田祖國，高 陸，翁春嵐，劉水玉

遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，貴州遵義 563003

彌漫大B細胞淋巴瘤(DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤最常見的類型，占所有非霍奇金淋巴瘤的35%～40%，由于DLBCL在臨床、分子遺傳學(xué)及免疫表型等方面具有高度異質(zhì)性，現(xiàn)階段臨床上主要行化療，雖然化療的有效性較高，但化療的敏感性會影響總體效果，遠期預(yù)后不佳[1-2]。尋找與DLBCL發(fā)生、發(fā)展有關(guān)的生物標(biāo)志物對DLBCL的早期診斷及治療具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，類泛素蛋白與惡性腫瘤，包括血液系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3]。UFC1是一個新鑒定的類似泛素結(jié)合酶E2，屬于類泛素Ufm1修飾系統(tǒng)(Ufm1)[4-5]。而UFC1在DLBCL中的表達情況鮮見相關(guān)研究報道。本研究擬研究UFC1在DLBCL中的表達情況，探討其在DLBCL診療中可能的價值?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2012年1月至2015年1月于遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院40例DLBCL患者石蠟標(biāo)本作為DLBCL組，以20例反應(yīng)性淋巴結(jié)炎患者石蠟標(biāo)本作為對照組。收集40例DLBCL患者的臨床特征資料，包括患者年齡、性別、國際預(yù)后指數(shù)(IPI)評分、Ann Arbor分期、美國東部腫瘤協(xié)作組(ECOG)評分、結(jié)外受累數(shù)目、B癥狀、血清乳酸脫氫酶(LDH)、BCL-2蛋白、Ki-67水平等。

1.2方法 采用En Vision法進行免疫組化染色[試劑：Anti-UFC1抗體(Abcam公司，貨號ab189252)；免疫顯色試劑盒EnVisionTMFLEX+、Mouse、HighpH(DAKO K800211)等]。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)采用免疫風(fēng)險得分(IRS)評分方法，對陽性細胞的數(shù)量及染色強度進行綜合評分，以兩者相加后的總分進行結(jié)果判定，>4分為陽性，≤4分為陰性。結(jié)果由2名病理科醫(yī)師雙盲法讀片判斷。

1.3在線數(shù)據(jù)庫分析UFC1在腫瘤中的表達 GEPIA數(shù)據(jù)庫[6](http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)是由北京大學(xué)基于TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫建立的在線分析數(shù)據(jù)庫，包含9 736份腫瘤組織標(biāo)本和8 587份正常組織標(biāo)本。Oncomine數(shù)據(jù)庫[7](https://www.oncomine.org/resource/main.html)已經(jīng)收集了715個數(shù)據(jù)集的86 733份標(biāo)本的基因表達數(shù)據(jù)，整合了GEO、TCGA和已發(fā)表的文獻等來源的RNA和DNA-seq數(shù)據(jù)。兩個數(shù)據(jù)庫均可用于分析基因表達差異、預(yù)測共表達基因等，本研究利用GEPIA及Oncomine數(shù)據(jù)庫分析UFC1在多種類型腫瘤及DLBCL中的表達。

1.4GEO數(shù)據(jù)庫 GEO數(shù)據(jù)庫[8](http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)是一個國際公共數(shù)據(jù)庫，用于存儲高通量和二代測序基因組數(shù)據(jù)集，可提供一些基于網(wǎng)絡(luò)的工具和策略來幫助用戶查詢、分析和可視化數(shù)據(jù)。GSE10846[7]數(shù)據(jù)集中收錄了181例采用CHOP方案化療的DLBCL患者基因表達譜及DLBCL患者隨訪、生存時間等臨床信息。本研究根據(jù)這181例患者的UFC1表達均值將其分為高表達組和低表達組，分析UFC1基因表達與DLBCL患者生存的關(guān)系。

1.5Pathway Commons數(shù)據(jù)庫 Pathway Commons數(shù)據(jù)庫[9](http://www.pathwaycommons.org)是公開應(yīng)用的通路數(shù)據(jù)庫，能夠瀏覽并搜索來自多個來源的基因通路信息。當(dāng)前包含了來自9個數(shù)據(jù)庫(超過1 400個通路和687 000個相互作用的數(shù)據(jù))，本研究利用Pathway Commons數(shù)據(jù)庫研究與UFC1具有相互作用的相關(guān)基因。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析，組間比較采用χ2檢驗；GEO數(shù)據(jù)生存數(shù)據(jù)應(yīng)用Gramphpadprism 8.1進行生存分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1腫瘤數(shù)據(jù)庫中UFC1的表達 GEPIA數(shù)據(jù)庫分析顯示，UFC1在DLBCL、肝細胞癌(LIHC)、胸腺瘤(THYM)及膽管癌(CHOL)中均呈高表達(P<0.01)，而在腎嫌色細胞癌(KICH)中呈低表達；Oncomine數(shù)據(jù)庫顯示，UFC1在DLBCL、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、黑色素瘤及白血病中存在明顯高表達；而Oncomine數(shù)據(jù)庫進一步分析顯示，UFC1在DLBCL中表達明顯升高，其中以活化B細胞型DLBCL中UFC1高表達更明顯。

2.2UFC1的染色表現(xiàn) 在反應(yīng)性淋巴結(jié)炎組織中UFC1染色強度鏡下表現(xiàn)見圖1。

2.3UFC1的組織表達 40例DLBCL組織中有37例UFC1表達陽性，20例反應(yīng)性淋巴結(jié)炎組織中有5例UFC1蛋白表達陽性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

注：A為UFC1 1分；B為UFC1 2分；C為UFC1 3分。

2.4UFC1表達與DLBCL患者臨床特征的關(guān)系 對納入的DLBCL患者的UFC1表達與其臨床特征進行分析，發(fā)現(xiàn)進展期(Ⅲ、Ⅳ期)DLBCL患者UFC1蛋白表達陽性率明顯高于局限期(Ⅰ、Ⅱ期)患者(P=0.047)；而UFC1表達陽性率在不同年齡、性別、IPI評分、ECOG評分、結(jié)外受累數(shù)目、B癥狀、LDH、BCL-2蛋白、Ki-67水平患者間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 UFC1表達與DLBCL患者臨床特征的關(guān)系[n(%)]

續(xù)表1 UFC1表達與DLBCL患者臨床特征的關(guān)系[n(%)]

2.5UFC1表達與DLBCL生存預(yù)后關(guān)系 根據(jù)GEO數(shù)據(jù)庫資料分析顯示，UFC1高表達的DLBCL患者總生存期更短(P=0.009)，見圖2。

圖2 UFC1表達與DLBCL患者生存預(yù)后關(guān)系

2.6UFC1調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析 Pathway Commons數(shù)據(jù)庫分析顯示，UFC1與24種其他基因存在相互作用關(guān)系，包括AR、ATP6V1F、CLNS1A、KIRREL3、LDHB、LYPLA2、NEDD8、OGA、RPS27A、STAT1、TCF3、TYMS、UBA3、UBA5、UBA52、UBB、UBC、UNK、USP9X、VCL、VHL、WDYHV1、YKT6、ZFYVE19。

3 討 論

DLBCL是非霍奇金淋巴瘤中最常見的類型，無論在形態(tài)學(xué)還是臨床特征上，DLBCL都具有明顯的異質(zhì)性，有相當(dāng)一部分DLBCL患者治療效果不佳，患者的生存期存在明顯差異。研究DLBCL可能的發(fā)病機制對于DLBCL的診斷、治療及預(yù)后判斷均有積極的臨床意義。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)介導(dǎo)細胞內(nèi)泛素化的蛋白質(zhì)經(jīng)蛋白酶體降解，可高效并高選擇性地降解細胞內(nèi)蛋白質(zhì)，如細胞周期調(diào)節(jié)蛋白、癌基因和抑癌基因產(chǎn)物及變性變構(gòu)蛋白等[10]。繼泛素在20世紀(jì)70年代中期被發(fā)現(xiàn)后，與泛素類似的小蛋白家族不斷被報道，并被稱為泛素樣蛋白(UBLs)，其成員不斷增加。目前已經(jīng)鑒定出9大類17種的類泛素蛋白，包括NEDD8、SUMO、ISG15、FUB1、FAT10、Atg8、Atg12、Urm1和UFM1[4]。

UFC1是一個新鑒定的類似泛素結(jié)合酶E2，在人體定位于1號染色體上。Ufm1首先被Uba5(E1)激活，然后被轉(zhuǎn)移給Ufc1(E2)，再被轉(zhuǎn)移給Ufl1(E3)，最后共價結(jié)合到靶蛋白上。目前發(fā)現(xiàn)的靶蛋白有C20orf116[11]、CDK5RAP3/LZAP[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，與正常組織和細胞系相比，UFC1在乳腺癌組織和細胞系中呈高表達[13]。沉默的UFC1抑制了乳腺癌細胞的多種生物學(xué)活性，而乳腺癌細胞也起著miR-34a海綿的作用LncRNA，UFC1通過miR-34a/CXCL10軸調(diào)控乳腺癌的生物學(xué)活性，為乳腺癌提供了新的診斷標(biāo)志物和潛在的治療靶標(biāo)[14]。有研究以UFC1基因為對象，結(jié)果顯示，在正常的HBL100乳腺細胞系中的mRNA表達最低，而在乳腺癌細胞系MCF7、MDA-MB231、MDA-MB-453中的表達明顯增強，并且在乳腺癌細胞系MDA-MB-453中的表達最強；Western-blot檢測結(jié)果也顯示，在乳腺癌組織中UFC1基因的表達明顯高于正常乳腺組織，其表達量的不同，提示UFC1基因與乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展有著密切關(guān)系[15-17]。

本研究首先應(yīng)用在線數(shù)據(jù)庫分析UFC1的表達，顯示其在多種惡性腫瘤中均有異常的高表達，其與腫瘤有較為密切的關(guān)系。并且兩個數(shù)據(jù)庫均證實UFC1在DLBCL中也呈明顯的高表達，提示其與DLBCL的發(fā)病可能存在相關(guān)性。進一步將納入的標(biāo)本采用免疫組化檢測，證實在DLBCL患者標(biāo)本中UFC1表達明顯高于反應(yīng)性淋巴結(jié)炎患者標(biāo)本。將DLBCL患者的臨床特征進行分析，發(fā)現(xiàn)進展期(Ⅲ、Ⅳ期)DLBCL患者UFC1表達明顯高于局限期(Ⅰ、Ⅱ期)DLBCL患者，而DLBCL患者的臨床分期可能影響患者的臨床預(yù)后。因本研究隊列病例數(shù)較少，隨訪脫落數(shù)據(jù)偏多，筆者選擇GEO數(shù)據(jù)庫中包含DLBCL長期隨訪數(shù)據(jù)的GSE10846數(shù)據(jù)集分析UFC1表達與DLBCL生存預(yù)后關(guān)系，結(jié)果顯示，UFC1高表達的DLBCL患者總生存期更短。在Pathway Commons數(shù)據(jù)庫中檢索UFC1基因，發(fā)現(xiàn)其與多種腫瘤基因均存在相互作用關(guān)系，比如NEDD8與淋巴瘤密切相關(guān)，其作為淋巴瘤治療靶點已初步取得了臨床效果[18]。由此推測UFC1可能與多種腫瘤機制相關(guān)。

綜上所述，UFC1在DLBCL患者中呈異常高表達，UFC1的異常高表達與DLBCL較晚分期等存在相關(guān)性，并提示UFC1高表達的DLBCL患者可能存在不良預(yù)后。UFC1在多種腫瘤中異常表達，并且與多種腫瘤基因存在相互作用的可能，其深入的作用機制有待未來的進一步研究。