陳亞柯，徐青青，孫寧，宋洋，邱新光，陳建民

1鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院甲狀腺二/疝和腹壁外科，鄭州 450052

2鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院保育中心，鄭州 450000

甲狀腺癌是臨床常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤，約占全身惡性腫瘤的1%，其發(fā)病與地區(qū)、種族、性別等諸多因素密切相關(guān)，如今全球內(nèi)甲狀腺癌發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅患者身心健康。甲狀腺癌根治術(shù)是臨床常用治療手段，大部分患者預(yù)后良好，總體生存率較高，但有少數(shù)患者預(yù)后較差。甲狀腺癌術(shù)后患者生存時(shí)間的影響因素較為復(fù)雜，但臨床研究認(rèn)為，甲狀腺癌細(xì)胞黏附性、侵襲轉(zhuǎn)移能力與腫瘤轉(zhuǎn)移、術(shù)后復(fù)發(fā)等密切相關(guān)，但具體作用機(jī)制仍有待研究。性別決定區(qū)Y盒轉(zhuǎn)錄因子 9（sex determining region Y-box transcription factor 9，SOX9）與細(xì)胞增殖、分化、遷移等過程均存在聯(lián)系。研究證實(shí)，SOX9在乳腺癌組織中呈陽(yáng)性表達(dá)，且明顯高于癌旁組織，能夠參與腫瘤發(fā)生過程。BECN1是一種抑癌基因，其表達(dá)能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的降解，抑制腫瘤細(xì)胞過度增殖，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。理想的免疫學(xué)或基因?qū)W標(biāo)志物對(duì)甲狀腺癌的早期診療、療效及預(yù)后評(píng)估十分關(guān)鍵，基于既往研究及上述理論，本研究回顧性探討B(tài)ECN1、SOX9在甲狀腺癌組織中的表達(dá)及與患者臨床特征、預(yù)后的關(guān)系，以期為甲狀腺癌的臨床診療及預(yù)后評(píng)估提供理論參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2014年1月至2017年1月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的甲狀腺癌患者的病歷資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)臨床病理檢查證實(shí)為甲狀腺癌；均經(jīng)甲狀腺癌根治術(shù)治療；術(shù)前甲狀腺功能正常；術(shù)后未接受放化療；病歷資料及隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤；放射線暴露史；自身免疫疾病及全身疾??；血液系統(tǒng)疾??；嚴(yán)重軀體性疾??；合并心臟病、糖尿病、冠心病等嚴(yán)重內(nèi)科疾??；器質(zhì)性功能不全或障礙；生存時(shí)間不足半年；精神疾病；未完成隨訪。根據(jù)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)，共納入106例甲狀腺癌患者，取其甲狀腺癌組織及癌旁組織。

1.2 方法

1.2.1 檢測(cè)方法 術(shù)中獲得甲狀腺癌組織及癌旁組織，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，采用SP免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)BECN1、SOX9表達(dá)情況，組織切片常規(guī)脫蠟水化，臨用前常規(guī)63℃烤爐烤1 h，二甲苯、無(wú)水乙醇以及80%～90%乙醇浸泡，以封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性。微波枸櫞酸鹽抗原修復(fù)，降至室溫后磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）洗3次，每次5 min，滴加阻斷劑，置于室溫下15 min。加一抗（工作濃度1∶600）4℃孵育24 h，PBS洗3次，每次1 min；滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育30 min，PBS洗3次，每次3 min；滴加SP試劑并于37℃孵育1 h，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木素復(fù)染、脫水、干燥、中性樹脂封片。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞百分比進(jìn)行半定量分析，每張免疫組化切片隨機(jī)選擇5～10個(gè)具有代表性的高倍視野進(jìn)行評(píng)估。染色強(qiáng)度：無(wú)染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分；陽(yáng)性細(xì)胞百分比：＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，＞50%為3分。上述兩項(xiàng)積分相加，0～3分為陰性，≥4分陽(yáng)性。

1.2.2 研究方法 比較甲狀腺癌組織及癌旁組織中BECN1、SOX9表達(dá)情況，依據(jù)患者入院建立的檔案，收集患者年齡、腫瘤大小、臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床特征，并比較分析甲狀腺癌組織中BECN1、SOX9表達(dá)與患者臨床特征的關(guān)系。

1.2.3 隨訪 術(shù)后進(jìn)行為期3年的隨訪，每3個(gè)月進(jìn)行1次，采用門診隨訪、電話隨訪或走訪等形式，具體包括常規(guī)體格檢查、實(shí)驗(yàn)室生化指標(biāo)檢測(cè)、影像學(xué)檢查等，隨訪截止時(shí)間為2020年1月，記錄所有患者生存時(shí)間。采用多因素Logistic回歸模型分析甲狀腺癌患者預(yù)后影響因素。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 BECN1、SOX9表達(dá)情況的比較

BECN1、SOX9陽(yáng)性均主要定位于細(xì)胞質(zhì)中。甲狀腺癌組織中SOX9陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁組織，BECN1陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表1）

表1 甲狀腺癌組織及癌旁組織中BECN1、SOX9表達(dá)情況的比較[n（%）]

2.2 不同臨床特征甲狀腺癌患者的甲狀腺癌組織中BECN1、SOX9表達(dá)情況的比較

不同年齡、病理類型、腫瘤大小甲狀腺癌患者甲狀腺癌組織中BECN1、SOX9陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）；Ⅰ～Ⅱ期、高分化、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移甲狀腺癌患者甲狀腺癌組織中BECN1陽(yáng)性表達(dá)率分別高于Ⅲ～Ⅳ期、中低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

χ

=15.914、21.626、6.052，

P

＜0.05）；Ⅰ～Ⅱ期、高分化、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移甲狀腺癌患者甲狀腺癌組織中SOX9陽(yáng)性表達(dá)率分別明顯低于Ⅲ～Ⅳ期、中低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

χ

=19.650、13.423、19.501，

P

＜0.01）。（表2）

表2 不同臨床特征甲狀腺癌患者的甲狀腺癌組織中BECN1、SOX9的表達(dá)情況（n=106）

2.3 不同BECN1、SOX9表達(dá)情況甲狀腺癌患者生存情況的比較

BECN1陽(yáng)性表達(dá)患者的平均生存時(shí)間為（35.26±8.39）個(gè)月，明顯長(zhǎng)于陰性表達(dá)患者的（30.16±7.35）個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

t

=4.707，

P

=0.000）；SOX9陽(yáng)性表達(dá)患者的平均生存時(shí)間為（31.20±8.03）個(gè)月，明顯短于陰性表達(dá)患者的（35.74±6.99）個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

t

=4.391，

P

=0.000）。

2.4 甲狀腺癌患者預(yù)后影響因素的單因素分析

不同年齡、病理類型甲狀腺癌患者3年生存率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）；不同臨床分期、腫瘤大小、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)、BECN1及SOX9表達(dá)情況的甲狀腺癌患者3年生存率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）。（表3）

表3 甲狀腺癌患者預(yù)后影響因素的單因素分析（n=106）

2.5 甲狀腺癌患者預(yù)后影響因素的多因素Logistic回歸分析

將表3中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、BECN1表達(dá)情況、SOX9表達(dá)情況作為自變量，患者預(yù)后作為因變量（生存=0，死亡=1）納入多因素Logistic回歸模型，結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、BECN1表達(dá)及SOX9表達(dá)均是甲狀腺癌患者預(yù)后的影響因素（

P

＜0.05）。（表4）

表4 甲狀腺癌患者預(yù)后影響因素的多因素Logistic回歸分析

3 討論

甲狀腺癌發(fā)病隱匿，患者早期無(wú)典型臨床特征，確診時(shí)腫瘤已發(fā)生轉(zhuǎn)移，臨床療效較差，因此甲狀腺癌的早期、準(zhǔn)確診療對(duì)于療效、患者預(yù)后均十分關(guān)鍵。腫瘤標(biāo)志物的選擇是臨床檢測(cè)的研究熱點(diǎn)問題，病理組織活檢是臨床診斷及評(píng)估疾病的金標(biāo)準(zhǔn)，但該方式對(duì)機(jī)體創(chuàng)傷較大，易使病情惡化。常規(guī)影像學(xué)檢查可能對(duì)機(jī)體產(chǎn)生放射性損傷，且無(wú)法確診腫瘤。免疫治療或基因靶向治療在惡性腫瘤的輔助治療過程中發(fā)揮了重要作用，但關(guān)于甲狀腺癌靶向治療的研究仍然不足，臨床尚缺乏甲狀腺癌可靠、有效的免疫或基因治療靶點(diǎn)。本研究探討了腫瘤細(xì)胞基因調(diào)控靶基因及相關(guān)蛋白信號(hào)通路的變化，以期為甲狀腺癌的發(fā)病機(jī)制及臨床診療提供理論參考。

BECN1是一種抑癌基因，是首次被發(fā)現(xiàn)參與自噬過程的基因，而適度的自噬過程能夠幫助細(xì)胞存活，過度自噬則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞自噬性凋亡。BECN1蛋白在細(xì)胞自噬過程中發(fā)揮重要作用，研究指出，肺癌、卵巢癌、腦癌等惡性腫瘤中BECN1呈明顯低表達(dá)，而在肝癌、胃癌中呈明顯高表達(dá)，由此可見，BECN1蛋白在不同腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮作用不同。本研究顯示，BECN1陽(yáng)性主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，甲狀腺癌組織中BECN1陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于癌旁組織，說明BECN1在甲狀腺癌中呈低表達(dá)，且與甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，BECN1表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞的自噬反應(yīng)降低，無(wú)法誘導(dǎo)自噬性腫瘤細(xì)胞死亡，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展；BECN1對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡具有促進(jìn)作用，能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)；BECN1還可通過影響血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和缺氧誘導(dǎo)因子-2α（hypoxiainducible factor-2α，HIF-2α）抑制血管內(nèi)皮的增殖、遷移及血管腫瘤新生，阻止腫瘤進(jìn)展。

SOX9能夠與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用而調(diào)控靶基因表達(dá)，其異常表達(dá)與多種惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。由于器官及組織的不同，SOX9發(fā)揮的作用亦不相同，既能作為致癌基因，又能作為抑癌基因，但SOX9在多數(shù)腫瘤中均會(huì)發(fā)揮致癌基因作用。研究指出，膀胱癌、大腸癌等惡性腫瘤中SOX9呈上調(diào)表達(dá)，發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移的作用；在肺癌、胃癌等組織中，SOX9表達(dá)水平明顯上調(diào)，其表達(dá)水平與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期等密切相關(guān)。本研究結(jié)果中，SOX9陽(yáng)性主要定位于細(xì)胞質(zhì)中。甲狀腺癌組織中SOX9陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁組織，說明SOX9能夠參與甲狀腺癌的發(fā)生過程，發(fā)揮致癌基因作用。SOX9在甲狀腺癌細(xì)胞中呈高表達(dá)并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲，因此推斷敲除SOX9能夠有效抑制甲狀腺癌細(xì)胞的增殖。

本研究進(jìn)一步探討了甲狀腺癌臨床特征與BECN1、SOX9表達(dá)的關(guān)系，結(jié)果顯示，Ⅰ～Ⅱ期、高分化、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的甲狀腺癌患者甲狀腺癌組織中BECN1陽(yáng)性表達(dá)率分別高于Ⅲ～Ⅳ期、中低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，SOX9陽(yáng)性表達(dá)率分別明顯低于Ⅲ～Ⅳ期、中低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說明BECN1、SOX9表達(dá)與甲狀腺癌患者的臨床分期、腫瘤分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)密切相關(guān)，隨著甲狀腺癌疾病的進(jìn)展，BECN1陽(yáng)性表達(dá)率逐漸降低，SOX9陽(yáng)性表達(dá)率逐漸升高，兩者均能夠參與甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程，并作為甲狀腺癌惡性程度評(píng)估的重要輔助指標(biāo)。

本研究還探討了BECN1、SOX9表達(dá)與甲狀腺癌患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示，BECN1陽(yáng)性表達(dá)患者的平均生存時(shí)間為（35.26±8.39）個(gè)月，明顯長(zhǎng)于陰性表達(dá)患者的（30.16±7.35）個(gè)月，SOX9陽(yáng)性表達(dá)患者的平均生存時(shí)間為（31.20±8.03）個(gè)月，明顯短于陰性表達(dá)患者的（35.74±6.99）個(gè)月。提示BECN1低表達(dá)、SOX9高表達(dá)的甲狀腺癌患者預(yù)后較差，BECN1陰性表達(dá)或SOX9陽(yáng)性表達(dá)患者大多進(jìn)展至疾病晚期，且存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度較低，因此預(yù)后更差。進(jìn)一步采用多因素Logistic回歸模型分析甲狀腺癌的預(yù)后影響因素，結(jié)果表明，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、BECN1表達(dá)及SOX9表達(dá)均是甲狀腺癌預(yù)后的影響因素，提示BECN1及SOX9表達(dá)與甲狀腺癌預(yù)后密切相關(guān)，在預(yù)測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后方面具有一定臨床價(jià)值。

綜上所述，甲狀腺癌組織中BECN1陽(yáng)性表達(dá)率較低，SOX9陽(yáng)性表達(dá)率較高，且二者表達(dá)均與臨床分期、腫瘤分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)有關(guān)；BECN1、SOX9表達(dá)與甲狀腺癌患者預(yù)后有關(guān)，能夠作為評(píng)估腫瘤惡性程度的重要指標(biāo)，預(yù)測(cè)患者預(yù)后。