石豐運(yùn) 朱廣琴 顧開朗 王 兵

（徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院動物工程學(xué)院，江蘇徐州 221100）

目前，由于非洲豬瘟疫情的影響，導(dǎo)致牛肉粉、雞肉粉、鴨肉粉等飼料原料中摻雜豬肉粉現(xiàn)象頻發(fā)，此現(xiàn)象導(dǎo)致疾病的防控難度增大，同時對很多企業(yè)的發(fā)展產(chǎn)生了不利的影響，有必要采用科學(xué)的方法來對動物源性成分進(jìn)行檢測分析，以此發(fā)現(xiàn)在原料以及相關(guān)制品中存在的問題。當(dāng)前對于動物源性成分檢測的研究逐步增多，形成了多種類型的檢測方法，一般劃分為2種，第1種是蛋白質(zhì)檢測法（常用的有ELISA[1]、色譜法[2]等），第2種是核酸檢測方法（包括PCR方法[3,4]等）。然而此類方法依然無法滿足實(shí)際檢測的要求。因此，需要在動物源性成分檢測方面進(jìn)行更深入的研究，進(jìn)一步提升檢測的效率和精度，旨在確保我國動物飼料產(chǎn)品的安全使用。本研究主要采用基因芯片檢測法，選取mtDNA 18S rRNA作為靶基因，在優(yōu)化PCR擴(kuò)增體系之后構(gòu)建了基因芯片檢測方法，實(shí)現(xiàn)了對動物源性成分的檢測。

基因芯片技術(shù)在應(yīng)用過程中需要先對樣本核酸進(jìn)行熒光標(biāo)記，然后再進(jìn)行雜交，并將未有效結(jié)合的DNA片段進(jìn)行剔除，在此基礎(chǔ)上掃描芯片，以此可以對雜交信號的強(qiáng)度進(jìn)行有效地檢測。針對采集到的數(shù)據(jù)采用專業(yè)的軟件進(jìn)行處理，可以得到需要的樣本序列信息[5,6]?；蛐酒夹g(shù)的優(yōu)勢在于性價比高、高通量等，屬于一種新型的檢測技術(shù)[7-9]。

1 材料與方法

1.1 樣品

研究采用的檢測樣品均由江蘇省徐州市的飼料企業(yè)提供，主要有雞肉粉、牛肉粉、豬肉粉、狗肉粉、魚肉粉等15種。

1.2 試劑和儀器

采用的試劑主要如下：Ex Taq DNA聚合酶、DNA Marker DL 2 000等來自于生工生物工程（上海）股份有限公司；核酸雜交液來自于南京森貝伽生物科技有限公司；DNA提取試劑來自天根生化科技（北京）有限公司；醛基化DNA芯片基片等來自北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司。

試驗(yàn)中采用的儀器如下：Axon的激光共聚焦掃描儀（GenePix4200A）；BioDot的GenePix 4200A掃描儀；Gene Genius的凝膠成像系統(tǒng)；DU800（Beckman）；北京六一儀器有限公司的ABI Verti PCR儀。

1.3 引物和探針

研究中參照并設(shè)計(jì)了通用引物、檢測性探針，主要基于Oligo 6.0設(shè)計(jì)，并通過上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。質(zhì)控探針主要有陰性質(zhì)控探針等。通用引物、檢測探針及質(zhì)控探針序列信息如表1所示。

表1 通用引物、檢測探針及質(zhì)控探針序列

1.4 芯片的制備

制備芯片過程中需要依據(jù)合理的流程進(jìn)行操作，首先需要通過1×TE緩沖液對固相探針進(jìn)行溶解，并達(dá)到40 μmol/L的要求。然后依次在384孔中添加0.5 g/mL DMSO混合液、探針溶液，二者均為10 μL，添加完成后混合均勻，以50%DMSO作為對照。在基片點(diǎn)樣結(jié)束后需要先置于溫度控制在37℃的烘箱內(nèi)保持12 h；上述過程完成后進(jìn)行漂洗并置于2 g/L NaBH4中0.25 h；最后進(jìn)行漂洗、離心等操作，并將最終的產(chǎn)物置于避光條件下存儲，溫度保持在4℃。

表2 基因芯片探針排布情況

1.5 熒光標(biāo)記PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系：正、反向引物（10 μmol/L）均為0.5 μL；10×緩沖液、Cy5-dNTPs 分別為 3.0 μL、0.4 μL；Taq 聚合酶 0.2μL（5 U/mL）；DNA 模板（10～20 ng/μL） 1 μL、加 dd H2O 補(bǔ)足至 25 μL。采用H2O作為對照組，便于進(jìn)行對比分析。擴(kuò)增條件依次進(jìn)行4個處理過程，分別是預(yù)變性、變性、退火以及延伸處理，各個階段的處理時間分別為5 min、0.5 min、0.5 min、0.5 min，溫度分別為 95℃、94℃、58℃、72℃，循環(huán)次數(shù)為35；在上述過程結(jié)束后進(jìn)行延伸，時間為10min，溫度為72℃，最后凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.6 芯片雜交及掃描

選取適量的PCR標(biāo)記產(chǎn)物、Cy5陽性探針互補(bǔ)鏈、芯片雜交液，分別為5 μL、1 μL、6 μL；變性處理時間為4 min，溫度為94℃；冰浴3 min。加入點(diǎn)樣區(qū)進(jìn)行雜交，時間為1.5 h，烘箱溫度控制在55℃。結(jié)束后將產(chǎn)物置于43℃洗液I（0.3×SSC）、洗液Ⅱ（0.06×SSC）清洗，時間均為5 min；最后進(jìn)行離心處理，時間為150 s，1 500 r/min；離心完成后進(jìn)行干燥。

1.7 特異性試驗(yàn)

為更好地評價小芯片技術(shù)的特異性，在試驗(yàn)中選取了15種不同種的動物源性肉粉，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對得到的產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步分析和處理，便于對特異性進(jìn)行分析。

1.8 靈敏度試驗(yàn)

在試驗(yàn)過程中采用核酸蛋白分析儀測定提取樣品DNA的質(zhì)量濃度，其中DNA模板母液設(shè)置為100 ng/μL，然后進(jìn)行稀釋，梯度主要有6個，即10-1～10-6，用于靈敏度試驗(yàn)檢測（圖1）。

圖1 靈敏度試驗(yàn)PCR電泳圖

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光標(biāo)記PCR擴(kuò)增結(jié)果

將豬、牛、雞、鴨等的DNA模板應(yīng)用熒光標(biāo)記法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖2，豬、牛、雞、鴨的4對通用引物有效擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物序列長度分別在233 bp、233 bp、238 bp和239 bp，空白對照無擴(kuò)增條帶，表明本試驗(yàn)所建立的PCR反應(yīng)體系特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性好，為下一步探針能夠有效特異性雜交提供了條件。

圖2 通用引物動物源性PCR擴(kuò)增圖

2.2 基因芯片特異性檢測結(jié)果

對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，基于1.6方法完成雜交過程，結(jié)果（如圖3）發(fā)現(xiàn)4條探針和產(chǎn)物的雜交信號均正常，而與其他產(chǎn)物則不存在雜交信號。另外，試驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)假陽性數(shù)據(jù)。由此證明，采用基因芯片技術(shù)具有較高的可靠性與準(zhǔn)確性，能夠有效檢測出4種動物源性成分類型。結(jié)合上述分析，可以基于該方法實(shí)現(xiàn)對飼料成分的特異性檢測。

圖3 特異性檢測雜交結(jié)果

2.3 基因芯片靈敏度檢測結(jié)果

在試驗(yàn)過程中采用的材料主要是鴨肉粉、牛肉粉，檢測是否可以達(dá)到較高的靈敏度要求。試驗(yàn)中選擇的反應(yīng)模板主要是5 μL豬、鴨DNA溶液，二者含有的DNA依次為 5 000 pg、500 pg、50 pg、5 pg、0.5 pg、0.05 pg，對應(yīng)著圖中所示的序號為1～6。在PCR擴(kuò)增完成后進(jìn)行雜交反應(yīng)，特異性結(jié)合位點(diǎn)信號隨DNA濃度的降低而不斷變?nèi)酰▓D4），即二者體現(xiàn)出一定的正相關(guān)性。根據(jù)最終得到的試驗(yàn)結(jié)果可知，雜交信號的強(qiáng)弱與2種材料的強(qiáng)弱直接相關(guān)，在二者含量為10-6時，沒有形成雜交信號；而達(dá)到10-5的含量時，形成了雜交信號，但是并不顯著。所以可以認(rèn)為檢測的靈敏度達(dá)到了10-5。

圖4 基因芯片的靈敏度檢測結(jié)果示意圖

2.4 基因芯片穩(wěn)定性檢測結(jié)果

針對通用引物進(jìn)行PCR熒光標(biāo)記擴(kuò)增，根據(jù)1.6基因芯片雜交方法，進(jìn)行批次間和批次內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明在相同雜交條件下，批次間和批次內(nèi)的雜交信號較為穩(wěn)定，信號中位值的變異系數(shù)均小于5.15%，試驗(yàn)檢測結(jié)果顯示不同批次或同一批次的基因芯片均具有較好的可重復(fù)性。

3 討論

近年來，基因芯片檢測技術(shù)發(fā)展迅速，應(yīng)用潛力巨大，并開始應(yīng)用到了生物成分檢測中。其應(yīng)用的優(yōu)勢體現(xiàn)在高通量、高靈敏度、高精度、高效率等方面，顯示出良好的應(yīng)用前景[11]。本研究主要分析了基因芯片法對飼料中動物源性成分檢測的應(yīng)用，并通過PCR結(jié)合基因芯片技術(shù)完成了檢測的過程，達(dá)到了較好的檢測效果。由此可知，在飼料中的動物源性成分檢測中可以采用基因芯片檢測方法，且基因芯片檢測法在檢測的效率以及精度上均可以滿足實(shí)際檢測的要求。

重點(diǎn)分析了基因芯片檢測方法的特異性主要與通用引物以及目標(biāo)基因有關(guān)。在試驗(yàn)中設(shè)計(jì)了不同動物的特異性探針，并結(jié)合通用引物進(jìn)行選擇，進(jìn)一步提高了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。此外，還針對基因芯片檢測技術(shù)的靈敏度和重復(fù)性進(jìn)行了試驗(yàn)，根據(jù)得到的試驗(yàn)結(jié)果可知，在檢測鴨肉粉、豬肉粉時的靈敏度較高，達(dá)到了10-5。相對于常規(guī)PCR等檢測技術(shù)，在檢測靈敏度上體現(xiàn)出一定的優(yōu)勢[12,13]，適合于應(yīng)用到實(shí)際的動物源性成分檢測中，確保飼料以及其他肉制品達(dá)到較高的質(zhì)量要求。

采用的PCR—基因芯片檢測技術(shù)顯示出一定的優(yōu)勢，在動物源性成分檢測中靈敏度較高，同時特異性比較顯著，可以同時對不同類型的動物源性成分進(jìn)行檢測。研究主要以飼料中雞、鴨、豬、牛等4種動物源性成分的檢測為例進(jìn)行了分析，驗(yàn)證了該方法的應(yīng)用效果，為其他飼料中的動物源性成分檢測提供了借鑒。此外，基于該技術(shù)進(jìn)行動物源性成分檢測的效率較高，節(jié)約了檢測的時間，降低了檢測成本，為國內(nèi)肉制品以及飼料成分的檢測提供了理論支撐。由此可知，該基因芯片檢測技術(shù)顯示出較大的應(yīng)用潛力，能夠?yàn)閷?shí)際的檢測工作提供必要的保障。