徐 艷，曹 冰，沈小星，徐佳佳，許文瑤，韓飛舟

近年來胃癌在全世界的發(fā)病率及病死率均在逐年增加，我國是胃癌大國，每年全世界的新發(fā)病例，有近1/2在我國，且多數(shù)患者在確診時(shí)已處于中晚期，中晚期胃癌的預(yù)后差，5年總生存率仍低于30%[1-2]。近年來，胃癌研究領(lǐng)域一項(xiàng)重要發(fā)現(xiàn)是7%～43%的病例中存在HER2蛋白過表達(dá)/基因擴(kuò)增，研究顯示，曲妥珠單抗聯(lián)合化療比單純化療能夠顯著延長HER2陽性的進(jìn)展期胃癌患者的生存期，證明HER2陽性的胃癌患者可從曲妥珠單抗治療中獲益，從而顯著提高預(yù)后[3-4]。但HER2陽性的患者仍然面臨著曲妥珠單抗治療后的耐藥和腫瘤復(fù)發(fā)，HER2陰性的患者也無法受益于曲妥珠單抗治療[5]。故尋找新的治療和預(yù)后判斷的分子靶點(diǎn)仍是胃癌研究領(lǐng)域的一項(xiàng)重要課題。多項(xiàng)研究證實(shí)抑制素βA（nhibin βA，INHβA）在人體多種惡性腫瘤如急性髓細(xì)胞性白血病、食管癌、膀胱癌、結(jié)直腸癌等中過表達(dá)，INHβA過表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移和化療耐受相關(guān)，INHβA過表達(dá)的腫瘤常常表現(xiàn)為分化程度差、臨床分期高、脈管浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移常見，患者預(yù)后差[6-9]。INHβA是預(yù)測胃癌發(fā)病和進(jìn)展的8個(gè)重要分子學(xué)指標(biāo)之一[10]。但目前關(guān)于INHβA表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系，以及作為潛在治療和預(yù)后判斷分子靶點(diǎn)的研究仍較少見。本研究通過觀察INHβA在胃癌中的表達(dá)，并分析與臨床病理參數(shù)、HER2蛋白過表達(dá)/基因擴(kuò)增的關(guān)系，探討INHβA作為胃癌新的個(gè)體化治療和預(yù)后判斷分子靶點(diǎn)的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 對象與方法

1.1 對象 收集東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院病理科2013年6月—2018年6月臨床資料完整的手術(shù)切除的胃癌病例共146例，其中男89例，女57例，年齡31～79歲，中位年齡61.4歲；近端胃癌59例，遠(yuǎn)端胃癌87例，；腸型91例，彌漫型37例，混合型18例；腫瘤分化程度：高-中分化腺癌90例，低-未分化癌56例；113例伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，33未檢測出區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；臨床分期Ⅰ期30例，Ⅱ/Ⅲ期116例。并隨機(jī)選取24例正常胃黏膜組織作為研究對照。所有病理存檔蠟塊4 μm厚切片，HE染色，光鏡下重新進(jìn)行組織學(xué)分類（以2010年WHO胃癌分類標(biāo)準(zhǔn)為標(biāo)準(zhǔn)），逐一復(fù)習(xí)患者的臨床病理資料并重新進(jìn)行臨床分期。采用電話或信件的方式進(jìn)行病例隨訪，隨訪截止日期為2019年12月31日，隨訪時(shí)間定義為手術(shù)日至死亡或至隨訪截止日期。

1.2 組織芯片制備和免疫組化染色 光鏡下重新組織學(xué)分類的過程中確定并標(biāo)記每一位患者具代表性的癌組織區(qū)域。使用組織微陣列儀（Beecher Instruments，美國）對標(biāo)記的癌組織區(qū)域及正常胃粘膜進(jìn)行穿刺，打孔針孔徑為1.6 mm，每個(gè)蠟塊的癌組織穿刺點(diǎn)不少于2個(gè)，所有標(biāo)本置于空白蠟塊中并做相應(yīng)記錄，制作成組織芯片蠟塊。組織芯片蠟塊5 μm厚切片，采用高溫高壓法進(jìn)行抗原修復(fù)，免疫組化兔抗人多克隆抗體INHβA（abcam，中國香港）按1:100稀釋，實(shí)驗(yàn)按Envision二步法進(jìn)行操作。INHβA的表達(dá)判斷標(biāo)準(zhǔn)簡述如下：①根據(jù)染色強(qiáng)度：0分，無染色；1分，淡黃色；2分，黃色；3分，棕黃色。②根據(jù)染色陽性細(xì)胞數(shù)：0分，陽性細(xì)胞＜10%；1分，11%～50%細(xì)胞陽性；2分，51%～75%細(xì)胞陽性；3分，＞75%細(xì)胞陽性；兩項(xiàng)合并后結(jié)果為：0～3分為陰性或低表達(dá)（INHβA－）；4～9分為過表達(dá)（INHβA＋）。使用HercepTestTM-HER2檢測試劑盒（Dako，丹麥）檢測HER2蛋白表達(dá)，結(jié)果判斷按改良HercepTestTMHER2（Dako，丹麥）評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，具體為：0，癌細(xì)胞無染色或＜10%癌細(xì)胞胞膜染色；1＋，10%癌細(xì)胞胞膜染色隱約可見或僅有部分膜染色；2＋，10%癌細(xì)胞基底側(cè)膜、側(cè)膜或胞膜完全輕-中度染色；3＋：10%癌細(xì)胞基底側(cè)膜、側(cè)膜或完全性胞膜強(qiáng)染色；0和1+視為陰性（HER2－），2＋視為不確定，3+視為陽性（HER2＋）；對HER2評分為2＋～3＋的病例進(jìn)一步應(yīng)用熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3 熒光原位雜交（FISH） FISH法檢測組織芯片中HER2基因擴(kuò)增，操作流程如下：4 μm厚切片脫蠟水化后蛋白酶K37 ℃孵育30 min，脫水風(fēng)干后備用。將FISH探針（安必平醫(yī)藥科技股份有限公司，中國）混合物置于（74±1）℃水浴箱變性5 min，切片滴加10 μl變性后探針混合物，加蓋蓋玻片后42 ℃溫箱中雜交過夜。切片滴加15 μl 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）復(fù)染劑，暗室內(nèi)放置10～20 min，熒光顯微鏡下判斷結(jié)果。判斷標(biāo)準(zhǔn)：每張切片計(jì)數(shù)30個(gè)癌細(xì)胞核紅色HER2信號和綠色CEN17信號，計(jì)算HER2/CEN17比值，比值2.0為HER2基因擴(kuò)增陽性（HER2＋），＜2.0為HER2基因擴(kuò)增陰性（HER2－）。為保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，對于比值介于1.8和2.2之間的病例，重新計(jì)數(shù)30個(gè)腫瘤細(xì)胞計(jì)算HER2/CEN17比值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法進(jìn)行比較，變量間相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性分析。生存分析采用Kaplan-Meier法，生存率的比較采用log-rank檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 INHβA過表達(dá) INHβA表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)和膜，呈棕黃色細(xì)顆粒狀（圖1）。INHβA在正常胃黏膜和胃癌的過表達(dá)率分別為12.5%（3/24）和61.6%（90/146），比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。胃癌中INHβA過表達(dá)與腫瘤大?。≒＜0.05）、分化程度（P＜0.01）、臨床分期（P＜0.05）以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＜0.01）相關(guān)；而與患者年齡、性別、腫瘤部位和組織學(xué)分型無相關(guān)性（P＜0.05）（表1）。

圖1 胃癌INHβA表達(dá)

2.2 HER2蛋白表達(dá)和基因擴(kuò)增 免疫組化顯示28例（19.2%）呈HER2陽性（3＋）表達(dá)；47例（32.2%）HER2表達(dá)不確定（2＋）。免疫組化陽性病例中，F(xiàn)ISH顯示存在HER2基因擴(kuò)增的有24例（16.4%），HER2蛋白表達(dá)與基因擴(kuò)增一致率為85.71%（24/28）（圖2）。47例HER2表達(dá)不確定病例經(jīng)FISH證實(shí)均無基因擴(kuò)增。在蛋白和基因水平上，HER2表達(dá)均與腫瘤的部位和組織學(xué)類型相關(guān)（P＜0.05），而與患者性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及臨床分期無相關(guān)性（P＜0.05）（表1）。

表1 胃癌中INHβA過表達(dá)、HER2蛋白表達(dá)和基因擴(kuò)增與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

圖2 胃癌HER2蛋白表達(dá)和基因擴(kuò)增

2.3 INHβA過表達(dá)與HER2蛋白表達(dá)和基因擴(kuò)增的相關(guān)性 Spearman相關(guān)分析顯示，INHβA過表達(dá)與HER2蛋白表達(dá)和基因擴(kuò)增均呈負(fù)相關(guān)（表2）。

表2 胃癌中INHβA與HER2表達(dá)的相關(guān)性

2.4 生存分析 除去9例失訪，3例死于感染、腦出血的病例，本研究共134例納入生存分析，隨訪時(shí)間18～80個(gè)月，隨訪期間56例（41.8%）死于胃癌，中位生存期為42.6個(gè)月。INHβA過表達(dá)（INHβA＋）患者總生存率顯著低于INHβA陰性及低表達(dá)（INHβA－）患者（P＜0.05），HER2＋患者總生存率略低于HER2－患者，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。根據(jù)INHβA和HER2表達(dá)情況進(jìn)一步分為INHβA/HER2雙表達(dá)組（INHβA＋/HER2＋）、單表達(dá)組（INHβA－/HER2＋和INHβA＋/HER2－）和雙陰性組（HER2－/INHβA－），生存分析顯示INHβA/HER2雙表達(dá)的患者預(yù)后最差，總生存率顯著低于單表達(dá)組和雙陰性組（P＜0.01）（圖3）。

圖3 Kaplan-Meier生存曲線

3 討論

INHβA是轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）基因超家族的配體之一，INHβA與激活素A形成二硫鍵同型二聚體，共同參與調(diào)控胚胎干細(xì)胞分化和器官形成等多種重要的生理活動(dòng)。近年來，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)INHβA參與腫瘤的發(fā)生、演進(jìn)、臨床治療反應(yīng)和預(yù)后等病理過程，多種腫瘤如急性髓細(xì)胞性白血病、食管癌、膀胱癌、結(jié)直腸癌等中存在INHβA過表達(dá)[6-9]。INHβA過表達(dá)不僅是患者預(yù)后不良的一個(gè)獨(dú)立判斷指標(biāo)，還是介導(dǎo)腫瘤上皮-基質(zhì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生化療耐受的重要機(jī)制之一。在本研究中胃癌患者中INHβA過表達(dá)率為61.6%，高于正常對照胃粘膜；INHβA過表達(dá)與腫瘤大小、分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，腫瘤直徑5 cm、低/未分化、進(jìn)展期（Ⅱ/Ⅲ期）及伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌中的INHβA過表達(dá)率顯著高于腫瘤直徑＜5 cm、高/中分化、早期（Ⅰ期）及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌；這提示INHβA過表達(dá)是促進(jìn)胃癌生長、浸潤和轉(zhuǎn)移的重要因素。本研究顯示INHβA過表達(dá)與胃癌的部位和組織學(xué)類型無相關(guān)性，提示INHβA在參與胃癌的組織形態(tài)學(xué)方面可能不發(fā)揮重要作用。生存分析顯示，INHβA過表達(dá)的患者5年總生存率低于INHβA陰性及低表達(dá)患者，這與既往Wang[11]和Oshima[12]等的研究結(jié)果一致，表明INHβA過表達(dá)可能主要參與進(jìn)展期胃癌的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程，并可以作為判斷患者預(yù)后不良的重要指標(biāo)。

HER2蛋白過表達(dá)/基因擴(kuò)增是胃癌最重要的分子學(xué)特征之一，ToGA和HERXO等多項(xiàng)臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)曲妥珠單抗聯(lián)合化療比單純化療能夠顯著延長HER2陽性的進(jìn)展期胃癌患者的生存期，目前曲妥珠單抗已經(jīng)成為治療HER2陽性晚期胃癌的一線用藥。本研究結(jié)果顯示HER2蛋白陽性表達(dá)及基因擴(kuò)增均主要見于近端胃癌，組織學(xué)類型多為腸型胃癌。HER2蛋白表示及基因擴(kuò)增與患者的年齡、性別、腫瘤大小、分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及臨床分期均無顯著相關(guān)性。盡管多項(xiàng)研究結(jié)果顯示HER2＋的胃癌侵襲性強(qiáng)，患者預(yù)后較差，本研究結(jié)果顯示HER2＋胃癌患者預(yù)后略低于HER2－患者，但5年總生存率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與Grabsch等[13]和武鴻美等[14]研究結(jié)果一致。此外，本研究還首次發(fā)現(xiàn)INHβA過表達(dá)與HER2蛋白過表達(dá)/基因擴(kuò)增存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，即HER2＋病例中INHβA表達(dá)率較低，而HER2-病例存在INHβA過表達(dá)，根據(jù)INHβA和HER2的表達(dá)情況可以將胃癌分為雙表達(dá)（INHβA＋/HER2＋）、單表達(dá)（INHβA－/HER2＋和INHβA＋/HER2－）和雙陰性（HER2－/INHβA－）3種不同分子學(xué)類型，生存分析顯示不同類型之間的預(yù)后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，INHβA/HER2雙表達(dá)的患者預(yù)后最差，總生存率低于單表達(dá)組和雙陰性組。多種惡性腫瘤中INHβA過表達(dá)使其成為潛在的治療靶點(diǎn)，INHβA/HER2表達(dá)的不同類型也為胃癌的個(gè)體化治療提供了新的策略，即對于INHβA－/HER2＋胃癌應(yīng)首選曲妥珠單抗治療，對于INHβA＋/HER2－胃癌可以選擇靶向INHβA治療，而對于預(yù)后最差的INHβA/HER2雙表達(dá)胃癌，臨床則可以考慮雙靶點(diǎn)的聯(lián)合治療。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)胃癌中存在INHβA顯著過表達(dá)，INHβA過表達(dá)可能與胃癌的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移有關(guān)。INHβA過表達(dá)的胃癌預(yù)后差，提示INHβA可以作為判斷預(yù)后的重要參考指標(biāo)。根據(jù)INHβA和HER2的表達(dá)可以將胃癌分為3種不同的分子學(xué)類型，為胃癌的靶向治療提供了新的思路。