杜仲燕 魯軍 趙正奇 張光霽

胃癌（Gastric cancer，GC）是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤?！?020年全球癌癥統(tǒng)計報告》［1］顯示，全球范圍內(nèi)胃癌的發(fā)病率（5.6%）居第5位，死亡率（7.7%）排第4位。近年來，隨著診斷前移與治療方式的多樣化，早期胃癌患者的生存率有所提高，但晚期胃癌患者的預后仍然較差，中位生存期約為1年［2-4］。目前，中醫(yī)中藥在腫瘤進展、腫瘤耐藥、改善癥狀等方面的獨特優(yōu)勢，得到廣泛關注。深入挖掘中醫(yī)中藥在胃癌治療中的潛在靶點，闡明胃癌治療的分子作用機制，已然成為研究的重點?；诖罅康睦碚摗嶒灪团R床研究，張光霽教授創(chuàng)新性提出“久病必瘀、因瘀致毒、因毒致變、瘀毒互結”是中醫(yī)腫瘤的核心病機之一，化瘀攻毒、瘀毒同治是中醫(yī)腫瘤的主要治法［5］。本研究基于瘀毒互結病機理論，通過網(wǎng)絡藥理學工具探討隱丹參酮聯(lián)合三氧化二砷治療胃癌的潛在靶點和分子作用機制，以期為新藥研發(fā)和腫瘤臨床治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 網(wǎng)絡藥理學相關工具 TCMSP數(shù)據(jù)庫［6］（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）獲取隱丹參酮相關靶點，Drugbank數(shù)據(jù)庫（https：//go.drugbank.com/）獲取三氧化二砷相關靶點，GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org）、DisGeNet數(shù)據(jù)庫（http：//www.disgenet.org）、OMIM 數(shù)據(jù)庫（（http：//www.omim.org）獲取胃癌相關靶點，Draw Venn Diagrams（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）獲取隱丹參酮合用三氧化二砷治療胃癌的作用靶點，STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）進行PPI分析，Cytoscape3.7.0軟件構建藥物和疾病相互作用網(wǎng)絡，R clusterProfiler進行GO和KEGG富集分析，Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）進行靶點校準。以上工具的使用時間截止至2021年5月。隱丹參酮聯(lián)用三氧化二砷治療胃癌的研究路線圖，見圖1。

圖1 隱丹參酮聯(lián)用三氧化二砷治療胃癌的研究路線圖

1.2 研究方法 （1）隱丹參酮與三氧化二砷靶點的獲?。阂訡ryptotanshinone為檢索詞，通過TCMSP工具，檢索隱丹參酮的相關靶點，并通過Uniprot工具進行校準；以Arsenic Trioxide為檢索詞，通過Drugbank工具，檢索到三氧化二砷的相關靶點，并匯總靶點的Gene Name和Uniprot ID。（2）胃癌靶點的獲?。阂浴癎astric Cancer”為檢索詞，通過GeneCards、DisGeNet和OMIM工具，檢索胃癌的相關靶點，通過Draw Venn Diagrams工具去重后得到胃癌相關靶點的合集。（3）藥物-疾病網(wǎng)絡的構建及分析：通過Draw Venn Diagrams工具，獲取隱丹參酮聯(lián)用三氧化二砷治療胃癌的作用靶點，并通過Cytoscape工具，構建藥物-靶點-疾病網(wǎng)絡。（4）蛋白互作網(wǎng)絡（PPI）的構建：通過STRING工具，把隱丹參酮聯(lián)用三氧化二砷治療胃癌的相關作用靶點上傳至工具，獲取PPI網(wǎng)絡。（5）GO與KEGG富集分析：通過R clusterProfiler，分析隱丹參酮聯(lián)用三氧化二砷治療胃癌的相關作用靶點的GO功能注釋與KEGG信號通路富集。

2 結果

2.1 隱丹參酮與三氧化二砷的靶點 獲取隱丹參酮的相關靶點共30個，獲取三氧化二砷靶點10個，去重后共有39個潛在作用靶點。

2.2 胃癌靶點 通過GeneCards、DisGeNet和OMIM工具檢索，分別獲取胃癌靶點12153個、34個、505個，去重后共為12511個，見圖2A。隱丹參酮聯(lián)用三氧化二砷治療胃癌映射得到38個共同靶點，見圖2B。

圖2 胃癌靶點與隱丹參酮聯(lián)用三氧化二砷治療胃癌的對應靶點

2.3 網(wǎng)絡構建及分析 通過Cytoscape工具構建隱丹參酮聯(lián)用三氧化二砷治療胃癌的相互作用關系的可視化網(wǎng)絡，發(fā)現(xiàn)不同的藥物可作用于相同的靶點，也可作用于不同的靶點，充分體現(xiàn)了隱丹參酮聯(lián)用三氧化二砷多靶點的作用機制。見圖3。

圖3 隱丹參酮聯(lián)用三氧化二砷治療胃癌的藥物-靶點-疾病網(wǎng)絡關系圖

2.4 PPI網(wǎng)絡的構建 為了更好地理解隱丹參酮聯(lián)用三氧化二砷治療胃癌的作用機制，基于PPI關系并使用STRING工具構建隱丹參酮聯(lián)用三氧化二砷治療胃癌相關靶點的PPI網(wǎng)絡，見圖4。PPI網(wǎng)絡包含38個蛋白質(zhì)節(jié)點，196條相互作用關系（連線），其中SCN5A與其他蛋白質(zhì)節(jié)點無相互作用關系。通過R語言計算靶點的degree，并繪制barplot圖，顯示MAPK3、AKT1、APP、JUN、STAT3、EDN1、TNF、CCND1、MAPK1、RELA為排名前十的核心靶點，見圖5。

圖4 隱丹參酮聯(lián)用三氧化二砷治療胃癌相關靶點的PPI網(wǎng)絡

圖5 隱丹參酮聯(lián)用三氧化二砷治療胃癌排名前十的核心靶點

2.5 藥物-疾病靶點GO分析 根據(jù)隱丹參酮聯(lián)用三氧化二砷治療胃癌相關的靶點進行GO分析，得到靶點具有的功能信息62條（P＜0.05），按P值選取前20條，見圖6。結果發(fā)現(xiàn)，其功能涉及泛素蛋白連接酶結合、泛素樣蛋白連接酶結合、抑制轉(zhuǎn)錄因子結合、G蛋白偶聯(lián)的胺受體活性、突觸后神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、乙酰膽堿受體活性、血清素受體活性、RNA聚合酶II特異的DNA結合轉(zhuǎn)錄因子結合等。

圖6 隱丹參酮聯(lián)用三氧化二砷治療胃癌靶點的GO分析

2.6 藥物-疾病靶點KEGG分析 以P＜0.05進行篩選，得到139條信號通路，按P值選取前20條，并按通路富集靶點個數(shù)排序。其中，前20條KEGG通路為TNF信號通路、細胞凋亡、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、cAMP信號通路、鈣信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGERAGE信號通路、膽堿能突觸、癌癥中PD-L1表達和PD-1檢查點途徑等，表明隱丹參酮聯(lián)用三氧化二砷的有效成分可能通過作用以上通路來治療胃癌。其中，核心靶點RelA在TNF信號通路、細胞凋亡、cAMP信號通路等16條信號通路中均有涉及。見圖7和表1。

表1 隱丹參酮聯(lián)用三氧化二砷治療胃癌潛在靶點的KEGG通路分析

圖7 隱丹參酮聯(lián)用三氧化二砷治療胃癌靶點的KEGG分析

3 討論

胃癌在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率與死亡率居高不下，晚期胃癌患者的預后較差、生存期較短，嚴重威脅人類的生命健康［7］。近年來，中醫(yī)中藥治療胃癌的優(yōu)勢逐漸凸顯，是腫瘤精準化醫(yī)療發(fā)展、多靶點藥物發(fā)現(xiàn)的源泉，而且蘊藏著巨大的新藥創(chuàng)制資源［8］。中醫(yī)學雖無“胃癌”之病名，但可歸于“胃脘痛”“癥瘕”“積聚”“痞證”“脾積”等范疇?！吨T病源候論》［9］曰：“血瘀于內(nèi)，時時體熱面黃，瘀久不消，則變成積聚癥瘕也”，《仁齋直指方論》［10］曰：“癌者上高下深，巖穴之狀……毒根深藏，穿孔透里”。瘀為毒之基，毒為瘀之甚，瘀可蘊毒、毒復致瘀，最終導致瘀毒互結。張光霽教授認為胃癌病因病機復雜，往往交雜互結為患，核心病機為瘀毒互結，治宜化瘀攻毒、瘀毒同治。

丹參始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有活血化瘀、通經(jīng)止痛等功效，多用于治療癥瘕積聚、脘腹脅痛等疾?。?1］。隱丹參酮由丹參的干燥根和根莖中提取而來，是丹參有效成分之一，是一種具有多種藥理作用的天然喹諾酮二萜［12］。砒霜是以毒攻毒治癌中藥的代表藥，三氧化二砷是其主要活性成分。研究證實，隱丹參酮和三氧化二砷可用于胃癌等多種惡性腫瘤的治療［13-15］，但具體作用機制不明。本研究旨在探討隱丹參酮聯(lián)用三氧化二砷治療胃癌的具體分子作用機制，基于網(wǎng)絡藥理學理論采用TCMSP、Drugbank、GeneCards等工具篩選出隱丹參酮聯(lián)用三氧化二砷治療胃癌的潛在靶點共38個，分別為 MAPK3、AKT1、APP、JUN、STAT3、EDN1、TNF、CCND1、MAPK1、RELA等，涉及G蛋白偶聯(lián)的胺受體活性、乙酰膽堿受體活性、G蛋白偶聯(lián)的血清素受體活性、血清素受體活性、泛素蛋白連接酶結合、肽結合、泛素樣蛋白連接酶結合、抑制轉(zhuǎn)錄因子結合等GO富集分析，涉及cAMP信號通路、TNF信號通路、細胞凋亡、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、鈣信號通路、癌癥中PD-L1表達和PD-1檢查點途徑等炎癥、代謝、免疫方面。

通過STRING和R語言工具篩選得到蛋白互作網(wǎng)絡排名前十的核心靶點，RelA為其中之一。RelA雖為隱丹參酮的預測靶點，但通過隱丹參酮與三氧化二砷的聯(lián)用，與16個靶點相互作用，并在排名前20的GO分析中參與了泛素蛋白連接酶結合、泛素樣蛋白連接酶結合等6個GO過程，在排名前20的KEGG通路中參與了TNF信號通路、細胞凋亡等16條信號通路。RelA為核轉(zhuǎn)錄因子 -κB/p65（Nuclear Factor-kappa B/p65，NF-κB/p65），是最重要的功能亞基［16］，在人體胃癌組織中RelA核易位顯著增高，NF-κB被激活。NF-κB是免疫應答與炎癥反應中的一種重要調(diào)控蛋白，NF-κB的不適當激活與胃癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移和化療敏感性密切相關［17］。泛素化作用可影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和功能，從而調(diào)節(jié)廣泛的細胞過程，泛素化機制的失調(diào)會導致胃癌等多種惡性腫瘤，RelA多個賴氨酸殘基存在泛素化修飾，在腫瘤壞死因子受體相關因子7作用下促進泛素化，并進行溶酶體內(nèi)降解，從而抑制NF-κB活性［18］，而隱丹參酮和三氧化二砷均可抑制NF-κB活化［19-20］。由此推測，隱丹參酮聯(lián)用三氧化二砷治療胃癌可能是通過靶向RelA，并促其泛素化，從而抑制NF-κB活化來實現(xiàn)的。

NF-κB抑制劑在臨床上被廣泛應用于胃癌的治療，但由于NF-κB信號通路在機體內(nèi)的交互性和復雜性，廣泛抑制其活性會帶來較多的不良反應，導致NF-κB抑制劑的臨床療效并不理想，這也促使著科研工作者去尋找更精準的NF-κB抑制劑。隱丹參酮聯(lián)用三氧化二砷有可能成為精準治療胃癌的新型藥物，考慮到網(wǎng)路藥理學工具的預測特殊性，本研究將在后續(xù)實驗驗證中夯實預測，為中醫(yī)病機理論的臨床應用實踐提供科學的依據(jù)與參考。