張美珍 李登云 胡丹蘭

肺癌的發(fā)病率在所有惡性腫瘤中占比較高，且逐年增長(zhǎng)［1-2］，其中大多數(shù)屬于非小細(xì)胞肺癌。探討肺癌發(fā)病的相關(guān)機(jī)制與尋求有效、合適的治療藥物，向來(lái)是一項(xiàng)重大課題。大黃素（EM）是從大黃類植物中提取的有效活性成分，研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)淋巴肉癌和肺癌等具有抑制作用，是具有很高藥用性的生物抑制劑［3-5］。細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（ERK1/2）是細(xì)胞中信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵蛋白，M2型丙酮酸脫氫酶（PKM2）是ERK1/2的下游調(diào)控因子，在腫瘤相關(guān)蛋白P53的表達(dá)中發(fā)揮重要作用，而P53可以有效促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。本研究旨在觀察大黃素對(duì)肺癌細(xì)胞中ERK1/2-PKM2/P53信號(hào)通道的影響，為肺癌的臨床治療提供新的科學(xué)思路。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器 人體非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞（ATCC）；大黃素（CAS：32507-66-7；純度＞97%，上海同田生物技術(shù)有限公司）；DMEM培養(yǎng)基（高糖型）（CAS：HL12049.1，上海哈靈生物技術(shù)有限公司）；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清（CAS：16000-044，Gibco）；青鏈霉素（CAS：P1400，純度：98%，貴州賽蘭博科技有限公司）；MTT粉劑（CAS：298-93-1，上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司）；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CAS：ZP328，Genview）；transwell小室（CAS：3415，Corning Life Sciences）二甲基亞砜（CAS：67-68-5，aladdin）；膜聯(lián)蛋白APC（CAS：KA3808，上海哈靈生物技術(shù)有限公司）；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（CAS：40302ES20，Merck）；酶標(biāo)儀（CAS：Multiskan FC，賽默飛）；流式細(xì)胞儀（CAS：AttuneNxT，賽默飛）；熒光定量PCR（CAS：PikoReal，BIO-RAD）；Western濕電轉(zhuǎn)膜儀（Trans-Blot-cell）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 （1）細(xì)胞培養(yǎng)：將肺腺癌細(xì)胞制成懸液，之后置于胎牛血清培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2的孵箱中培養(yǎng)。（2）分組：將培養(yǎng)好的細(xì)胞分為藥劑組和溶劑組。其中，藥劑組按加入大黃素濃度的不同分為藥劑A組（大黃素濃度50 μg/ml）、藥劑B組（大黃素濃 100 μg/ml）、藥劑 C 組（大黃素濃度 150 μg/ml）、藥劑D組（大黃素濃度200 μg/ml）；溶劑組加入等量不含大黃素的溶劑（大黃素濃度0 μg/ml）。（3）MMT實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，稀釋成3×104個(gè)/ml，接種于孔板，每孔100 μl。以培養(yǎng)液為空白對(duì)照，溶劑組和藥劑組各亞組均設(shè)5個(gè)復(fù)孔，在設(shè)定好參數(shù)的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h之后，每孔加入20 μl MTT，等待4 h后吸出上清，每孔加150 μl二甲基亞砜，震蕩，處理好樣品后將流式細(xì)胞儀波長(zhǎng)設(shè)定為490 nm進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算細(xì)胞的抑制率。（4）Transwell 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：取稀釋的人工基質(zhì)膠l25 μl加入transwell板上室，使膠覆蓋整個(gè)聚碳酸酯膜，然后在設(shè)定好參數(shù)的培養(yǎng)箱中放置，使人工基質(zhì)膠聚合；取對(duì)數(shù)期待測(cè)細(xì)胞，調(diào)整濃度為2×105個(gè)/ml，上室接種處理后肺癌細(xì)胞懸液，下室用初始的培養(yǎng)基做趨化因子；將細(xì)胞分組并置于設(shè)置好參數(shù)的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后用工具擦去凝膠和膜上表面的細(xì)胞，處理完畢后進(jìn)行細(xì)胞固定，結(jié)晶紫染色20 min，再使用PBS清洗多次；顯微鏡下計(jì)數(shù)，選取四周和中間5個(gè)方向隨機(jī)范圍內(nèi)的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算取平均值。（5）檢測(cè)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)期肺癌細(xì)胞，接種到6孔板中，每孔約2×105個(gè)細(xì)胞，置于設(shè)置好參數(shù)的培養(yǎng)箱中，根據(jù)細(xì)胞分組按照檢測(cè)試劑盒提供的操作步驟分別處理，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡情況，計(jì)算結(jié)果。（6）Western blot蛋白檢測(cè)實(shí)驗(yàn)：將肺癌細(xì)胞分為溶劑組和藥劑A、B、C、D四組，培養(yǎng)48 h，之后進(jìn)行蛋白提取和蛋白定量。將樣品放在沸水中加熱至蛋白完全變性，拿出冷卻至室溫，進(jìn)行電泳與轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后進(jìn)行封閉及免疫雜交，清洗好的膜用封閉緩沖液常溫封閉1 h，用洗膜液3次，一抗4 ℃孵育，過(guò)夜，洗膜，二抗常溫下孵育1 h，洗膜，處理完畢后，用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯影處理，拍照，采用ImageJ軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)所得條帶進(jìn)行定量分析，計(jì)算結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，兩兩比較采用LSD-t法，多組比較采用單向方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組MMT實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 隨著大黃素濃度的增加，肺癌細(xì)胞的抑制率明顯增加，呈濃度依賴性（P＜0.05）。見表 1、圖 1。

表1 各組MMT實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（n=5）

圖1 大黃素濃度與抑制率變化折線圖

2.2 各組肺癌細(xì)胞侵襲能力比較 藥劑組侵襲細(xì)胞的數(shù)量明顯低于溶劑組，藥劑組大黃素濃度與侵襲細(xì)胞數(shù)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。見表2、圖 2。

表2 肺癌細(xì)胞侵襲能力比較（n=5）

圖2 transwell實(shí)驗(yàn)肺癌細(xì)胞結(jié)晶紫染色

2.3 各組細(xì)胞凋亡水平比較 藥劑四組肺癌細(xì)胞的凋亡率高于溶劑組，大黃素濃度與凋亡率呈正相關(guān)（P＜0.05）。見表 3、圖 3。

表3 細(xì)胞凋亡水平比較（n=5）

圖3 各組肺癌細(xì)胞細(xì)胞凋亡圖

2.4 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果 藥劑組各組ERK1/2、PKM2蛋白的表達(dá)水平更低，P53蛋白的表達(dá)水平更高；大黃素濃度與ERK1/2、PKM2蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與P53蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.05）。見表4、圖4。

表4 各組蛋白表達(dá)水平比較（n=5）

圖4 各組蛋白表達(dá)水平

3 討論

正常情況下，細(xì)胞的增殖受其自身限制，且侵襲轉(zhuǎn)移能力較差，通過(guò)細(xì)胞凋亡維持正常細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定［6］。而腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞分裂不受約束，侵襲與轉(zhuǎn)移能力急速增強(qiáng)，細(xì)胞異?；钴S，凋亡因子明顯受到抑制，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞難以控制［7］。常見抗腫瘤藥的作用機(jī)制有以下幾種：①干擾核酸進(jìn)行生物合成；②破壞DNA結(jié)構(gòu)和功能；③嵌入DNA中干擾轉(zhuǎn)錄過(guò)程；④干擾影響蛋白質(zhì)合成；⑤調(diào)節(jié)體內(nèi)激素產(chǎn)生抑制作用?？鼓[瘤藥通過(guò)以上機(jī)制抑制腫瘤細(xì)胞的作用無(wú)差別，同時(shí)均能較大程度地?fù)p害正常細(xì)胞。大黃素是一種從自然植物中提取的蒽醌類化合物，通過(guò)嵌入干擾和生物還原等作用機(jī)制，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有較高的特異性，且本身毒性較低，對(duì)正常細(xì)胞影響很低。大黃素吸收進(jìn)入人體后，約一半劑量去向不明，在肌肉組織及脂肪中均未能檢出，可能與它在體內(nèi)的脂溶性相關(guān)，在肝組織中的劑量遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于其他體內(nèi)組織，排泄量為吸入劑量的2.7%，主要由糞便排出。所以，大黃素的濃度與劑量在體內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)化、吸收排泄均有據(jù)可依，通過(guò)調(diào)整大黃素的濃度與劑量，有助于個(gè)體差異性的臨床治療。

ERK1/2位于RAS/RAF/MEK/ERK通路下游，當(dāng)RAS/RAF/MEK/ERK通路發(fā)生異常時(shí)，細(xì)胞的正常功能會(huì)出現(xiàn)障礙，甚至發(fā)生癌變。作為RAS/RAF/MEK/ERK通路下游的“最終管理器”，靶向抑制ERK1/2有望用于治療通路異常激活造成的癌變，對(duì)于產(chǎn)生RAF或MEK抑制劑耐藥的患者也可能有效。ERK1/2信號(hào)途徑可被多種刺激因子激活，與細(xì)胞的周期活動(dòng)密切相關(guān)［8-10］，磷酸化是其發(fā)揮生理功效的關(guān)鍵［11-12］。相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，加入抑制ERK1/2活化后，細(xì)胞中原癌基因的表達(dá)會(huì)相應(yīng)減少，通過(guò)調(diào)控ERK1/2可有效減少細(xì)胞的癌變［13-14］。PKM2和P53是ERK1/2通路的下游調(diào)控因子，PKM2可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的活躍［15］，P53有助于細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞［16-17］。

本研究結(jié)果表明，藥劑組中肺癌細(xì)胞的增殖能力與溶劑組相比均降低，細(xì)胞侵襲能力明顯下降，細(xì)胞凋亡率增加，且效果和大黃素濃度明顯相關(guān)，說(shuō)明大黃素可以有效抑制肺癌細(xì)胞的增殖能力。在分子水平上，藥劑組肺癌細(xì)胞中ERK1/2和PKM2蛋白的表達(dá)低少于溶劑組，且與大黃素濃度相關(guān)，說(shuō)明大黃素可以抑制ERK1/2-PKM2信號(hào)通路，降低ERK1/2的磷酸化，降低PKM2蛋白的表達(dá)，濃度越高則作用效果越明顯，提示大黃素的作用靶點(diǎn)是ERK1/2、PKM2信號(hào)通路。同時(shí)，大黃素會(huì)促進(jìn)肺癌細(xì)胞中P53的高表達(dá)，表達(dá)水平和大黃素濃度呈正相關(guān)，說(shuō)明大黃素可通過(guò)誘導(dǎo)P53高表達(dá)促進(jìn)肺癌細(xì)胞的凋亡。

綜上，大黃素可以有效抑制肺癌細(xì)胞的增值、侵襲，促使肺癌細(xì)胞凋亡。其作用機(jī)制可能是抑制ERK1/2的磷酸化，阻斷ERK1/2-PKM2信號(hào)通路，誘導(dǎo)P53表達(dá)，最終達(dá)到抑制肺癌細(xì)胞的目的。不過(guò)，本研究?jī)H探討了大黃素的體外抗腫瘤作用機(jī)制，作用效果未與同類型藥物進(jìn)行比較，大黃素及其衍生藥物能否成為治療非小細(xì)胞肺癌的特效藥，還需要更多的對(duì)比研究、動(dòng)物及人體試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。