徐萬蘇,柯 飛,許 怡,鄭 藝

徐萬蘇,衢州市人民醫(yī)院腫瘤放療科 浙江省衢州市 324000

柯飛,衢州市人民醫(yī)院病理科 浙江省衢州市 324000

許怡,鄭藝,衢州市人民醫(yī)院消毒供應(yīng)中心 浙江省衢州市 324000

0 引言

胃癌是全球常見癌癥,死亡率高,靶向治療是改善晚期和轉(zhuǎn)移性胃癌治療效果的重要方法,開發(fā)新型靶向藥物,可個(gè)性化治療并改善胃癌患者預(yù)后[1-3].研究表明長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA),微小RNA(microRNA,miRNA)參與胃癌的發(fā)生發(fā)展過程,提示其在胃癌發(fā)生中的作用可用于胃癌的診斷、治療和預(yù)后[4,5].研究報(bào)道敲低長基因間非編碼RNA 00963(long intergene non-coding RNA 00963,LINC00963)顯著抑制了黑色素瘤細(xì)胞的增殖,遷移和侵襲[6].LINC00963通過miR-378g/殼多糖酶3樣蛋白1(chitosan enzyme 3-like protein 1,CHI3L1)軸促進(jìn)卵巢癌的增殖,遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition,EMT)[7].LINC00963充當(dāng)miR-625的分子海綿上調(diào)高遷移率蛋白家族A1(high mobility protein family A1,HMGA1),從而促進(jìn)乳腺癌的進(jìn)展[8].然而LINC00963對(duì)胃癌細(xì)胞增殖,遷移侵襲的影響及機(jī)制尚不清楚.

研究發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞中miR-146a-5p下調(diào)表達(dá),且胃癌組織低表達(dá)的miR-146-5p與靜脈血管侵犯侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)[9,10].且有研究發(fā)現(xiàn)高腹膜轉(zhuǎn)移潛能的胃癌細(xì)胞中miR-146a-5p也下調(diào)表達(dá)[11].說明miR-146a-5p可能參與胃癌進(jìn)展過程,但miR-146a-5p對(duì)胃癌細(xì)胞增殖,遷移侵襲的影響尚不清楚.本實(shí)驗(yàn)通過在線軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)LINC00963與miR-146a-5p,miR-146a-5p與核因子類紅細(xì)胞2相關(guān)因子1(nuclear factor erythroid 2-like 1,NFE2L1)均有結(jié)合位點(diǎn).NFE2L1是CNC-bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族的成員,研究發(fā)現(xiàn)其與癌癥發(fā)展以及變性和代謝性疾病的發(fā)病機(jī)理有關(guān)[12].研究報(bào)道線粒體呼吸缺陷通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transduction and transcriptional activator 3,STAT3)/NFE2L1/突觸融合蛋白12(synaptic fusion protein 12,STX12)軸增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的侵襲性[13].lncRNA SLCO4A1反義RNA1(SLCO4A1 antisense RNA1,SLCO4A1-AS1)通過調(diào)節(jié)miR-4701-5p/NFE2L1軸激活WNT途徑,促進(jìn)肺腺癌的細(xì)胞生長并誘導(dǎo)其耐藥性[14].而NFE2L1對(duì)胃癌細(xì)胞的影響尚未可知.本實(shí)驗(yàn)旨在研究LINC00963對(duì)胃癌細(xì)胞增殖,遷移侵襲的影響及機(jī)制是否與miR-146a-5p、NFE2L1有關(guān).

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料:選取本院病理科存檔且已確診為胃癌的組織標(biāo)本42例,并選取其相應(yīng)的癌旁組織,所有患者均知情且同意.納入標(biāo)準(zhǔn):經(jīng)病理證實(shí)為胃癌患者;術(shù)前未接受抗腫瘤治療者;排除標(biāo)準(zhǔn):術(shù)前接受放療或化療等抗腫瘤治療者;患有其他臟器重大疾病者.男性27例,女性15例,年齡在40-73歲之間,中位年齡63歲.淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移:轉(zhuǎn)移18例,未轉(zhuǎn)移24例;TNM分期:Ⅰ期15例,Ⅱ期13例,Ⅲ期14例.

1.1.2 細(xì)胞與主要試劑:永生化的人胃粘膜上皮細(xì)胞系GES1,胃癌細(xì)胞系SNU-1、AGS、HS-746T購自上海冠導(dǎo)生物工程有限公司.RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco);Trizol試劑、SYBR Premix ExTaqTM試劑盒(日本Takara);總蛋白提取試劑盒(美國Invent);NFE2L1、細(xì)胞周期素D1(CyclinD1)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP2)、MMP9抗體(英國biorbyt公司);細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(Cell Counting Kit 8,CCK-8)(日本同仁研究所);雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(美國AAT Bioquest);Transwell小室、Matrigel(美國BD).

1.1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與分組:GES1及SNU-1、AGS、HS-746T細(xì)胞均用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng),取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞SNU-1,將LINC00963、NFE2L1的干擾表達(dá)載體及其陰性對(duì)照,miR-146a-5p的模擬物及陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染至SNU-1細(xì)胞中,記為si-LINC00963組、si-NFE2L1組、si-NC組、miR-146a-5p組、miR-NC組,正常培養(yǎng)的SNU-1細(xì)胞作為NC組;將LINC00963干擾表達(dá)載體分別與NFE2L1的過表達(dá)載體及陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染至SNU-1細(xì)胞中,記為si-LINC00963+pcDNA-NC組、si-LINC00963+pcDNANFE2L1組.

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)LINC00963、miR-146a-5p和NFE2L1 mRNA的表達(dá)水平:取適量胃癌組織、癌旁組織,研磨粉碎后加入Trizol試劑提取總RNA;收集GES1及SNU-1、AGS、HS-746T細(xì)胞及各組SNU-1細(xì)胞,直接加入Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA;合成互補(bǔ)DNA(complementary DNA,cDNA),用SYBR Premix ExTaqTM試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR,以β-actin和U6為內(nèi)參,用2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量.

1.2.2 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá):提取細(xì)胞總蛋白,定量后取適量變性蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜,用5%脫脂奶粉封閉1 h,加入一抗(1:800)4 ℃孵育過夜,加入二抗(1:1200)室溫孵育2 h,用ECL發(fā)光液顯影,成像后檢測(cè)蛋白條帶灰度值,蛋白相對(duì)表達(dá)水平=目的條帶灰度值/β-actin條帶灰度值.

1.2.3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn):Starbase預(yù)測(cè)到LINC00963與miR-146a-5p、miR-146a-5p與NFE2L1-3’非翻譯區(qū)(untranslated regions,UTR)存在結(jié)合位點(diǎn).根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果構(gòu)建LINC00963及NFE2L1-3’UTR的野生型和突變型熒光素酶載體,將其分別與miR-NC和miR-146a-5p共轉(zhuǎn)染至SNU-1細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染48 h收集細(xì)胞按照說明書檢測(cè)熒光素酶活性.

將pcDNA-NC、pcDNA-LINC00963、si-NC、si-LINC00963轉(zhuǎn)染至SNU-1細(xì)胞中,按1.4中方法檢測(cè)miR-146a-5p表達(dá)水平.將miR-NC、miR-146a-5p、antimiR-NC、anti-miR-146a-5p轉(zhuǎn)染至SNU-1細(xì)胞中;miR-146a-5p分別與pcDNA-NC、pcDNA-LINC00963共轉(zhuǎn)染至SNU-1細(xì)胞中,anti-miR-146a-5p分別與si-NC、si-LINC00963共轉(zhuǎn)染至SNU-1細(xì)胞中,按1.5中方法檢測(cè)NFE2L1蛋白表達(dá)水平.

1.2.4 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖活性:各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后每孔加入10 μL的CCK-8試劑,孵育2 h后用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光度值(absorbance,A),以A值代表細(xì)胞活性.

1.2.5 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲:細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn):將細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基重懸,取100 μL細(xì)胞懸浮液添加到Transwell上室,下室加600 μL含血清的培養(yǎng)基,培養(yǎng)48 h,用棉簽除去膜頂表面上未遷移的細(xì)胞,膜下表面的細(xì)胞用多聚甲醛固定,清洗后用結(jié)晶紫染色,清洗、干燥;倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞.細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn):按照1:8比例用無血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel,包被Transwell小室底部膜的上室面,放入37 ℃培養(yǎng)箱孵育4 h使Matrigel聚合成膠備用.其余步驟和遷移實(shí)驗(yàn)一致.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,兩組比較行t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn).以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 在胃癌患者癌組織中LINC00963表達(dá)上調(diào) 胃癌組織中LINC00963表達(dá)水平(3.76±0.24vs1.00±0.13,t=65.532,P<0.05)、NFE2L1 mRNA表達(dá)水平(2.16±0.25vs1.00±0.12,t=27.109,P<0.05)、NFE2L1蛋白表達(dá)水平(0.87±0.09vs0.42±0.05,t=28.326,P<0.05)高于癌旁組織;胃癌組織中miR-146a-5p表達(dá)水平(0.37±0.07vs1.00±0.18,t=21.140,P<0.05)低于癌旁組織.見圖1.

圖1 Western Blot檢測(cè)NFE2L1蛋白表達(dá). NFE2L1:核因子類紅細(xì)胞2相關(guān)因子1.

2.2 在胃癌細(xì)胞系中LINC00963表達(dá)上調(diào),miR-146a-5p表達(dá)下調(diào),NFE2L1上調(diào) 與GES1細(xì)胞比較,胃癌細(xì)胞系SNU-1、AGS、HS-746T中LINC00963表達(dá)水平升高,miR-146a-5p表達(dá)水平降低,NFE2L1 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)(圖2,表1).

表1 在胃癌細(xì)胞系中LINC00963、miR-146a-5p和NFE2L1的表達(dá)(mean±SD,n=9)

2.3 LINC00963通過miR-146a-5p調(diào)控NFE2L1的表達(dá) Starbase預(yù)測(cè)顯示,LINC00963與miR-146a-5p存在結(jié)合位點(diǎn)(圖3A),NFE2L1與miR-146a-5p存在結(jié)合位點(diǎn)(圖2B);雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,miR-146a-5p與LINC00963、NFE2L1的野生型報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的SNU-1細(xì)胞熒光素酶活性降低,而與LINC00963、NFE2L1的突變型報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的SNU-1細(xì)胞熒光素酶活性無顯著變化(表2,表3);過表達(dá)LINC00963后miR-146a-5p表達(dá)水平降低;抑制LINC00963表達(dá)后miR-146a-5p表達(dá)水平升高(P<0.05)(表4);過表達(dá)miR-146a-5p后NFE2L1蛋白表達(dá)水平降低;抑制miR-146a-5p表達(dá)后NFE2L1蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)(圖3C);同時(shí)過表達(dá)miR-146a-5p和LINC00963后NFE2L1蛋白表達(dá)水平升高;而同時(shí)抑制miR-146a-5p和LINC00963表達(dá)后NFE2L1蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)(圖3D).

表2 miR-NC或miR-146a-5p與LINC00963野生型及突變型報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染SNU-1細(xì)胞后相對(duì)雙熒光素酶活性檢測(cè)(mean±SD,n=9)

圖2 Western Blot檢測(cè)NFE2L1蛋白表達(dá).NFE2L1:核因子類紅細(xì)胞2相關(guān)因子1;β-actin:β肌動(dòng)蛋白.

圖3 LINC00963、miR-146a-5p、NFE2L1三者之間的靶向調(diào)控關(guān)系.A:Starbase對(duì)miR-146a-5p和LINC00963結(jié)合進(jìn)行預(yù)測(cè)示意圖;B:Starbase對(duì)NFE2L1和miR-146a-5p結(jié)合進(jìn)行預(yù)測(cè)示意圖;C:Western Blot檢測(cè)NFE2L1蛋白表達(dá);D:LINC00963通過miR-146a-5p調(diào)控NFE2L1的表達(dá).LINC00963:長基因間非編碼RNA 00963;miR-146a-5p:微小RNA-146a-5p;NFE2L1:核因子類紅細(xì)胞2相關(guān)因子1.

表3 miR-NC或miR-146a-5p與NFE2L1-3’UTR野生型及突變型報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染SNU-1細(xì)胞后相對(duì)雙熒光素酶活性檢測(cè)(mean±SD,n=9)

表4 qRT-PCR檢測(cè)miR-146a-5p的表達(dá)(mean±SD,n=9)

2.4 低表達(dá)LINC00963抑制胃癌細(xì)胞SNU-1增殖,遷移和侵襲 與si-NC組比較,si-LINC00963組胃癌細(xì)胞SNU-1中LINC00963表達(dá)水平降低,CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)水平降低,細(xì)胞活性降低,細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量減少(P<0.05)(圖4,表5).

圖4 低表達(dá)LINC00963抑制胃癌細(xì)胞SNU-1增殖,遷移和侵襲.A:Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲;B:Western Blot檢測(cè)CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達(dá).LINC00963:長基因間非編碼RNA 00963;CyclinD1:細(xì)胞周期素D1;MMP2:基質(zhì)金屬蛋白酶2;MMP9:基質(zhì)金屬蛋白酶9.

表5 低表達(dá)LINC00963抑制胃癌細(xì)胞SNU-1增殖(mean±SD,n=9)

2.5 高表達(dá)miR-146a-5p抑制胃癌細(xì)胞SNU-1增殖,遷移和侵襲 與miR-NC組比較,miR-146a-5p組細(xì)胞活性及相關(guān)蛋白CyclinD1、MMP2、MMP9的表達(dá)水平降低,細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量減少(P<0.05)(圖5,表6).

圖5 高表達(dá)miR-146a-5p抑制胃癌細(xì)胞SNU-1增殖,遷移和侵襲.A:Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲;B:Western Blot檢測(cè)CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達(dá).miR-146a-5p:微小RNA-146a-5p;CyclinD1:細(xì)胞周期素D1;MMP2:基質(zhì)金屬蛋白酶2;MMP9:基質(zhì)金屬蛋白酶9.

表6 高表達(dá)miR-146a-5p抑制胃癌細(xì)胞SNU-1增殖(mean±SD,n=9)

2.6 低表達(dá)NFE2L1抑制胃癌細(xì)胞SNU-1增殖,遷移和侵襲 與si-NC組比較,si-NFE2L1組NFE2L1表達(dá)按水平降低,CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)水平降低,細(xì)胞活性降低,細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量減少(P<0.05)(圖6,表7).

圖6 低表達(dá)NFE2L1抑制胃癌細(xì)胞SNU-1增殖,遷移和侵襲.A:Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲;B:Western Blot檢測(cè)NFE2L1、CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達(dá).NFE2L1:核因子類紅細(xì)胞2相關(guān)因子1;CyclinD1:細(xì)胞周期素D1;MMP2:基質(zhì)金屬蛋白酶2;MMP9:基質(zhì)金屬蛋白酶9.

表7 低表達(dá)NFE2L1抑制胃癌細(xì)胞SNU-1增殖(mean±SD,n=9)

2.7 高表達(dá)NFE2L1可以逆轉(zhuǎn)LINC00963低表達(dá)對(duì)SNU-1增殖,遷移和侵襲的抑制作用 與si-LINC00963+pcDNANC組比較,si-LINC00963+pcDNA-NFE2L1組NFE2L1表達(dá)水平升高,細(xì)胞活性以及增殖、遷移相關(guān)蛋白CyclinD1、MMP2、MMP9的表達(dá)水平升高,且遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)量增加(P<0.05)(圖7,表8).

圖7 高表達(dá)NFE2L1可以逆轉(zhuǎn)LINC00963低表達(dá)對(duì)SNU-1增殖,遷移和侵襲的抑制作用.A:Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲;B:Western Blot檢測(cè)NFE2L1、CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達(dá).NFE2L1:核因子類紅細(xì)胞2相關(guān)因子1;LINC00963:長基因間非編碼RNA 00963;CyclinD1:細(xì)胞周期素D1;MMP2:基質(zhì)金屬蛋白酶2;MMP9:基質(zhì)金屬蛋白酶9.

表8 高表達(dá)NFE2L1可以逆轉(zhuǎn)LINC00963低表達(dá)對(duì)SNU-1增殖的影響(mean±SD,n=9)

3 討論

胃癌是全球高發(fā)腫瘤,研究胃癌的發(fā)生及進(jìn)展機(jī)制,開發(fā)相應(yīng)的靶向藥物應(yīng)用于臨床是目前靶向治療的關(guān)鍵[15].研究報(bào)道LINC00963在骨肉瘤樣品和細(xì)胞中高表達(dá),LINC00963通過抑制miR-204-3p/纖維連接蛋白1(fibronectin 1,FN1)軸促進(jìn)骨肉瘤的增殖和侵襲[16].LINC00963通過調(diào)節(jié)miR-506/支鏈氨基轉(zhuǎn)移酶1(branched-chain amino acid transaminase 1,BCAT1)軸促進(jìn)了神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖,細(xì)胞周期進(jìn)程,遷移和體外侵襲以及體內(nèi)腫瘤發(fā)生[17].LINC00963通過miR-124-3p/卷曲蛋白4(frizzled-4,FZD4)途徑促進(jìn)結(jié)直腸癌的增殖和遷移[18].以上研究表明LINC00963在多種腫瘤中起促癌作用.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,LINC00963在胃癌組織和細(xì)胞系中高表達(dá),提示LINC00963可能在胃癌中也起促癌作用.抑制LINC00963表達(dá)后,細(xì)胞活性降低,遷移和侵襲數(shù)量減少;說明抑制LINC00963表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞SNU-1增殖、遷移和侵襲.

研究表明miR-146a-5p可用作非侵入性生物標(biāo)志物和多種癌癥的靶向治療藥物[19].miR-146a-5p通過靶向下調(diào)白介素1受體相關(guān)激酶1(interleukin-1 receptorassociated kinase 1,IRAK1)的表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞的生長、遷移和侵襲[20].miR-146a-5p通過調(diào)節(jié)性別決定區(qū)Y框蛋白5(sex determining region Ybox protein 5,SOX5)抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[21].本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,胃癌細(xì)胞系中miR-146a-5p表達(dá)水平降低;與文獻(xiàn)[9,10]中結(jié)果一致.為進(jìn)一步研究miR-146a-5p對(duì)胃癌細(xì)胞的影響,本實(shí)驗(yàn)高表達(dá)miR-146a-5p,結(jié)果發(fā)現(xiàn)高表達(dá)miR-146a-5p可抑制胃癌細(xì)胞SNU-1的增殖、遷移和侵襲.研究報(bào)道LncRNA鉀電壓門控通道亞家族Q成員1重疊轉(zhuǎn)錄本(KCNQ1oppositestrand/ antisensetranscript1,KCNQ1OT1)通過miR-146a-5p抑制放射敏感性并促進(jìn)肝細(xì)胞癌的發(fā)生[22].本實(shí)驗(yàn)通過在線軟件預(yù)測(cè)LINC00963可能靶向結(jié)合的miRNA,結(jié)果發(fā)現(xiàn)LINC00963可靶向結(jié)合miR-146a-5p;且本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了LINC00963靶向調(diào)控miR-146a-5p,說明LINC00963可能通過調(diào)控miR-146a-5p影響胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等過程.

本實(shí)驗(yàn)通過在線軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-146a-5p與NFE2L1有結(jié)合位點(diǎn);研究報(bào)道NFE2L1在食管鱗癌中高表達(dá),與食管鱗癌腫瘤分化程度和淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)[23].肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞中NFE2L1在烏拉坦所致的小鼠肺腺癌中發(fā)揮腫瘤抑制作用[24].本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,胃癌細(xì)胞系中NFE2L1 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高.抑制NFE2L1表達(dá)可降低細(xì)胞活性降低,減少遷移和侵襲數(shù)量;表明NFE2L1低表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲.且本實(shí)驗(yàn)表明miR-146a-5p靶向調(diào)控NFE2L1;還發(fā)現(xiàn)LINC00963通過miR-146a-5p調(diào)控NFE2L1的表達(dá),高表達(dá)NFE2L1逆轉(zhuǎn)了LINC00963低表達(dá)對(duì)SNU-1增殖,遷移和侵襲的抑制作用.

4 結(jié)論

綜上所述,LINC00963低表達(dá)可能通過調(diào)控miR-146a-5p/NFE2L1軸抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲.

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

胃癌是全球常見癌癥,死亡率高,但胃癌發(fā)生、進(jìn)展的潛在機(jī)制尚未闡明,已有報(bào)道顯示lncRNA表達(dá)異常可調(diào)控胃癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為,但仍有部分lncRNA在胃癌進(jìn)展中作用機(jī)制尚未可知.

實(shí)驗(yàn)動(dòng)機(jī)

LINC00963在胃癌中表達(dá)上調(diào),但LINC00963在胃癌進(jìn)展中的作用機(jī)制并不清楚.既往研究證實(shí)LINC00963在腫瘤進(jìn)展中具有致癌作用.因此,探討LINC00963在胃癌進(jìn)展中的作用和機(jī)制對(duì)胃癌診斷和治療意義重大.

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

LINC00963低表達(dá)通過調(diào)控miR-146a-5p/NFE2L1軸可抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,為胃癌治療提供潛在靶點(diǎn).

實(shí)驗(yàn)方法

RT-qPCR和western blot檢測(cè)胃癌組織、細(xì)胞系中LINC00963、miR-146a-5p和NFE2L1的表達(dá).將si-LINC00963、si-NFE2L1、miR-146a-5p mimics分別轉(zhuǎn)染到胃癌細(xì)胞SNU-1中,CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖;Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲;雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證LINC00963與miR-146a-5p、miR-146a-5p與NFE2L1的靶向關(guān)系.將si-LINC00963和pcDNA-NFE2L1共轉(zhuǎn)染到SNU-1細(xì)胞中,采用CCK-8、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力.Western blot檢測(cè)增殖、遷移和侵襲相關(guān)蛋白表達(dá).

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

LINC00963、NFE2L1在胃癌組織、細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào),miR-146a-5p表達(dá)下調(diào).低表達(dá)LINC00963或低表達(dá)NFE2L1或高表達(dá)miR-146a-5p均可抑制SNU-1細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,下調(diào)CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達(dá).雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)LINC00963可靶向結(jié)合miR-146a-5p,miR-146a-5p可靶向結(jié)合NFE2L1.LINC00963可負(fù)向調(diào)控miR-146a-5p表達(dá),miR-146a-5p可負(fù)向調(diào)控NFE2L1表達(dá).高表達(dá)NFE2L1可以逆轉(zhuǎn)LINC00963低表達(dá)對(duì)SNU-1細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用.

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

胃癌中LINC00963表達(dá)增加,LINC00963低表達(dá)通過調(diào)控miR-146a-5p/NFE2L1軸能夠減弱胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力.

展望前景

LINC00963下游是否存在其他miRNA、miR-146a-5p下游是否存在其他靶點(diǎn)仍需進(jìn)一步確認(rèn),還需體內(nèi)移植瘤實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證LINC00963的致癌作用,LINC00963/miR-146a-5p/NFE2L1軸可能作為胃癌治療的靶標(biāo)基因.