范曉麗 王義娜 張青青

宮頸癌是1種與高危型人乳頭瘤病毒感染密切相關(guān)的婦科腫瘤[1]。微小RNAs(miRNAs)是1類內(nèi)源性非編碼RNA，其通過調(diào)控下游腫瘤相關(guān)mRNA影響腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡等生物學過程，與宮頸癌的惡性演變關(guān)系密切[2]。已有研究[3]發(fā)現(xiàn)miR-1275在宮頸癌組織和血清中異常高表達，但其在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用并不清楚。因此，本研究以宮頸癌Hela細胞為研究對象，探討上調(diào)或下調(diào)miR-1275表達對Hela細胞惡性生物學行為的影響，分析其潛在靶基因，進而揭示其在宮頸癌發(fā)生、進展中的作用，以期為宮頸癌靶基因治療提供新線索。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人宮頸癌細胞株Hela購于美國ATCC。RPMI1640培養(yǎng)基購于美國Sigma-Aldrich公司，胎牛血清和胰蛋白酶購于美國Gibco公司，miR-1275mimics、miR-1275 inhibitor及其相應(yīng)的陰性對照miR-NC、anti-miR-NC購于美國Sigma公司，Matrigel基質(zhì)膠和Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購于美國BD公司，辣根過氧化酶標記的二抗購于中杉金橋公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、FHIT抗體、GAPDH抗體和購于美國Abcam公司。CCK-8試劑盒購于杭州聯(lián)科生物公司，SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒購于北京雷根生物公司，BCA 蛋白定量試劑盒購于北京博奧森生物公司，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購于碧云天生物技術(shù)研究所，ECL發(fā)光液和Transwell小室購于美國Millipore公司。

1.2 細胞培養(yǎng)、分組與轉(zhuǎn)染

Hela細胞接種至含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶，在濕度飽和、5%CO2、溫度37 ℃細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。每2 d換液1次，胰蛋白酶消化85%融合細胞，按照1∶3比例傳代。選擇第5代對數(shù)期細胞進行后續(xù)實驗。實驗分為4組，分別為miR-NC組(轉(zhuǎn)染mimics陰性對照miR-NC)、miR-1275組(轉(zhuǎn)染miR-1275 mimics)、anti-miR-NC組(轉(zhuǎn)染inhibitor陰性對照anti-miR-NC)和anti-miR-1275組(轉(zhuǎn)染miR-1275 inhibitor)。將對數(shù)期Hela細胞以適當密度接種至6孔板上，參照脂質(zhì)體2000說明書步驟將miR-1275 mimics、miR-1275 inhibitor及其相應(yīng)陰性對照根據(jù)實驗分組轉(zhuǎn)染至75%融合的Hela細胞中。轉(zhuǎn)染6 h后，換液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集各組細胞，進行后續(xù)實驗。

1.3 RT-PCR檢測miR-1275的表達

采用Trizol法提轉(zhuǎn)染Hela細胞的RNA，紫外分光光度計法評估各組細胞總RNA的濃度。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA，取1 μl cDNA作為模板，另加入10 μl qPCR masterMix、各0.5 μl濃度為10 μM上下引物和8 μlddH2O制成體積為20 μll PCR反應(yīng)體系，上PCR儀進行擴增。采用2-ΔΔCt法檢測miR-1275表達水平以評估轉(zhuǎn)染效果。實驗重復3次。其中，PCR引物由上海生工生物合成(miR-1275 F:5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’，R:5’-GCCGCTAGCTTATCGACTACG-3’,內(nèi)參U6 F:5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，R:5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’)。

1.4 細胞增殖實驗

在96孔細胞板上接種轉(zhuǎn)染48 h后各組Hela細胞。在培養(yǎng)箱培養(yǎng)24、48和72 h后，棄培養(yǎng)液，加入10 μl CCK-8溶液。孵育4 h后，使用酶標儀在450 nm處檢測各組細胞的光密度(OD)值。實驗重復3次。

1.5 細胞侵襲與遷移實驗

侵襲實驗：使用50 μl 濃度為10 mg/ml的Matrigel基質(zhì)膠包被24孔板內(nèi)的Transwell小室的上層，置于室溫條件下充分融合凝固。用無血清培養(yǎng)基重懸各組Hela細胞制成2×105個/ml懸液。取100 μl細胞懸液加入到Transwell小室上層，并在小室下層中加入500 μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h后，取出小室，以棉簽擦去上層中的細胞，用甲醇固定底部細胞15 min，用0.1%結(jié)晶紫染液染色20 min。洗去染色液，室溫晾干。在倒置顯微鏡下各組隨機選取3個視野，統(tǒng)計穿膜細胞數(shù)。遷移實驗：遷移實驗步驟與侵襲實驗基本一致，不同之處在于無需使用Matrigel基質(zhì)膠包被的Transwell小室。實驗重復3次。

1.6 細胞凋亡實驗

磷酸緩沖液沖洗胰酶消化收集的各組Hela細胞，用500 μl的結(jié)合緩沖液重懸上述細胞。加入5 μl的Annexin V-FITC、5 μl的PI混勻，室溫下避光反應(yīng)15 min。在1 h內(nèi)使用流式細胞儀分析各組細胞凋亡率。實驗重復3次。

1.7 miR-1275與FHIT的靶向關(guān)系的驗證實驗

由百奧邁科生物公司構(gòu)建含野生FHIT 3’ UTR(FHIT-WT)和突變FHIT 3’ UTR結(jié)構(gòu)(FHIT-MUT)的熒光數(shù)酶報告載體。待Hela細胞達70%融合度時，參照脂質(zhì)體2000說明書步驟將miR-NC、miR-1275、anti-miR-NC和miR-1275 inhibitor分別與FHIT-WT、FHIT-MUT共轉(zhuǎn)染至Hela細胞，利用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒評估轉(zhuǎn)染48 h后各組細胞熒光素酶活性。實驗重復3次。

1.8 FHIT蛋白表達的檢測

用RIPA細胞裂解液提取各組Hela細胞的總蛋白。取適量2×上樣緩沖液與等體積蛋白樣品混勻，在95 ℃的水浴鍋中變性5 min。每孔60 μg蛋白樣品上樣至12% SDS-PAGE凝膠以80 V恒壓電泳，當溴酚藍進入分離膠后改用120 V電壓電泳至溴酚藍跑出膠外。以200 mA恒流將蛋白樣品轉(zhuǎn)至PVDF膜上。采用含5%脫脂奶粉的封閉液室溫封膜1.5 h后，以1∶1000倍稀釋的FHIT和GAPDH一抗工作液4 ℃下孵育24 h。按照1∶2000比例稀釋二抗，孵育膜1 h。滴加ECL發(fā)光液顯影后，采用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析目的條帶灰度值(GAPDH為內(nèi)參)。實驗重復3次。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 miR-1275在各組Hela細胞中表達情況

RT-PCR檢測結(jié)果顯示，miR-1275組細胞中miR-1275表達較miR-NC組明顯升高(P<0.05)；anti-miR-1275組中miR-1275表達較anti-miR-NC組明顯降低(P<0.05)，見表1。

表1 各組Hela細胞中miR-1275表達水平

2.2 miR-1275對宮頸癌Hela細胞增殖的影響

CCK-8檢測結(jié)果顯示， 在48 h和72 h作用時間下，miR-1275組細胞的增殖活力較miR-NC組顯著升高(P<0.05)；而anti-miR-1275組細胞的增殖活性與anti-miR-NC組比較明顯降低(P<0.05)，見表2。

表2 各組細胞OD450 nm值的比較

2.3 miR-1275對宮頸癌Hela細胞侵襲和遷移的影響

Transwell實驗檢測結(jié)果顯示，miR-1275組細胞侵襲、遷移數(shù)量與miR-NC組相比明顯增多(P<0.05)；而anti-miR-1275組細胞侵襲、遷移數(shù)量與anti-miR-NC組比較明顯減少(P<0.05)，見表3。

表3 各組中侵襲細胞數(shù)和遷移細胞數(shù)的比較

2.4 miR-1275對宮頸癌Hela細胞凋亡的影響

流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，miR-1275組細胞凋亡率較miR-NC組明顯降低(P<0.05)；anti-miR-1275組細胞的凋亡率較anti-miR-NC組明顯升高(P<0.05)，見表4。

表4 各組細胞凋亡率比較

2.5 miR-1275靶基因的預測及驗證

TargetScan、miRanda及miRBase數(shù)據(jù)庫軟件預測顯示，F(xiàn)HIT 3' UTR與miR-1275存在特異結(jié)合位點。熒光素酶活性檢測顯示，與轉(zhuǎn)染miR-NC相比，轉(zhuǎn)染miR-1275 mimics可明顯降低Hela細胞FHIT-WT的熒光素酶活性；與轉(zhuǎn)染anti-miR-NC相比，轉(zhuǎn)染anit-miR-1275可明顯升高其熒光素酶活性(P<0.05)；但miR-1275和anit-miR-1275對Hela細胞FHIT-MUT的熒光素酶活性影響無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。Western blot檢測FHIT蛋白表達(圖1和表5)顯示，與miR-NC組相比，miR-1275明顯抑制Hela細胞中FHIT蛋白的表達；而anit-miR-1275則明顯促進FHIT蛋白的表達(P<0.05)。

圖1 Western blot檢測FHIT蛋白的表達

表5 各組細胞的熒光素酶活性

3 討論

miR-1275是1種與腫瘤發(fā)生和進展關(guān)系密切的miRNA。Fawzy 等[4]在肝癌中發(fā)現(xiàn)miR-1275異常低表達，而異位表達miR-1275可抑制腫瘤細胞的惡性生物行為。然而，miR-1275在不同腫瘤組織或細胞中的表達及其作用存在著差異。He等[5]發(fā)現(xiàn)，在非小細胞肺癌組織和細胞中miR-1275表達上調(diào)，而抑制miR-1275表達可抑制癌細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。Yang等[6]發(fā)現(xiàn)，miR-1275在慢性粒細胞白血病中表達升高，抑制其表達抑制細胞增殖，下調(diào)凋亡抑制蛋白Bcl-2和轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP-2/9的表達，并上調(diào)促凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3表達。Xie等[7]在膀胱癌中發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-1275表達可通過靶向調(diào)控AXIN2恢復lncRNA miR143HG對BCa細胞的增殖，遷移和侵襲能力的抑制作用。為了探討miR-1275在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用，本研究通過轉(zhuǎn)染miR-1275 mimics和miR-1275 inhibitor 分別成功上調(diào)和下調(diào)miR-1275表達后，檢測發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-1275表達可顯著增加宮頸癌Hela細胞的增殖、侵襲和遷移能力，降低細胞凋亡能力；而下調(diào)miR-1275表達則得到相反的結(jié)果。這提示miR-1275通過抑制宮頸癌細胞凋亡，促進細胞增殖、侵襲和遷移在宮頸癌的惡性進展中發(fā)揮著重要的致癌作用。

FHIT是1種重要的抑癌基因，可通過調(diào)控細胞增殖、侵襲、凋亡和自噬等過程與骨肉瘤、非小細胞肺癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[8-9]。Roz等[10]研究指出，恢復FHIT表達可誘導宮頸癌細胞凋亡并抑制腫瘤的生長。林翠波等[11]證實，F(xiàn)HIT在宮頸癌組織中低表達，且其表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。閆艷榮等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌演變過程中FHIT的表達與轉(zhuǎn)移相關(guān)的MMP-9表達呈現(xiàn)負相關(guān)。本研究通過軟件預測發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HIT 3’UTR存在能夠與miR-1275互補的結(jié)合位點。采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實，miR-1275可與FHIT 3’UTR靶向結(jié)合。另外，Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-1275表達可抑制FHIT蛋白表達；反之，下調(diào)miR-1275表達則可促進FHIT蛋白表達。結(jié)果提示，F(xiàn)HIT是miR-1275的靶基因，miR-1275可通過靶向調(diào)控其表達參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，miR-1275可促進宮頸癌細胞增殖、侵襲、遷移，抑制凋亡，進而在宮頸癌的進展中發(fā)揮致癌作用，其機制可能與靶向調(diào)控FHIT有關(guān)，這為miR-1275作為宮頸癌基因治療的潛在靶點提供了理論依據(jù)。