寧豫昌，李琰歌，侯文靜

(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450046)

1 前言

羊奶風(fēng)味獨(dú)特，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，不僅含有蛋白質(zhì)、乳糖、脂肪，還含有碳水化合物和多種維生素。因其本身具備酪蛋白膠粒以及乳脂肪球較小的特點(diǎn)[1]，所以較牛奶更有利于人體消化吸收，尤其適合腸胃不佳、乳糖不耐癥、過(guò)敏體質(zhì)等人群。但是羊奶特有的膻味導(dǎo)致羊奶及其制品的開(kāi)發(fā)和銷(xiāo)售受到了限制。有研究表明，添加適量的植物提取物或果蔬汁可有效改善羊奶或其制品的膻味。例如，焦凌梅等[2]發(fā)現(xiàn)，在羊奶中添加鮮橘皮或者胡蘿卜汁等皆可去除羊奶膻味。王晶晶等[3]研究表明，在羊奶中添加毛酸漿水提取物進(jìn)行混合發(fā)酵，可產(chǎn)生協(xié)同增香效果，且能有效減少羊酸奶的膻味。添加植物提取物或果蔬汁，不僅可改善乳制品的風(fēng)味，還可提高產(chǎn)品抗氧化性等品質(zhì)。宋慧等[4]研究發(fā)現(xiàn)，添加獼猴桃汁和茉莉花汁制備凝固型酸奶，可使試驗(yàn)組中游離氨基酸、總酚質(zhì)量濃度、乳酸菌活菌數(shù)分別較對(duì)照組提高8.1%、59.54%、5.1%，且可有效提高試驗(yàn)組的抗氧化性。胡錦濤等[5]研究了漿果果渣對(duì)酸奶品質(zhì)的影響，結(jié)果表明將 1.5%的紅樹(shù)莓、藍(lán)莓、黑加侖三種漿果果渣分別加入到酸奶中，試驗(yàn)組的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)自由基清除率、總還原力、羥自由基清除率分別為對(duì)照組的3.93倍、13.11倍、4.28倍。但是，目前關(guān)于添加植物提取物或果蔬汁等對(duì)酸奶品質(zhì)的影響，大多以牛酸奶為研究對(duì)象，而以羊酸奶為研究對(duì)象的研究尚不多見(jiàn)。

實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，在羊酸奶中添加黑布林果汁進(jìn)行混合發(fā)酵，可消除羊酸奶的膻味，且制得的羊酸奶酸甜可口。黑布林(Prunussalicina)為薔薇目，薔薇科，李屬的落葉喬木。黑布林是漿果類(lèi)水果，其果皮為紫黑色，內(nèi)部果肉為黃色，果汁豐富且口味清甜。黑布林中含有清除體內(nèi)自由基最有成效的天然抗氧化劑——原花青素，這種生物活性物質(zhì)具有預(yù)防腫瘤、高血壓，保護(hù)心腦血管，抑菌消炎等功效[6]。此外，原花青素還可促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生膠原質(zhì)，使皮膚保持彈性[7]。但是，添加黑布林混合發(fā)酵，除可改善羊酸奶風(fēng)味和口感外，對(duì)產(chǎn)品的抗氧化物質(zhì)含量、乳酸菌含量、持水力等的影響尚不清楚。本文主要研究羊酸奶添加黑布林果汁混合發(fā)酵，在15 d的貯藏期內(nèi)是否對(duì)抗氧化物質(zhì)、理化指標(biāo)、乳酸菌含量、持水力等產(chǎn)生影響，從而為利用黑布林果汁混合發(fā)酵制備羊酸奶提供理論依據(jù)。

2 材料和試劑

2.1 試驗(yàn)材料

鮮羊奶購(gòu)自河南開(kāi)封奶山羊養(yǎng)殖戶，黑布林購(gòu)自鄭州市丹尼斯超市，酸奶發(fā)酵劑(菌種為嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌)購(gòu)自安琪酵母股份有限公司。維生素C、三氯乙酸、沒(méi)食子酸、碘、碳酸鈉、蘆丁、亞硝酸鈉、硝酸鋁等均為國(guó)產(chǎn)分析純，福林酚試劑購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)，MRS瓊脂購(gòu)自青島海博生物科技有限公司。

2.2 主要儀器和設(shè)備

高速在線剪切機(jī)(FA30，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)，臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(H1850R，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)。

3 方法

3.1 黑布林羊酸奶加工工藝

在新鮮羊奶中添加9%的白砂糖和11%經(jīng)70 ℃、20 min巴氏殺菌的黑布林果汁，并接入0.2%酸奶發(fā)酵劑(含保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌)，混合均勻，在39 ℃的恒溫條件下發(fā)酵10.5 h，發(fā)酵完成后冷藏于4 ℃冰箱。在15 d的貯藏期內(nèi)每隔3 d對(duì)添加黑布林果汁羊酸奶的試驗(yàn)組，和未添加黑布林果汁的對(duì)照組進(jìn)行理化指標(biāo)、乳酸菌活菌數(shù)、維生素C、總酚、總黃酮、持水力等進(jìn)行測(cè)定。

3.2 pH值的測(cè)定

利用pH計(jì)對(duì)樣品pH值進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品設(shè)三個(gè)重復(fù)并取其平均值。

3.3 酸度的測(cè)定

參照GB 5413.34-2010[8]。取5 mL樣液加入100 mL燒杯中，再在燒杯中加入45 mL無(wú)菌水，使液體總體積達(dá)到50 mL,再滴入2或3滴酚酞溶液，再慢慢滴入0.1 mol/L的NaOH溶液，邊加邊搖勻，直到樣品變色至淡粉色并且在30 s內(nèi)顏色不變，然后再以下列公式計(jì)算酸度值：

C：標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液的濃度mol/L;

V：消耗0.1 mol/L氫氧化鈉溶液的體積mL;

k：折算為適當(dāng)?shù)乃岬墓潭ㄖ?，用乳酸表示時(shí)，k=0.09;

M：樣品體積mL。

3.4 乳酸菌含量測(cè)定

參照GB/T 4789.35-2016[9]，將25 g樣品加入到225 mL無(wú)菌生理鹽水中，混勻即為10-1樣品稀釋液，然后從10-1樣品稀釋液中吸取1 mL，加入9 mL無(wú)菌生理鹽水中，混勻即為10-2樣品稀釋液，依次方法，直至將樣品稀釋至10-6。然后選擇3個(gè)連續(xù)的稀釋度，每個(gè)稀釋度吸取0.2 mL稀釋液加入MRS瓊脂平板中，并涂布均勻，每個(gè)稀釋度接種3個(gè)MRS瓊脂平板。37 ℃下倒置培養(yǎng)48 h后，選取合適的稀釋度(平均菌落數(shù)在30～300之間)進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，測(cè)得每克樣品中乳酸菌的菌落形成單位。

3.5 維生素C的測(cè)定

采用碘量法[10]測(cè)定樣品中維生素C的含量。首先用標(biāo)準(zhǔn)維生素C溶液標(biāo)定碘溶液，計(jì)算每1 mL碘液中所相當(dāng)?shù)木S生素C毫克數(shù)。取25 g羊酸奶樣品，用5%的三氯乙酸定容至100 mL，再加入5 g/L的淀粉溶液2 mL，立即用濃度為0.01 mol/L的碘液滴定至藍(lán)色并保持30 s不褪色，記錄此時(shí)所消耗碘液的量。每組數(shù)據(jù)設(shè)三個(gè)平行，并取其平均值計(jì)算樣品中Vc的含量，計(jì)算公式如下。

X：樣品中維生素C的含量，單位為mg/25 g；

T：1 mL碘標(biāo)準(zhǔn)溶液相當(dāng)于維生素C的質(zhì)量，單位mg；

m：樣品的質(zhì)量，單位g；

V：滴定樣品所消耗的碘標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，單位mL。

3.6 總酚的測(cè)定

首先對(duì)樣品進(jìn)行前處理，取10 g樣品置于50 mL的離心管中，加入15 mL超純水，12000 r/min剪切提取1 min，然后-20 ℃靜置1 h使蛋白質(zhì)充分沉淀，結(jié)束后取出并待其融化后在4 ℃下7000 r/min離心10 min，小心取其上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，用于總酚及后續(xù)指標(biāo)的測(cè)定。參考李輝等[11]方法，采用福林酚比色法對(duì)樣品中的總酚含量進(jìn)行測(cè)定。

3.7 總黃酮的測(cè)定

參考趙永波[12]的方法，采用(NaNO2-Al(NO3)3法測(cè)定樣品中總黃酮的含量。首先繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，精密吸取質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，并用超純水定容至刻度線，得到0.0 mg/mL、0.15 mg/mL、0.3 mg/mL、0.45 mg/mL、0.6 mg/mL、0.75 mg/mL、0.9 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別取以上質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 mL到10 mL容量瓶中，各加5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL搖勻，放置6 min后，加10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min后加1 mol/L氫氧化鈉溶液4 mL，再用60%乙醇溶液稀釋至刻度，放置15 min后，分別在510 nm處測(cè)定其吸光度(以試劑空白做參比)。以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

當(dāng)測(cè)定樣品中總黃酮含量時(shí)，取處理后樣液1.6 mL，用測(cè)定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的方法對(duì)其進(jìn)行測(cè)定，按照蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣液中總黃酮含量，單位為mg/mL。

3.8 持水力的測(cè)定

持水力的測(cè)定方法參考談文詩(shī)[13]的方法并稍作改動(dòng)，準(zhǔn)確稱(chēng)取酸乳樣品5 g，10 ℃下10000 r/min離心30 min，離心結(jié)束后立即取出并用針管小心吸去全部上清物，然后使離心管保持倒置狀態(tài)，10 min后立即稱(chēng)重，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行，測(cè)定結(jié)果取其平均值并計(jì)算持水力：

m：離心沉淀物重量，單位g；

M：樣品重量，單位g。

3.9 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 24.0的進(jìn)行顯著性差異分析，P<0.05為差異顯著。

4 結(jié)果與討論

4.1 pH和酸度的測(cè)定結(jié)果

羊酸奶在15 d貯藏期內(nèi)的pH變化和酸度變化分別如圖1和圖2所示。由圖1可知，在貯藏期內(nèi)，與未添加黑布林果汁的對(duì)照組相比，試驗(yàn)組的pH降低了2.91%～4.94%；由圖2可見(jiàn)，在貯藏期內(nèi)，試驗(yàn)組的酸度較對(duì)照組提高8.91%～19.96%。說(shuō)明添加黑布林果汁混合發(fā)酵，可提高產(chǎn)品酸度，降低產(chǎn)品pH。推測(cè)黑布林果汁可促進(jìn)酸奶中乳酸菌的代謝產(chǎn)酸。欒生超等[14]的研究表明，紅樹(shù)莓提取物對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸具有明顯促進(jìn)作用。

圖1 貯藏期內(nèi)pH的變化

圖2 貯藏期內(nèi)酸度的變化

4.2 乳酸菌含量的測(cè)定結(jié)果

表1是貯藏期內(nèi)，添加黑布林果汁對(duì)羊酸奶乳酸菌含量的影響。由表1可知發(fā)酵剛結(jié)束時(shí)，對(duì)照組的乳酸菌含量顯著大于試驗(yàn)組(P<0.05)。雖然在整個(gè)貯藏期內(nèi)，試驗(yàn)組和對(duì)照組的乳酸菌含量均呈下降趨勢(shì)，但是從第3 d之后，試驗(yàn)組的乳酸菌含量始終顯著大于對(duì)照組(P<0.05)，說(shuō)明添加黑布林果汁混合發(fā)酵，有助于維持羊酸奶中活性乳酸菌的含量。

表1 15 d貯藏期內(nèi)乳酸菌含量的變化 CFU/mL

4.3 維生素C的測(cè)定結(jié)果

羊酸奶樣品在15 d的貯藏期內(nèi)維生素C含量變化如圖3所示。在貯藏期內(nèi)，試驗(yàn)組和對(duì)照組的維生素C含量均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，推測(cè)可能是乳酸菌通過(guò)合成代謝增加了維生素C的含量。例如，魏娜[15]研究表明，多種乳酸菌具有合成維生素C的能力。此外，通過(guò)單因素方差分析可知，在貯藏期內(nèi)，試驗(yàn)組的維生素C含量均顯著大于對(duì)照組(P<0.05)。為了驗(yàn)證試驗(yàn)組維生素C含量大于對(duì)照組是否因?yàn)楹诓剂止旧砗休^多的維生素C，利用pH7.2的無(wú)菌磷酸緩沖液將黑布林果汁進(jìn)行適當(dāng)稀釋?zhuān)蛊浜颗c試驗(yàn)組和對(duì)照組一致，并在同樣條件下進(jìn)行貯存，此為黑布林果汁組。結(jié)果顯示，在貯藏的0 d，黑布林果汁組的維生素C含量大于對(duì)照組，但是在貯藏期內(nèi)黑布林果汁組維生素C含量卻快速下降，而試驗(yàn)組和對(duì)照組的維生素C含量則逐漸上升。因此，黑布林果汁的加入確實(shí)有利于提高試驗(yàn)組的維生素C含量，但是可能由于缺乏酸性環(huán)境，黑布林果汁組的維生素C含量快速下降。

圖3 貯藏期內(nèi)維生素C含量的變化

4.4 總酚含量的測(cè)定結(jié)果

羊酸奶樣品在15 d貯藏期內(nèi)的總酚含量變化如圖4所示。在貯藏期內(nèi)，試驗(yàn)組和對(duì)照組的總酚含量均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，且試驗(yàn)組的總酚含量始終大于對(duì)照組，其中，在第15 d測(cè)得對(duì)照組的總酚含量最接近試驗(yàn)組，但是此時(shí)試驗(yàn)組的總酚含量仍顯著大于(P<0.05)對(duì)照組。試驗(yàn)結(jié)果顯示，黑布林果汁組的總酚含量在貯藏0 d時(shí)大于對(duì)照組而小于試驗(yàn)組，此后則呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，因此，黑布林果汁的加入確實(shí)有助于提高試驗(yàn)組的總酚含量，但是，在未經(jīng)乳酸菌發(fā)酵的情況下，黑布林果汁組的總酚會(huì)逐漸減少。董英麗[16]研究表明，德氏乳桿菌乳酸亞種(Lactobacillusdelveburekiissp.lactis)具有合成多酚的能力，因此，推測(cè)試驗(yàn)組和對(duì)照組在貯藏過(guò)程中均可能因?yàn)槿樗峋x而不斷合成多酚類(lèi)物質(zhì)，而黑布林果汁的加入，則使試驗(yàn)組的總酚含量大于對(duì)照組。

圖4 貯藏期內(nèi)總酚含量變化

4.5 總黃酮含量的測(cè)定結(jié)果

羊酸奶樣品在15 d貯藏期內(nèi)的總黃酮含量變化如圖5所示。在貯藏期內(nèi)，試驗(yàn)組和對(duì)照組的總黃酮含量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，這一結(jié)果與李倩等[17]的研究結(jié)果相似，推測(cè)可能是由于發(fā)酵過(guò)程中生成了黃酮糖苷類(lèi)物質(zhì)，而隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，乳酸菌分泌的β-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、葡萄糖碳苷酶等多種糖苷酶，使得黃酮糖苷物分解為苷元，導(dǎo)致黃酮含量下降[18]。此外，在貯藏期0 d時(shí)，測(cè)得黑布林果汁組的總黃酮含量為0.032 mg/mL，這可能是導(dǎo)致試驗(yàn)組的總黃酮含量大于對(duì)照組的主要原因。此外，黑布林果汁的加入，促進(jìn)了乳酸菌產(chǎn)酸，而酸的積累會(huì)抑制分解黃酮酶類(lèi)的活力，而圖2的結(jié)果也證實(shí)試驗(yàn)組的酸度始終大于對(duì)照組。

圖5 貯藏期內(nèi)總黃酮含量的變化

4.6 持水力測(cè)定結(jié)果

貯藏期內(nèi)試驗(yàn)組和對(duì)照組持水力的變化如圖6所示。在整個(gè)貯藏期內(nèi)，試驗(yàn)組和對(duì)照組的持水力均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，并且對(duì)照組的持水力始終顯著大于(P<0.05)試驗(yàn)組。陳南等[19]研究發(fā)現(xiàn)，添加番茄汁混合發(fā)酵，可增加酸奶的持水力。但是，添加果汁提高酸奶持水力的原因目前尚不清楚。

圖6 貯藏期內(nèi)持水力的變化

5 結(jié)論

通過(guò)在羊奶中添加11%經(jīng)巴氏殺菌處理的黑布林果汁進(jìn)行混合發(fā)酵，并在15 d的貯藏期內(nèi)測(cè)定試驗(yàn)組和對(duì)照組的pH、酸度、乳酸菌活菌含量、持水力、維生素C等物質(zhì)的含量等，研究添加黑布林果汁對(duì)羊酸奶品質(zhì)的影響。結(jié)果表明，黑布林果汁的加入可顯著提高貯藏期內(nèi)羊酸奶中乳酸菌的含量，并促進(jìn)乳酸菌產(chǎn)酸，并可能通過(guò)促進(jìn)乳酸菌的代謝，提高試驗(yàn)組維生素C和總酚的含量。此外，黑布林果汁的加入可能通過(guò)促進(jìn)試驗(yàn)組的酸積累，從而抑制試驗(yàn)組乳酸菌對(duì)黃酮類(lèi)化合物的分解，提高試驗(yàn)組的總黃酮含量。而在整個(gè)貯藏期內(nèi)，試驗(yàn)組的持水力始終顯著大于對(duì)照組。因此，添加黑布林果汁進(jìn)行混合發(fā)酵，可有效維持羊酸奶中乳酸菌的含量，促進(jìn)乳酸菌產(chǎn)酸，并提高羊酸奶中維生素C、總酚、總黃酮等的含量，提高羊酸奶的持水力，從而有利于增強(qiáng)羊酸奶的品質(zhì)。