王 煦,張 娜,王 婷

王煦,張娜,王婷,浙江省臺州恩澤醫(yī)療中心(集團(tuán))路橋醫(yī)院藥劑科 浙江省臺州市 318050

0 引言

胃潰瘍主要是由于胃中的保護(hù)性因子和破壞性因子失衡引起的胃黏膜受損而造成的胃內(nèi)壁的潰瘍,是常見的上消化道疾病[1,2].長期使用非甾體抗炎藥(nonsteroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs)是導(dǎo)致胃潰瘍的主要原因之一[3,4].吲哚美辛(indomethacin,IND)是一種廣泛使用的NSAIDs,但長期服用該類藥物能導(dǎo)致胃粘膜完整性喪失相關(guān)的胃損傷,其機(jī)制包含產(chǎn)生氧化應(yīng)激、抑制粘液產(chǎn)生和誘導(dǎo)胃黏膜細(xì)胞凋亡等[5].雖然,質(zhì)子泵抑制劑(proton-pump inhibitors,PPI)和2型組胺(type 2 histamine,H2)受體拮抗劑已被用于防治NSAIDs誘導(dǎo)的胃潰瘍,但是長期使用PPI或H2受體拮抗劑依然具有諸多不良反應(yīng)[6].天然藥物因具有靶點(diǎn)多和毒副作用低的特點(diǎn),尤其是從中篩選具有抗氧化和修復(fù)胃黏膜的天然藥物分子可能會(huì)為發(fā)現(xiàn)新的有效的抗NSAIDs誘導(dǎo)的胃潰瘍的藥物.

木犀草素(luteolin,Lut)是一種廣泛存在于水果、蔬菜和草藥中具有抗腫瘤、抗肝毒性、抗過敏、抗炎、抗氧化和加快傷口愈合等多種藥理活性的生物類黃酮[7].根據(jù)Lut的藥理活性推測其可能具有抗胃潰瘍的作用,而其對IND誘導(dǎo)的胃潰瘍的具體作用尚不清晰.因此,本研究采用IND所致胃潰瘍大鼠模型來探討Lut對IND誘導(dǎo)的胃潰瘍的作用并分析其機(jī)制,以期為Lut是否可作為治療IND誘導(dǎo)的胃潰瘍的替代藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與試劑 40只6-7周齡無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級雄性維斯塔爾(Wistar)大鼠(體重190-220 g)購自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(生產(chǎn)許可證號:SCXK(浙)2019-0001).IND片(批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字H14 020549;產(chǎn)品編號:014202046946)購于臨汾奇林藥業(yè)有限公司;Lut(純度>98%;貨號:49968)購自美國Sigma公司;羧甲纖維素(carboxymethylcellulose,CMC;貨號:A50147)購自生工生物工程(上海)股份有限公司;ApopTag過氧化物酶原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(S7100)購自美國Millipore Chemicon公司;銅鋅/錳-超氧化物歧化酶(copper zinc/manganese-superoxide dismutase,CuZn/Mn-SOD)活性檢測試劑盒(貨號:S0103)、還原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)和氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione disulfide,GSSG)檢測試劑盒(貨號:S0053)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)檢測試劑盒(貨號:S0131S)和二辛可寧酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白濃度測定試劑盒(貨號:P0012S)購自上海碧云天生物科技有限公司.

1.2 動(dòng)物分組與處理 將所有大鼠飼養(yǎng)在SPF級動(dòng)物房的動(dòng)物飼養(yǎng)籠里,給予普通顆粒飼料飼養(yǎng),所有大鼠自由飲水飲食.經(jīng)過適應(yīng)飼養(yǎng)3 d后,將所有大鼠分為5組,即對照組、模型組、低中高劑量Lut組,每組納入8只大鼠.實(shí)驗(yàn)前,將IND片磨成粉末,然后用CMC制成20 mg/mL糊狀物.按照文獻(xiàn)方法[8],模型組大鼠采用IND(40 mg/kg)的連續(xù)14天灌胃給藥誘發(fā)胃潰瘍;低中高劑量Lut組大鼠均在IND灌胃2 h后,分別用1 mg/kg、10 mg/kg和100 mg/kg的Lut灌胃給藥14 d(Lut的劑量參考文獻(xiàn)[9]);對照組和模型組給予灌胃等體積CMC.

1.3 胃潰瘍指數(shù)評估 給藥方案結(jié)束后,用10%水合氯醛(0.4 mL/100g)腹腔麻醉大鼠,打開腹腔,收集胃.用解剖剪沿胃大彎將胃剪開,并用PBS沖洗干凈,并拍照.按照Guth法[10]統(tǒng)計(jì)各組大鼠的胃潰瘍指數(shù).

1.4 胃粘膜組織SOD、GSH、MDA水平測定 用RIPA對胃粘膜組織勻漿后,用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測勻漿液中蛋白濃度.取勻漿液分別按照試劑盒說明書步驟測定大鼠勻漿液中SOD、GSH和MDA水平,然后用測定的勻漿液中蛋白濃度將勻漿液中SOD、GSH和MDA水平標(biāo)準(zhǔn)化為mg蛋白中SOD、GSH和MDA水平.

1.5 HE染色 將每只大鼠胃粘膜組織固定在10%福爾馬林中,并按常規(guī)法包埋在石蠟中.切下5 μM厚的切片,經(jīng)常規(guī)脫蠟至水后,并用蘇木精-伊紅染色法 (hematoxylineosin,HE)染色.隨后用光學(xué)顯微鏡對胃粘膜的HE染色的連續(xù)切片進(jìn)行胃粘膜病變評分.評分標(biāo)準(zhǔn):按照充血、出血和上皮細(xì)胞變性壞死的面積(0

1.6 凋亡的測定 取石蠟包埋的胃粘膜切片(5 μM厚),經(jīng)常規(guī)脫蠟至水后,根據(jù)制造商的說明書步驟,使用ApopTag過氧化物酶原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒對樣品切片進(jìn)行染色.在光學(xué)顯微鏡下觀察凋亡陽性染色百分比.每只大鼠任選10張胃粘膜切片,每張切片至少任選5個(gè)視野,取平均值作為每只大鼠胃粘膜凋亡指數(shù).

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD),各組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析,各組均數(shù)兩兩比較采用Bonferroni法.以P值<0.05時(shí),認(rèn)為差異具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 各組胃黏膜的大體形態(tài)與胃潰瘍指數(shù)的比較 宏觀觀察圖像(圖1)顯示,對照組胃粘膜形態(tài)正常;模型組胃粘膜顯示大片充血紅斑和條索狀或斑駁狀出血斑;低劑量Lut組胃粘膜明顯充血和條索狀出血,但相對模型組有所減輕;中劑量Lut組胃粘膜顯示少量紅腫和散在出血情況;高劑量Lut組胃粘膜未見明顯水腫,但存在少量出血點(diǎn).胃潰瘍指數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果(表1)顯示,與對照組比較,模型組胃潰瘍指數(shù)明顯增加;與模型組比較,Lut能劑量依賴性地降低IND誘導(dǎo)的胃潰瘍指數(shù).綜述結(jié)果顯示,Lut給藥能改善IND所致的胃潰瘍的外觀和指數(shù).

圖1 各組大鼠的胃黏膜代表性的大體肉眼外觀形態(tài). Lut:木犀草素.

表1 各組胃潰瘍指數(shù)的比較(mean±SD,n=8)

2.2 各組胃黏膜組織病理形態(tài)學(xué)與胃粘膜病變總積分比較 HE染色結(jié)果(圖2)顯示,對照組胃粘膜結(jié)構(gòu)完整正常和腺體排列整齊;模型組表層上皮脫落、胃粘膜腺上皮的嚴(yán)重破壞(包括糜爛、粘膜下水腫、炎性細(xì)胞浸潤、組織間嚴(yán)重充血和局灶性出血)、粘膜腺體結(jié)構(gòu)分辨不清和排列不整齊甚至喪失;低劑量Lut組胃粘膜表層上皮呈片狀脫落,組織間有水腫和出血情況,粘膜腺上皮部分破壞、腺體結(jié)構(gòu)邊界模糊和排列不整齊,但上述情況較模型組有所減輕;中劑量Lut組胃粘膜表層上皮和腺上皮部分破壞,組織間水腫和出血情況明顯減少,粘膜腺體結(jié)構(gòu)邊界趨向清晰且排列趨向整齊;高劑量Lut組胃粘膜腺上皮基本完整,但組織間有少量出血點(diǎn),粘膜腺體結(jié)構(gòu)完整且排列整齊.胃粘膜病變總積分統(tǒng)計(jì)結(jié)果(表2)顯示,與對照組比較,模型組胃粘膜病變總積分明顯增加;與模型組比較,Lut能劑量依賴性地降低IND誘導(dǎo)的胃粘膜病變總積分.以上結(jié)果顯示,Lut給藥能改善IND所致的胃黏膜組織的病理形態(tài).

表2 各組胃粘膜病變總積分的比較(mean±SD,n=8)

圖2 各組胃黏膜組織代表性的HE染色圖像.Lut:木犀草素.

2.3 各組胃黏膜組織凋亡面積比較 胃黏膜凋亡染色結(jié)果(圖3、表3)顯示,對照組胃黏膜存在極少量散在的凋亡陽性染色(棕黃),與對照組比較,模型組胃黏膜凋亡陽性染色面積明顯增加,且多數(shù)富集在腺體;與模型組比較,Lut組胃黏膜凋亡陽性染色面積明顯減少,其中低劑量Lut組胃黏膜凋亡陽性染色多富集于腺體、中和高劑量Lut組多富集于表層上皮,且高劑量組效果最優(yōu).

表3 各組胃粘膜凋亡陽性染色面積的比較(%,mean±SD,n=8)

圖3 各組胃粘膜代表性的ApopTag過氧化物酶原位細(xì)胞凋亡檢測盒染色圖像. Lut:木犀草素.

2.4 各組胃黏膜組織氧化應(yīng)激水平比較 ELISA結(jié)果(表4)顯示,與對照組比較,模型組胃黏膜組織中SOD和GSH水平明顯降低而MDA水平明顯增高;與模型組比較,Lut以劑量依賴的方式增加胃黏膜組織中SOD和GSH的水平并降低胃粘膜中MDA水平.

表4 各組胃粘膜組織中SOD、GSH和MDA水平的比較(mean±SD,n=8)

3 討論

長期服用NSAIDs導(dǎo)致的胃潰瘍是臨床上常見的上消化道疾病之一,其主要的病理形態(tài)學(xué)特征為胃黏膜損傷[1,2].IND是一種常用的NSAIDs,因此本研究選用IND誘導(dǎo)的大鼠胃潰瘍模型來探討Lut的抗NSAIDs誘發(fā)的胃潰瘍的作用.在動(dòng)物模型中,胃黏膜損傷指數(shù)和組織形態(tài)病理學(xué)是觀察胃黏膜損傷程度的最直觀指標(biāo)[11].本研究顯示,Lut能劑量依賴性地降低胃黏膜損傷指數(shù)和改善IND誘導(dǎo)的胃黏膜病理形態(tài)改變,表明Lut能減輕IND引起的大鼠胃潰瘍,其對胃粘膜發(fā)揮保護(hù)作用.

另外,胃粘膜上皮細(xì)胞分泌的黏液能防止胃酸和胃蛋白酶對胃黏膜的損害;而胃粘膜上皮細(xì)胞受損則會(huì)使得黏液分泌降低,導(dǎo)致胃酸和胃蛋白酶對胃黏膜的損害加重[12].因此,胃粘膜上皮細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致胃粘膜損傷的重要機(jī)制,也是胃潰瘍形成過程中的重要環(huán)節(jié)之一.已有研究表明,抑制胃粘膜上皮細(xì)胞的凋亡能減輕胃粘膜損傷,并抑制胃潰瘍的進(jìn)展[13].本研究表明,Lut可以劑量依賴性地降低胃粘膜細(xì)胞的凋亡,表明Lut在IND誘導(dǎo)的大鼠胃潰瘍模型中對胃粘膜上皮細(xì)胞具有保護(hù)作用.

氧化應(yīng)激在各種因素導(dǎo)致的胃潰瘍的發(fā)病和進(jìn)展中均起著重大作用.氧自由基是胃潰瘍的關(guān)鍵致病因子之一,氧自由基過高不僅不利于胃粘膜創(chuàng)面的愈合,其還能加劇潰瘍創(chuàng)面的擴(kuò)大[14].胃潰瘍的機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)體現(xiàn)在促氧化系統(tǒng)的氧自由基和MDA水平急劇升高以及抑氧化系統(tǒng)的SOD和GSH水平急劇降低[14,15].SOD是機(jī)體內(nèi)清除氧自由基關(guān)鍵因素,在胃潰瘍疾病中發(fā)揮胃粘膜保護(hù)作用[14-16].GSH可維持機(jī)體內(nèi)氧化還原狀態(tài),保護(hù)機(jī)體組織和細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷,其同樣也是重要的氧自由基清除的主要分子之一[15,16].MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物,在胃潰瘍疾病中其含量可反應(yīng)胃粘膜受氧化損傷的程度[14,15].本研究顯示,Lut組的胃粘膜組織中SOD和GSH水平明顯提高而MDA水平明顯降低,說明Lut可能通過清除IND誘導(dǎo)的大鼠胃粘膜組織的氧自由基,從而抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)對胃粘膜的損傷,達(dá)到對胃粘膜的保護(hù)作用.

4 結(jié)論

綜上所述,Lut能改善IND誘導(dǎo)的大鼠胃潰瘍,且其機(jī)制可能與其抑制胃粘膜上皮細(xì)胞凋亡以及抗氧化應(yīng)激作用相關(guān).另外,本研究還提示,Lut可能是潛在的用于治療NSAIDs誘導(dǎo)的胃潰瘍的替代藥物.

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

吲哚美辛(indomethacin,IND)引起的胃潰瘍的機(jī)制包含氧化應(yīng)激、抑制粘液生成和誘導(dǎo)胃黏膜細(xì)胞凋亡等.

實(shí)驗(yàn)動(dòng)機(jī)

木犀草素(luteolin,Lut)具有抗炎、抗氧化和加快傷口愈合等多種藥理活性,提示其可能具有修復(fù)胃黏膜損傷的作用,而其在胃潰瘍中的作用尚不清楚.

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

探索Lut對IND引起的胃潰瘍是否具有防護(hù)作用,并分析其機(jī)制.

實(shí)驗(yàn)方法

按照文獻(xiàn)方法,通過灌胃IND構(gòu)建大鼠胃潰瘍模型,并給予Lut治療.收集胃,通過肉眼觀察胃大體形態(tài),用HE染色法觀察胃組織病理學(xué)形態(tài),通過試劑盒法檢測胃組織中氧化應(yīng)激水平和胃黏膜細(xì)胞凋亡水平.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Lut能降低胃潰瘍指數(shù),改善IND所致的胃黏膜組織的病理形態(tài),降低胃黏膜凋亡水平和氧化應(yīng)激水平.

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

Lut具有改善IND所致胃潰瘍的作用,這一作用可能與其抑制胃粘膜凋亡和氧化應(yīng)激相關(guān).

展望前景

Lut是潛在的用于IND誘導(dǎo)的胃潰瘍的防護(hù)劑或治療劑.