崔麗偉，胡 平，劉俊桃

(河南牧業(yè)經(jīng)濟學院 食品與生物工程學院，河南 鄭州 450046)

自上個世紀以來，農(nóng)產(chǎn)品增產(chǎn)很大程度上獲益于農(nóng)藥的推廣應(yīng)用。然而，即便是在極低濃度下農(nóng)藥殘留也會對人體造成許多不利影響，因此對農(nóng)藥殘留的檢測意義重大。色譜技術(shù)以及色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在農(nóng)藥殘留檢測中的應(yīng)用十分普遍，且部分已有國家的標準，但該類方法存在需要專業(yè)人員操作、儀器昂貴、樣品預(yù)處理過程復(fù)雜、測定耗時長、分析成本高等缺點，從而限制了這些技術(shù)的廣泛應(yīng)用[1]。近年來，隨著電化學方法的不斷發(fā)展，生物傳感器隨之產(chǎn)生。它具有靈敏度高、檢出限小、易制備、測定成本低等優(yōu)點，在物質(zhì)痕量檢測方面引起越來越多學者的注意。本文根據(jù)生物傳感器的類型及檢測原理，簡要介紹生物傳感器在農(nóng)藥殘留中的應(yīng)用。

1 生物傳感器的定義、原理及分類

Clark于1956年首次提出生物傳感器的概念，并在六年后成功地將葡萄糖氧化酶與氧電極結(jié)合測定了葡萄糖，間接驗證了隔離式氧電極檢測方法的可行性，酶電極由此產(chǎn)生。隨著分子生物學與微電子學的持續(xù)發(fā)展，生物傳感器的方法和理論也在不斷發(fā)展變化[2]。國際理論和應(yīng)用化學聯(lián)合會將生物傳感器定義為與轉(zhuǎn)能器保持直接空間接觸的生物識別元件(受體)提供特殊的定量和半定量分析信息的一個獨立、完整的裝置，測定原理如圖1所示。待測樣品擴散后與生物識別元件匯合，樣品中的特定目標分析物會迅速和傳感器的生物敏感層以酶與底物、抗原與抗體、核酸與其互補片段等方式進行特異性識別，出現(xiàn)聲音、熱量、顏色、質(zhì)量等物理信號的變化，經(jīng)特定儀表放大處理后被顯示、記錄。生物敏感元件顯現(xiàn)的這些物理變化經(jīng)不同的信號轉(zhuǎn)換器(離子選擇電極、壓電裝置、熱敏電阻、光敏管等)轉(zhuǎn)變成電信號，進行定量處理并經(jīng)過二次放大處理后被輸出，通過直接電極測定其電壓或電流值，通過數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)即可換算出被測樣品中所含待測物物質(zhì)的量和濃度。

圖1 生物傳感器的工作原理

除了在生物技術(shù)方面的應(yīng)用，生物傳感器在食品工業(yè)、發(fā)酵產(chǎn)業(yè)、環(huán)境監(jiān)測及醫(yī)藥領(lǐng)域也有一定的應(yīng)用。依據(jù)不同條件生物傳感器可劃分為不同類型。按生物傳感器識別元件感受器敏感層不同，可分為酶傳感器、免疫傳感器、細胞傳感器、組織傳感器等；按生物傳感器中信號轉(zhuǎn)換器的檢測原理不同，可分為酶電極生物傳感器、光學生物傳感器、壓電生物傳感器、聲波道生物傳感器、介體生物傳感器、場效應(yīng)管生物傳感器、熱敏生物傳感器、光敏生物傳感器等；按生物傳感器中待測物質(zhì)與生物敏感層作用類型不同，可分為親和型生物傳感器、代謝型生物傳感器。在生物傳感器的實際使用中，不同類型生物傳感器的構(gòu)成部件是通用的，各個類型之間存在著相互聯(lián)系。常用于農(nóng)藥殘留檢測的生物傳感器有：酶傳感器、微生物傳感器、免疫生物傳感器和壓電生物傳感器等。

2 生物傳感器在農(nóng)藥殘留檢測中的應(yīng)用

2.1 酶傳感器

在生物傳感器的應(yīng)用中，酶是首次被使用的分子識別元件，不同種類的酶制成的生物傳感器在測定農(nóng)藥時的響應(yīng)機理不同，例如，酪氨酸酶對酚類農(nóng)藥有催化作用，有機磷酸酯類農(nóng)藥對乙酰膽堿酯酶有特異性抑制作用[3]。

乙酰膽堿是高等動物體內(nèi)主要的神經(jīng)遞質(zhì)，乙酰膽堿酯酶可迅速將乙酰膽堿水解生成醋酸鹽和膽堿，從而實現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)的正常信號傳輸。Lu等[4]將制備好的鈀@金納米復(fù)合材料修飾電極表面負載的乙酰膽堿酯酶，構(gòu)建了一種有機磷農(nóng)藥對氧磷的檢測方法，該方法檢出限為3.6 pM，線性范圍是3.6 pM～100 nM。李純等[5]采用靜電紡絲法制備了氧化鋅微納米纖維材料修飾玻碳電極，然后在其表面負載酪氨酸酶，構(gòu)建了Tyr/ZnO/CS/GCE生物傳感電極來檢測鄰苯二酚的含量，該方法特異性好、靈敏度高且線性范圍寬，為廢水中鄰苯二酚含量的檢測提供新思路。

單一酶傳感器僅能檢測單一環(huán)境污染物，這已遠遠不能滿足日益嚴峻的食品安全問題的需要。因此，人們開始在傳感器上嘗試多酶組合來增加可檢測污染物的數(shù)量，例如可以通過固定酪氨酸酶和蟲漆酶來檢測各種酚醛樹脂的殘留物。

2.2 微生物傳感器

近年來，分子生物學的發(fā)展為改變現(xiàn)有酶活性或在宿主細胞中表達外源蛋白提供了可能，使得微生物傳感器有了更為廣闊的應(yīng)用空間[6]。

微生物傳感器的基本檢測原理如下：微生物利用物質(zhì)進行呼吸代謝時會消耗溶液中的可溶性氧或制造電活性產(chǎn)物，可溶性氧的消耗量和電活性產(chǎn)物的總量反應(yīng)被檢測物質(zhì)的量。通過氣敏薄膜電極或離子選擇性電極來檢測可溶性氧和電活性產(chǎn)物的變化，從而得出所檢測物質(zhì)的總量[7]。例如，將小球藻固定到聚乙烯包被的碳電極表面，通過二極管照明在短時間內(nèi)快速檢測出除草劑中多種成分的含量。

微生物傳感器將微生物緊密固定在傳感器上，利用生物傳感器反應(yīng)時間短、操作穩(wěn)定性好和能長期使用的特性，達到重復(fù)利用的目的。由于黃桿菌具有有機磷水解酶，可將甲基對硫磷水解為可檢測的對硝基苯酚，從而為痕量檢測甲基對硫磷提供了新思路。Kumar等[8]根據(jù)此原理，使用玻璃纖維濾紙將黃桿菌固定，開發(fā)了一種用于甲基對硫磷農(nóng)藥檢測的光學微生物傳感器，該方法操作簡單、重現(xiàn)性好，所需樣品量僅需75 μL，檢出限低至0.3 μM。楊瑞紅[9]綜述了微生物傳感器在有機磷殘留檢測中的應(yīng)用，指出近年來為了構(gòu)建監(jiān)測有機磷殘留的微生物傳感器，不同類型的細胞被引入傳感器的研究中，例如細胞表面表達有機磷水解酶(OPH)的E．Coli微生物傳感器，細胞表面表達OPH的對硝基酚(PNP)降解細菌的微生物傳感器，基于釀酒酵母的微生物傳感器等。

2.3 免疫生物傳感器

1990年免疫傳感器的概念被首次提出，它具有靈敏度高、特異性強、操作簡便及成本低廉等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學、生物學、食品工業(yè)、環(huán)境監(jiān)測等多個不同領(lǐng)域。免疫傳感器能夠?qū)崿F(xiàn)免疫診斷的定量化與操作的自動化，目前應(yīng)用較為廣泛。

免疫傳感器[10]是利用抗體對抗原特異性識別和結(jié)合的特點，通過將抗體(或抗原)固化膜與信號轉(zhuǎn)換器相結(jié)合實現(xiàn)對抗原(或抗體)的檢測。當樣品中的抗原選擇性結(jié)合膜上固定抗體時，膜內(nèi)離子載體的性質(zhì)會發(fā)生顯著改變，進而導(dǎo)致電極上電位發(fā)生變化，以此來檢測待測抗體濃度。蔣雪松等[11]將毒死蜱人工抗原作為特異性識別原件固定在金電極表面，制備了特異性傳感器，樣品中的待測組分與電極表面的人工抗原競爭性結(jié)合溶液中的抗體，從而間接測定樣品中毒死蜱含量。通過對傳感器的靈敏度和準確度進行評價，發(fā)現(xiàn)所建方法檢出限低、準確性和回收率高。

納米材料因其生物相容性好、表面活性位點多、比表面積較大、吸附力強等特性，漸漸地進入電化學免疫傳感器研究領(lǐng)域[12]。將納米材料用在免疫傳感器上，不僅可以提高電極表面生物分子的吸附量，還可以保持抗原和抗體的生物活性不降低，最重要的是能夠加快響應(yīng)界面電子傳導(dǎo)或催化電極表面化學反應(yīng)，因此兩者結(jié)合可以用來研制高靈敏度、高選擇性的免疫傳感器。目前研制電化學免疫傳感器的關(guān)鍵在于如何將生物分子有效地固定在電極表面而不改變其穩(wěn)定性與活性。鄒敏[13]合成了四葉草狀的AuNP-Thi-MoS2納米復(fù)合材料，用于修飾電極，然后在其表面負載待測抗體，采用方波伏安法、交流阻抗法對傳感器制備過程進行表征，對傳感器的準確度、靈敏度、選擇性等進行評價，結(jié)果顯示該免疫傳感器能夠較好地用于樣品測定，采用MoS2-金屬顆粒復(fù)合材料為基底的免疫傳感器具有廣闊的應(yīng)用前景。

2.4 壓電生物傳感器

壓電生物傳感器是利用壓電石英諧振器的傳感特性監(jiān)控原料發(fā)生反應(yīng)后的共振器頻率而檢測原料是否發(fā)生改變，其優(yōu)勢為響應(yīng)頻帶寬、靈敏度高、信噪比大、結(jié)構(gòu)簡單、工作可靠、重量輕等[14]。

壓電生物傳感器中最具代表性的是石英晶體壓電傳感器。石英晶體壓電方法的核心是將目標受體固定在石英晶體的電極表面，在與配體結(jié)合時測量該目標受體在電極表面反應(yīng)的信號轉(zhuǎn)化，然后檢測由晶體表面變化造成的晶體頻率改變。

蔣雪松等[15]構(gòu)建了一種基于流動注射的有機磷農(nóng)藥壓電免疫生物傳感器，比較了不同有機磷單克隆抗體在石英晶體金電極表面上的固定方式對待測信號產(chǎn)生的影響，建立了有效捕獲有機磷農(nóng)藥抗原的方法。結(jié)果表明，當有機磷濃度在0.005～10 μg/mL范圍時與晶體頻率變化呈較好的相關(guān)性，所建方法最低檢出限為2.16×10-3μg/mL。

除此之外，其他種類的生物傳感器，例如以人工模擬生物分子為基礎(chǔ)的生物傳感器、全細胞生物傳感器、光纖生物傳感器等也已經(jīng)被開發(fā)。

3 小結(jié)

近年來，隨著分子生物學、計算機科學、食品科學的發(fā)展，生物傳感器在其檢出限、重復(fù)性、適用范圍、靈敏度方面得到了較大改善，但是仍然存在一系列問題，例如特異性、穩(wěn)定性需要進一步提高，制備過程需要簡化等。隨著科學技術(shù)的發(fā)展，生物傳感器必將向多組分同時測定、微型化、智能化的方向發(fā)展，以適應(yīng)社會發(fā)展的需求。