◎劉胤璇，王劍飛，楊蕊銀，何 磊，白秀珍

（紅河州質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測中心，云南 蒙自 661199）

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytocytogenes，LM）是一種革蘭氏陽性桿狀細(xì)菌，簡稱單增李斯特菌。單增李斯特菌是引發(fā)食物中毒的重要病原菌[1-2]，菌株即使在低溫和酸性環(huán)境中也能夠生存[3]，且李斯特菌可在食物表面形成生物膜，導(dǎo)致食物交叉污染[4-5]。

測量不確定度是表征合理地賦予被測量值的分散性與測量結(jié)果相關(guān)聯(lián)的參數(shù)[6]，主要反映測量結(jié)果的可信程度，為測定結(jié)果的準(zhǔn)確性分析提供技術(shù)支撐[7]，因此評定測量不確定度是衡量測量結(jié)果質(zhì)量的重要指標(biāo)[8]。本研究在肉制品中定量添加單增李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)菌種，通過分析計(jì)算檢驗(yàn)過程的不確定度，建立平板計(jì)數(shù)法測定肉制品中單核增生李斯特氏菌的不確定度評定方法，在具體檢測中提高科學(xué)性和準(zhǔn)確性[7,9-10]。

1 材料和方法

1.1 樣品

以即食火腿腸為測試樣品，加入單增李斯特菌（編號ATCC19111，第2 代工作用菌種）菌懸液，用拍擊式均質(zhì)器拍擊2 min 制備成1∶10 的樣品勻液。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器

T500 電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠）、PREVI Color Gram 全自動(dòng)革蘭氏染色儀（法國梅里埃公司）、1 mL/10 mL 移液器（德國普蘭德公司）、BD115 培養(yǎng)箱（德國BINDER 公司）、HBM-400C 樣品均質(zhì)器（天津恒奧科技發(fā)展有限公司）及數(shù)顯溫濕度計(jì)（德國testo 公司）。

1.2.2 試劑

LB 肉湯、李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基、木糖、鼠李糖、TSA-YE 培養(yǎng)基、SIM 動(dòng)力培養(yǎng)基、過氧化氫酶、單增李斯特氏菌干制生化鑒定試劑盒。以上試劑生產(chǎn)企業(yè)均為北京路橋技術(shù)股份公司。

1.3 檢驗(yàn)方法

依據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)》（GB 4789.30—2016）[11]第二法進(jìn)行檢驗(yàn)。在相同實(shí)驗(yàn)條件下，兩名檢驗(yàn)人員分別對相同的10 份樣品進(jìn)行檢驗(yàn)，合計(jì)進(jìn)行20 次實(shí)驗(yàn)。參照《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）[6]、《食品微生物定量檢測的測量不確定度評估指南》（RB/T 151—2016）[12]對結(jié)果進(jìn)行不確定度分析評定。

2 結(jié)果與分析

2.1 建立數(shù)學(xué)模型

選擇菌落數(shù)在15～150 CFU 的條件下建立數(shù)學(xué)模型（1）。

式（1）中，T-樣品中單核增生李斯特氏菌菌落數(shù)，單位為CFU·mL-1（g）；A-某一稀釋度典型菌落的總數(shù)，單位為CFU；B-某一稀釋度鑒定為陽性的菌落數(shù)，單位為CFU；C-某一稀釋度用于鑒定試驗(yàn)的菌落數(shù)，單位為CFU；d-稀釋因子。

2.2 測量不確定度分析

依照“黑匣子”的方法，確定和分析單增李斯特氏菌不確定度的分量來源[7,9,12-16]，不確定度分量來源見圖1。

圖1 不確定度分量來源圖

2.3 不確定度分量的計(jì)算

2.3.1 稱量樣品引入的相對不確定度urel（Ws）

稱量樣品引入的不確定度來源：①天平校準(zhǔn)的不確定度。T500 電子天平（d=0.1 g） 檢定證書最大允許誤差為±0.5 g，按矩形分布，。②天平可讀性引入的不確定度。天平最小有效數(shù)字為0.1 g，按矩形分布，。③天平稱量重復(fù)性引入的不確定度。電子天平檢定證書給出的重復(fù)性誤差為0，故u（WR3）=0。

2.3.2 制備樣品均液引入的相對不確定度urel（Vs）

制備樣品均液使用量筒量取225 mL 稀釋液，引入的不確定度來源：①溫度引起變化的不確定度u（Td）。實(shí)驗(yàn)室溫度為21.5 ℃，與20 ℃相差1.5 ℃，水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃[7]，假設(shè)矩形分布，則。②量筒容量允差引入的不確定度。根據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）[17]規(guī)定，250 mL 量筒的容量允差分別為±2.0 mL，假設(shè)矩形分布，u（V1-1）=1.154 7 mL。③量筒分辨率的不確定度，225 mL 量筒分辨率為5 mL，假設(shè)三角分布，u（V1-2）=1.020 6 mL。

2.3.3 樣品10 倍稀釋引入的相對不確定度urel（X1）

樣品稀釋至1∶100，使用1 mL 移液器移取1 mL的1∶10 樣品均液至9 mL 稀釋液（使用10 mL 移液器移?。氲牟淮_定度來源：①溫度引起體積變化的不確定度u（Td2）。實(shí)驗(yàn)室溫度21.5 ℃：

②移液器允差的不確定度u(VR2)。根據(jù)《移液器檢定規(guī)程》（JJG 646—2006）[18]規(guī)定，1 mL、10 mL 移液器容量允差分別為1.0%、0.6%。假設(shè)三角分布，1 mL移液器移取1 mL不確定度u(VR2-1mL)=0.004 1 mL，10 mL移液器移取9 mL 不確定度u(VR2-9mL)=0.022 0 mL。

綜合上述兩個(gè)不確定度，移液器引入的合成不確定度為：

相對不確定度：urel(V2-1mL)=0.004 1÷1=0.004 1，u(V2-9mL)=0.022 1÷9=0.002 5。因此，10 倍稀釋引入的相對不確定度urel(X1)=0.004 8。

2.3.4 樣品加樣體積引入的相對不確定度urel(X2)

1∶10、1∶100 兩個(gè)稀釋度分別用1 mL 移液器移取0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL 三個(gè)平板，假設(shè)三角分布，相對不確定度分別為：0.004 1、0.004 1、0.004 1，合成單次不確定度為

兩次加樣引入的相對不確定度

2.3.5 重復(fù)試驗(yàn)引入的相對不確定度urel(N)

由于重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的數(shù)值偏離比較大，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)對數(shù)的方法對其結(jié)果的數(shù)值進(jìn)行不確定度計(jì)算，檢驗(yàn)結(jié)果見表1、表2。重復(fù)試驗(yàn)引入的相對不確定度來源：

表1 重復(fù)檢測單增李斯特氏菌含量表（單位：CFU·g-1）

表2 重復(fù)檢測單增李斯特氏菌含量對數(shù)結(jié)果表

①重復(fù)檢驗(yàn)引入的不確定度，

②不同人員實(shí)驗(yàn)組間變化引入的相對不確定度：

2.4 相對合成不確定度uc,rel

比較各不確定度分量，分析其產(chǎn)生的原因，計(jì)算相對合成不確定度

2.5 擴(kuò)展不確定的u95rel

實(shí)驗(yàn)中，取包含因子k=2，置信概率為95%，則樣品中單增李斯特菌含量對數(shù)的擴(kuò)展不確定度u95rel=0.115 0。本次實(shí)驗(yàn)測得單增李斯特菌含量對數(shù)均值為3.868 4，結(jié)果報(bào)告為103.8684±0.1150，即單增李斯特菌含量為5 700～9 600 CFU·g-1。

3 結(jié)論

食品安全問題是當(dāng)今社會普遍關(guān)注的焦點(diǎn)，如何快速分析食品安全隱患及提高檢測準(zhǔn)確度是解決食品安全問題的關(guān)鍵。測量不確定度是評價(jià)測量值可信度的重要參數(shù)。從本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，樣品稱量、稀釋、加樣、重復(fù)實(shí)驗(yàn)等都會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確度產(chǎn)生影響，其中占主要部分的是重復(fù)試驗(yàn)引入的不確定度分量?？紤]到不同菌種均勻性、設(shè)備、培養(yǎng)基等對結(jié)果不確定度均會產(chǎn)生影響，建議對每種目標(biāo)菌均進(jìn)行不確定度評定；當(dāng)更換設(shè)備、培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)重新對不確定度進(jìn)行評定[9]。