.50～4.00 min、5%～50%A（線性改變），4.0～5.0 min、50%A；流速0.3 mL·min-1。

質(zhì)譜條件：電噴霧正離子（ESI+）模式；毛細(xì)管電壓1.70 k V，源補(bǔ)償電壓50 V；脫溶劑溫度600℃；脫溶劑氣流量600 L·h-1，錐孔氣流量150 L·h-1；霧化壓力0.7 MPa；多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）掃描模式。目標(biāo)物母離子、子離子、錐孔電壓、碰撞能量和掃描時間等質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測條件見表1。MG、LMG、CV和LCV分別以MG_D5、LMG_D6、CV_D6和LCV_D6為內(nèi)標(biāo)物，按照內(nèi)標(biāo)法由MassLynx軟件自動計算質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

表1 質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測條件Table 1 MRM conditions for mass spectrometry

2 結(jié)果與分析

2.1 液相色譜與質(zhì)譜分析條件的確定

2.1.1 液相色譜條件的確定

以Acquity UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7μm）為液相色譜分離柱，5 mmol·L-1乙酸銨緩沖溶液（含甲酸0.1%）和乙腈為流動相，在梯度洗脫程序下，可將漁業(yè)養(yǎng)殖水體中孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝物隱色孔雀石綠和隱色結(jié)晶紫4種目標(biāo)物與樣品基質(zhì)完全分離，無干擾，在5 min內(nèi)全部出峰，且色譜峰型明顯，峰響應(yīng)強(qiáng)度高，0.2μg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液響應(yīng)強(qiáng)度可達(dá)到e5，見圖1。

2.1.2 質(zhì)譜分析條件的確定

在ESI+模式下，分別將0.1μg·mL-1的MG、LMG、CV、LCV、MG_D5、LMG_D6、CV_D6和LCV_D6標(biāo)準(zhǔn)品溶液通過蠕動泵進(jìn)樣，采用一級質(zhì)譜分析MS SCAN，得到各目標(biāo)物的母離子信息，并對子離子進(jìn)行二級質(zhì)譜分析，得到碎片離子信息，同時進(jìn)一步優(yōu)化錐孔電壓和碰撞能量等參數(shù)，使母離子和子離子的響應(yīng)最大化。優(yōu)化后的質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測條件如表1所示。

2.2 水樣前處理條件的確定

2.2.1 前處理方法的選擇

水體中孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝物濃度低，對目標(biāo)物進(jìn)行富集以降低檢測限。在目前已有的關(guān)于水體中孔雀石綠類測定的文獻(xiàn)中，多采用液液萃取法［19］或固相萃取法［20-21］進(jìn)行樣品前處理。固相萃取法在去除雜質(zhì)和降低基質(zhì)干擾上有較大優(yōu)勢，但在常規(guī)操作中，若取樣體積過小，易出現(xiàn)富集倍數(shù)不足和靈敏度較低的問題；若為提高富集倍數(shù)和降低檢出限而增大取樣體積，則會增加固相萃取操作的復(fù)雜性，使檢測時長大大增長，影響檢測效率?？紤]漁業(yè)養(yǎng)殖水體基質(zhì)相對簡單，待測組分孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝物在有機(jī)溶劑中溶解性好，因此選擇液液萃取法進(jìn)行水樣前處理。液液萃取法操作簡單，不必用固相萃取中成本相對較高的SPE小柱，檢測成本低；還可通過大體積取樣提高目標(biāo)物的富集倍數(shù)，達(dá)到降低檢出限的目的，對富集后的樣品進(jìn)行吸附除雜，有利于降低基質(zhì)干擾。

2.2.2 液液萃取條件的確定

孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝物在二氯甲烷中均有很好的溶解性，且二氯甲烷在水中的溶解度低，因此選擇二氯甲烷作為反萃取試劑進(jìn)行液液萃取。在100 mL水樣中分別添加10μL濃度為0.10μg·mL-1的MG、LMG、CV和LCV的4種混合目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)使用液（添加濃度約為10 ng·L-1）和20μL濃度為0.10μg·mL-1的混合內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)使用液，二氯甲烷的萃取體積分別為30，40，50，60，70 mL，進(jìn)行樣品前處理，結(jié)果見圖2。由圖2可知，當(dāng)萃取體積為50 mL時，4種目標(biāo)物的平均絕對回收率較高，繼續(xù)增大萃取體積，回收率提高不明顯，因此，選擇50 mL作為萃取體積。

圖1 0.2μg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatogram of 0.2μg·L-1 standard solution

圖3為分別用50 mL二氯甲烷液液萃取1，2，3次時4種目標(biāo)物的平均絕對回收率情況。由圖3可知，萃取2次時的平均絕對回收率較萃取1次時有明顯提高，但萃取3次時的平均絕對回收率較萃取2次時無明顯改善，因此，選擇萃取2次。

圖4為采用50 mL二氯甲烷液液萃取2次、振蕩時間分別為2，3，5，6和8 min時4種目標(biāo)物的平均絕對回收率情況。由圖4可知，在振蕩時間為2～5 min時，隨單次振蕩時間的增加，平均絕對回收率均逐漸提高；當(dāng)振蕩時間超過5 min后，繼續(xù)增長振蕩時間，平均絕對回收率無明顯提高，因此，選擇單次振蕩的時間為5 min。

2.2.3 分散固相萃取凈化條件

采用2 mL活塞式分散固相萃取凈化柱，拉動活塞將復(fù)溶液轉(zhuǎn)移至含有凈化填料的凈化柱，推動活塞將凈化后的提取液轉(zhuǎn)移至離心管，加入5.0 mmoL·L-1乙酸銨緩沖溶液（0.1%甲酸）并定容至2 mL，過0.22μm濾膜后上機(jī)分析。分別裝填50 mg乙二胺-N-丙基硅烷顆粒（PSA）、50 mg十八烷基鍵合硅膠顆粒（C18）和50 mg中性氧化鋁，并比較經(jīng)3種填料吸附除雜后的平均絕對回收率（見圖5）。由圖5可知，C18對LMG、LCV的吸附作用較強(qiáng)，導(dǎo)致二者的平均絕對回收率很低；PSA對4種目標(biāo)物均有一定的吸附作用，且對MG、CV的吸附作用強(qiáng)于LMG和LCV；中性氧化鋁的整體吸附作用優(yōu)于PSA和C18，對4種目標(biāo)物的吸附作用較小，平均絕對回收率較高。漁業(yè)養(yǎng)殖水體的基質(zhì)相對較簡單，但考慮部分水樣可能存在因含較多的水藻、殘留餌料及水體富營養(yǎng)化帶來的基質(zhì)干擾效應(yīng)，可用活塞式中性氧化鋁分散固相萃取凈化柱進(jìn)行凈化，此方法操作簡單，對水體中色素類雜質(zhì)具有明顯的吸附除雜作用，從而降低基質(zhì)干擾，提高分析物的絕對回收率。

圖2 萃取體積對平均絕對回收率的影響Fig.2 Effect of extraction volume on average absolute recovery

圖3 萃取次數(shù)對平均絕對回收率的影響Fig.3 Effect of extraction times on average absolute recovery

圖4 萃取時間對平均絕對回收率的影響Fig.4 Effect of extraction time on average absolute recovery

圖5 不同填料凈化方式對平均絕對回收率的影響Fig.5 Effect of different packing purification methods on the average absolute recovery

2.3 方法確認(rèn)

2.3.1 準(zhǔn)確度和精密度

在浙江省舟山市朱家尖某大黃魚養(yǎng)殖場采集水樣，經(jīng)檢測不含MG、CV及其代謝物。將其作為空白水樣，進(jìn)行不同添加濃度的加標(biāo)回收率實驗，考查方法的準(zhǔn)確率（以內(nèi)標(biāo)法計算加標(biāo)回收率）和精密度。取100 mL樣品，設(shè)置4個加標(biāo)水平，每個加標(biāo)水平設(shè)6個平行組，每個加標(biāo)水平重復(fù)3次，添加濃度、加標(biāo)回收率及精密度測定結(jié)果見表2。結(jié)果表明，在養(yǎng)殖海水基質(zhì)5～100 ng·L-1添加濃度下，MG、CV及其代謝物的平均加標(biāo)回收率為81.8%～109.5%，批內(nèi)精密度和批間精密度均小于10%，表明該方法的準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好。

2.3.2 方法的檢測限及線性范圍

分別配制MG、LMG、CV和LCV 4種目標(biāo)物工作 濃 度 為0.20，0.50，1.0，2.0和5.0μg·L-1，其 中MG_D5、LMG_D6、CV_D6和LCV_D6內(nèi)標(biāo)物濃度均為1.0μg·L-1。用4種目標(biāo)物峰的質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度和濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算相關(guān)系數(shù)，以信噪比（S/N）為3的響應(yīng)強(qiáng)度的目標(biāo)物濃度作為方法檢測限，以S/N≥10，且回收率大于70%的濃度作為方法定量限。4種目標(biāo)物的曲線方程及相關(guān)系數(shù)、檢測限與定量限如表3所示。由表3可知，MG、LMG、CV和LCV在0.2～5.0μg·L-1濃度范圍內(nèi)曲線方程均呈較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0.998，方法檢測限和定量限分別為2.0 ng·L-1和5.0 ng·L-1。

表2 養(yǎng)殖海水中MG、CV及其代謝物的加標(biāo)回收率與精密度實驗（n=6）Table 2 Recovery and precision test of MG，CV and metabolites from aquaculture seawater when n=6

表3 MG、LMG、CV和LCV的工作曲線方程Table 3 Working curve equations of MG，LMG，CV and LCV

2.3.3 實際樣品驗證

用40 L的魚缸養(yǎng)殖鯽魚數(shù)尾（體重為100～150 g·尾-1），用人為添加MG和CV污染濃度均為25.0μg·kg-1的配合飼料連續(xù)投喂4 d，投喂量為魚體重的1/20，2 d后對養(yǎng)殖水樣按照本研究方法進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水樣中均檢出MG、LMG、CV和LCV，濃 度 分 別 為0.007 1，0.025 0，0.008 4和0.028 0μg·L-1。結(jié)果表明，本方法能滿足漁業(yè)養(yǎng)殖水體中MG、CV及其代謝物痕量檢測要求。

另外，結(jié)合筆者團(tuán)隊承擔(dān)的浙江省養(yǎng)殖魚產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測任務(wù)，同時對21處水產(chǎn)養(yǎng)殖水體進(jìn)行了取樣檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，某地的1份烏鱧養(yǎng)殖水體中檢出LMG，濃度為0.006 7μg·L-1，該地生產(chǎn)的烏鱧樣品中也檢出LMG，濃度為1.550 0μg·kg-1。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液穩(wěn)定性實驗

標(biāo)準(zhǔn)溶液穩(wěn)定性對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確率至關(guān)重要，因此對標(biāo)準(zhǔn)溶液的儲存有效期進(jìn)行了探究。將新配置的100μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)儲備液分裝，密封后于-18℃冷存，每隔30 d取出1瓶，恢復(fù)至室溫后稀釋至1.0μg·L-1，用液質(zhì)進(jìn)行測定，記錄每次測定的峰面積，同時測定新鮮配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積。以每次新鮮配制溶液的峰面積為基準(zhǔn)（100%），記錄在30～240 d時相應(yīng)組分的峰面積，計算并比較峰面積比例，用以表征標(biāo)準(zhǔn)儲備液的穩(wěn)定性，見圖6。由圖6知，MG貯存時間在180 d內(nèi)時，峰面積為新鮮配制溶液峰面積的99.2%～95.7%，貯存時間在210和240 d時，峰面積分別為新鮮配制溶液峰面積的93.2%和92.1%；LMG貯存時間在180 d內(nèi)時，峰面積為新鮮配制溶液峰面積的99.5%～97.3%，貯存時間在210和240 d時，峰面積分別為新鮮配制溶液峰面積的96.2%和94.3%；CV貯存時間在180 d內(nèi)時，峰面積為新鮮配制溶液峰面積的98.5%～95.4%，貯存時間在210和240 d時，峰面積分別為新鮮配制溶液峰面積的94.7%和92.4%；LCV貯存時間在180 d內(nèi)時，峰面積為新鮮配制溶液峰面積的99.1%～96.2%，貯存時間在210和240 d時，峰面積分別為新鮮配制溶液峰面積的95.7%和94.2%；MG_D5貯存時間在180 d內(nèi)時，峰面積為新鮮配制溶液峰面積的98.5%～95.0%，貯存時間在210和240 d時，峰面積分別為新鮮配制溶液峰面積的93.4%和92.1%；LMG_D6貯存時間在180 d內(nèi)時，峰面積為新鮮配制溶液峰面積的98.2%～95.2%，貯存時間在210和240 d時，峰面積分別為新鮮配制溶液峰面積的93.1%和91.7%；CV_D6貯存時間在180 d內(nèi)時，峰面積為新鮮配制溶液峰面積的98.4%～94.2%，貯存時間在210和240 d時，峰面積分別為新鮮配制溶液峰面積的93.8%和92.0%；LCV_D6貯存時間在180 d內(nèi)時，峰面積為新鮮配制溶液峰面積的98.5%～94.7%，貯存時間在210和240 d時，峰面積分別為新鮮配制溶液峰面積的93.2%和90.7%。因此確定8種標(biāo)準(zhǔn)儲備液在-18℃條件下的貯存時間不宜超過180 d。

圖6 標(biāo)準(zhǔn)儲備液穩(wěn)定性研究Fig.6 Study on stability of standard reserve fluid

將新配制的0.1μg·mL-1的混合目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)使用液和混合內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)使用液分裝，密封后于-18℃下冷存，每隔2 d取出1瓶，恢復(fù)至室溫后稀釋至1.0μg·L-1，用液質(zhì)進(jìn)行測定，記錄每次測定的峰面積，同時測定新鮮配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積。以新鮮配制溶液的峰面積為基準(zhǔn)（100%），記錄不同取樣時間測定的相應(yīng)組分的峰面積，計算并比較峰面積比例，以表征標(biāo)準(zhǔn)使用液的穩(wěn)定性，見圖7。由圖7知，貯存時間在34 d內(nèi)，MG峰面積為新鮮配制溶液峰面積的99.6%～92.7%，LMG峰面積為新鮮配制溶液峰面積的99.5%～94.3%，CV峰面積為新鮮配制溶液峰面積的99.6%～89.4%，LCV峰面積為新鮮配制溶液峰面積的99.3%～93.7%，MG_D5峰面積為新鮮配制溶液峰面積的99.1%～89.4%，LMG_D6峰面積為新鮮配制溶液峰面積的99.6%～90.2%，CV_D6峰面積為新鮮配制溶液峰面積的99.5%～92.7%，LCV_D6峰面積為新鮮配制溶液峰面積的99.7%～93.1%；貯存時間為30 d時，MG、LMG、CV、LCV、MG_D5、LMG_D6、CV_D6和LCV_D6的峰面積分別為新鮮配制溶液峰面積的94.2%，95.2%，93.9%，94.2%，93.6%，93.9%，94.1%和94.2%。因此，確定8種標(biāo)準(zhǔn)使用液在-18℃條件下的貯存時間不應(yīng)超過30 d。

圖7 標(biāo)準(zhǔn)使用液穩(wěn)定性研究Fig.7 Study on the stability of standard service liquid

3 結(jié) 論

建立了用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測漁業(yè)養(yǎng)殖水體中的MG、CV及其代謝物殘留量的方法。采用二氯甲烷液液萃取法，結(jié)合活塞式中性氧化鋁分散固相萃取凈化柱，前處理方法簡單快捷。該方法準(zhǔn)確率高、重現(xiàn)性好，可較好地用于漁業(yè)養(yǎng)殖水體中MG及CV殘留量的監(jiān)測。