陳偉忠

廣東省潮州市人民醫(yī)院檢驗科，廣東潮州 521000

瘧疾是由瘧原蟲造成的一種全球性急性寄生蟲傳染病[1-2]。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，2018年全球發(fā)生了2.28億例瘧疾病例，其中以非洲的撒哈拉以南地區(qū)感染瘧疾的疫情最重[3]。青蒿素是我國科學(xué)家從青蒿中發(fā)現(xiàn)的新型抗瘧藥物。以青蒿素為基礎(chǔ)的聯(lián)合療法(ACT)被廣泛用于瘧疾臨床治療，成為治療瘧疾的一線藥物[4-5]。近年來，惡性瘧原蟲開始出現(xiàn)了青蒿素抵抗的現(xiàn)象。目前的研究表明，惡性瘧原蟲第13號染色體上編碼的kelch蛋白的基因，即K13基因，其螺旋槳域N458Y、Y493H、R539T、I543T、R561H和C580Y氨基酸替換能夠影響原蟲體外存活率和體內(nèi)清除率，該基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)可以作為監(jiān)控ACT藥物抗性的分子標(biāo)記[6]。特別是在東南亞地區(qū)C580Y被認(rèn)為是一種主要和富有潛力的衡量青蒿素抵抗的分子標(biāo)志。通過對這些惡性瘧原蟲青蒿素耐藥相關(guān)基因突變的檢測，可以評價和預(yù)測耐藥性情況[7]。

本實驗運用的非標(biāo)記探針法高分辨熔解曲線(HRM)分析技術(shù)，不僅可以確定特定等位基因的存在或缺失，還可以檢查探針下的整個區(qū)域單個堿基差異[8]。該分析方法的主要優(yōu)點是靈敏度和特異度極高；所有實驗反應(yīng)試劑均在實驗前加入管中，以避免開蓋造成的實驗污染；其檢測通量大而成本低，適合臨床大批量標(biāo)本的篩查[9]。

1 材料與方法

1.1一般資料 通過設(shè)計的目的基因突變位點的探針和引物，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，使用HRM非標(biāo)記探針基因分型技術(shù)檢測惡性瘧原蟲青蒿素耐藥性相關(guān)K13基因C580Y突變位點。

1.2儀器與試劑 Thermo Cell恒溫金屬浴、薄壁管低俗離心機、BIOER基因擴增儀、LightScanner高分辨溶解曲線分析儀；干血斑基因組DNA提取試劑盒(DP334)、2×Taq plus PCR MasterMix、飽和熒光染料LC Green、96孔全裙邊板HSP9665、0.2 mL薄壁管PCR-02-C。

1.3方法

1.3.1設(shè)計探針與引物 引物和探針設(shè)計后由上海美吉醫(yī)學(xué)檢驗有限公司合成，產(chǎn)品真空冷凍干燥保存。探針序列：TCATCATCTATGTGTGTTGCTTT-block；上游引物序列：GCTCTTCTATTATACCGAA；下游引物序列：TTCTAATAAGGCATATGGAA。產(chǎn)物長度為218 bp。

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒構(gòu)建 采用人工合成的辦法由華大公司合成含有青蒿素耐藥相關(guān)突變C580Y和野生型的pUC57-amp質(zhì)粒。

1.3.3PCR反應(yīng)體系 本實驗采用不對稱PCR擴增法，上、下游引物比為5∶1。反應(yīng)體系為20 μL，試劑配制及用量如下：2.0 μL(約20 ng)基因組DNA或103 copy/mL質(zhì)粒(對照)、0.2 μL 10.0 μmol/L上游引物、1.0 μL 10.0 μmol/L的下游引物、10.0 μL 2×Master Mix(艾德萊公司)、0.5 μL 10.0 μmol/L非標(biāo)記探針(3′端采用C3 spacer或磷酸化封閉)、2.0 μL飽和熒光染料LC Green,最后加無菌蒸餾水至20.0 μL。進行反應(yīng)前加入礦物油10 μL，以防止揮發(fā)污染。突變型和野生型標(biāo)本分別進行5個重復(fù)實驗。

1.3.4PCR擴增與HRM檢測 將反應(yīng)體系加入96孔全裙邊板，放至BIOER基因擴增儀，PCR 程序為94 ℃預(yù)變性3 min，然后94 ℃ 30 s、60 ℃ 15 s、72 ℃ 20 s，進行55 個循環(huán)，95 ℃ 1 min，使異源雙鏈核酸分子形成。15 ℃保持直到實驗結(jié)束。

擴增完畢后，將96孔全裙邊板放至微孔板專用離心機進行離心，將產(chǎn)物聚集于反應(yīng)孔底部。產(chǎn)物通過Lightsanner96儀器檢測分析，設(shè)置起始溫度為45 ℃，結(jié)束溫度為95 ℃，儀器采集熒光信號并繪制溶解曲線圖進行分析。

1.3.5靈敏度檢驗 為了驗證本實驗靈敏度，同時評估該方法在野生型和突變型混合感染中突變檢測能力，筆者對突變型和野生型質(zhì)粒(10～105ng/μL)按不同比例混合稀釋。突變型質(zhì)粒和野生型質(zhì)粒原倍濃度均為1 105 copy/L，按照突變型/野生型質(zhì)粒比例為10∶90、30∶70、50∶50、70∶30和90∶10進行混合，然后分別對混合標(biāo)本進行檢測。每個混合比例進行5個重復(fù)實驗。

2 結(jié) 果

2.1HRM檢測結(jié)果 通過Lightsanner96儀器對產(chǎn)物進行分析形成熔解曲線圖。在60～85 ℃形成兩個熔解曲線峰，即在低溫區(qū)(61～69 ℃)的探針峰和高溫區(qū)(75～84 ℃)的產(chǎn)物峰。在探針峰上，突變型和野生型之間的溫度差達到5 ℃，能夠很好地鑒別區(qū)分，見圖1。

注：A為熔解曲線圖；B為差異曲線圖；C為標(biāo)化熔解峰圖。

2.2靈敏度檢驗結(jié)果 將突變型和野生型質(zhì)粒按照比例為10∶90、30∶70、50∶50、70∶30和90∶10進行混合后再檢驗得到的熔解曲線，見圖2。各個混合比例曲線按比例遞進順序依次排列，均能很好地區(qū)分，形成單一的擴增峰，無非特異性產(chǎn)物干擾峰形成。結(jié)果顯示，本實驗具有良好的重復(fù)性、擴增效率及良好的線性關(guān)系，可做基因分型的半定量檢測。

注：A為熔解曲線圖；B為差異曲線圖；C為標(biāo)化熔解峰圖。

3 討 論

瘧疾具有非常強的傳播性，其對人類的危害不單單是局限在某一個地區(qū)或國家，而是關(guān)系到全人類的公共衛(wèi)生問題[10]。瘧原蟲耐藥性的產(chǎn)生和流行，更是對全球公共衛(wèi)生工作提出了巨大的挑戰(zhàn)[11]。目前，世界衛(wèi)生組織確認(rèn)性瘧原蟲K13基因突變與青蒿素耐藥性相關(guān)，可以作為惡性瘧原蟲青蒿素耐藥性的分子標(biāo)志物。根據(jù)2019年世界衛(wèi)生組織關(guān)于瘧疾的ACT藥物抵抗報告，PFK13基因的F446I、N458Y、Y493H、R539T、I543T、R561H、C580Y這7個突變已經(jīng)被證實與青蒿素和其衍生物的抵抗有關(guān)，推薦其作為監(jiān)控ACT藥物抗性的分子標(biāo)記。

目前，對惡性瘧原蟲青蒿素耐藥相關(guān)基因SNP的檢測方法比較多，常見的有Sanger測序法[12]、PCR-限制性片段長度多態(tài)性分析技術(shù)(RFLP)[13]、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(LAMP)聯(lián)合納米孔測序技術(shù)[14]及突變擴增系統(tǒng)(ARMS)結(jié)合實時熒光定量PCR等[15]。然而這些方法由于需要昂貴的儀器、嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)的實驗環(huán)境、昂貴的費用，以及實驗方法操作繁瑣，耗時長等原因，限制了它們用于高瘧區(qū)大量臨床標(biāo)本的快速診斷。

HRM分析技術(shù)是一種快速而有效的基因突變檢測技術(shù)，升溫過程中雙鏈DNA開始變性解離，嵌合在其中的飽和熒光染料逐漸釋放，熒光強度隨著變?nèi)酢Ｏ到y(tǒng)通過熒光強度變化與時間的關(guān)系繪制出熔解曲線。不同位點基因型會產(chǎn)生不同的熔解曲線峰形，因此HRM能夠有效區(qū)分。目前，臨床已經(jīng)開發(fā)了幾種復(fù)雜的PCR-HRM方法用于從臨床標(biāo)本中檢測瘧原蟲，但鮮見用于檢測惡性瘧原蟲青蒿素耐藥性相關(guān)基因突變。

本研究基于HRM非標(biāo)記探針基因分型技術(shù)，建立了針對世界衛(wèi)生組織推薦的已經(jīng)驗證的青蒿素耐藥相關(guān)的突變C580Y的檢測方法。相對于其他分子診斷方法，此方法檢測靈敏度高，操作簡便快速，成本低，反應(yīng)通量大，結(jié)果準(zhǔn)確，可以滿足臨床標(biāo)本的檢測，并且實現(xiàn)了真正的閉管操作，減少實驗室污染的機會，是理想的檢測方法，可用于疫情地區(qū)大批量人群篩查。同時，該實驗方法可作為突變的半定量檢查，用于耐藥性瘧原蟲水平的粗略估算，可更好地指導(dǎo)臨床用藥。研究中筆者發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用梯度PCR對實驗體系和反應(yīng)條件進行優(yōu)化，本實驗上、下游引物之間5∶1的比例是最適合的；探針可被設(shè)計成與野生型或突變型互補，探針的設(shè)計應(yīng)該將突變位點盡量置于中間，在應(yīng)用非標(biāo)記探針時，退火溫度確定在60 ℃左右最合適，否則會產(chǎn)生非特異熔解峰而影響判讀結(jié)果。本研究將對實驗繼續(xù)優(yōu)化和改良，提高實驗靈敏度和特異性，將該方法應(yīng)用到其他耐藥相關(guān)基因檢測中。