徐秋玲，鄭學(xué)芝，郭 冉，王文婷，張緒東

(牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011)

心肌纖維化是糖尿病心肌損傷的病理機(jī)制之一，高糖刺激導(dǎo)致炎性反應(yīng)在糖尿病心肌損害中發(fā)揮著重要作用[1]。細(xì)胞Toll樣受體(TLR)是Ⅰ型跨膜蛋白，活化后激活下游核因子κB(NF-κB)，使細(xì)胞內(nèi)炎性細(xì)胞因子增多，導(dǎo)致心肌間質(zhì)膠原纖維大量沉積，心肌間質(zhì)纖維化[2]。中藥黃芩的主要活性成分為黃芩苷，可抑制高血壓大鼠心肌細(xì)胞纖維化[3]。但黃芩苷對(duì)糖尿病心肌纖維化是否具有作用，且相關(guān)研究較少。本研究通過建立大鼠糖尿病模型，觀察了黃芩苷與TLR/NF-κB 信號(hào)通路的關(guān)系，旨在探討黃芩苷干預(yù)糖尿病心肌纖維化機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 雄性SD大鼠由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供，黃芩苷購自Sigma公司(高效液相色譜測(cè)定含量大于95%，用生理鹽水配制藥液)，masson染色試劑購自福州邁新生物技術(shù)公司，兔抗鼠白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、TLR4、核因子-κBp65(p65)、Ⅰ型膠原(collagenⅠ)多克隆抗體均購自Abcam公司，兔抗鼠β-actin多克隆抗體購自博士德生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1建立糖尿病大鼠模型 2019年7月選取雄性SD大鼠25只，體重180～222 g，尾靜脈注射鏈脲佐菌素45 mg/kg(溶于0.1 mmol/L枸櫞酸緩沖液)。72 h后連續(xù)2次空腹血糖大于或等于16.7 mmol/L為糖尿病模型造模成功，共20只。

1.2.2分組與給藥 將40只大鼠按照隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)法分為對(duì)照組(NC組，腹腔注射生理鹽水)、糖尿病模型組(DM組，腹腔注射生理鹽水)、黃芩苷+糖尿病組[Baicalin+DM組，腹腔注射黃芩苷藥液15 μmol/L/(kg·d)]和黃芩苷+對(duì)照組[Baicalin+NC組，腹腔注射黃芩苷藥液15 μmol/L/(kg·d)]，每組10只。連續(xù)用藥8周。

1.2.3Masson染色 取各組大鼠心尖組織制備石蠟切片，按masson染色試劑盒說明書進(jìn)行操作。每組取材6張片子，高倍鏡(400×)下觀察。計(jì)算心肌膠原容積分?jǐn)?shù)[CVF=(膠原面積/全視野面積)×100%]。

1.2.4Western-blotting檢測(cè)IL-1β、TNF-α、TLR4、p65、collagenⅠ蛋白水平 按試劑說明書提取各組大鼠心肌組織總蛋白，檢測(cè)蛋白濃度和純度，進(jìn)行分裝，每管蛋白為50 μg，凍存于-80 ℃冰箱備用。Western-blotting步驟：十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺電泳，轉(zhuǎn)膜，免疫反應(yīng)(封閉液稀釋一抗1∶100、二抗1∶1 000)，二氨基聯(lián)苯胺顯色。采用4000R柯達(dá)成像系統(tǒng)凝膠成像儀采集圖像并進(jìn)行分析。計(jì)算條帶光密度值與條帶面積比值。

1.2.5觀察指標(biāo) 觀察各組大鼠血糖、心臟重量指數(shù)(心臟重量/體重)、CVF，以及IL-1β、TNF-α、TLR4、p65、collagenⅠ蛋白水平等。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠血糖、心臟重量指數(shù)比較 與NC組比較，DM組大鼠血糖明顯升高，心臟重量指數(shù)明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與DM組比較，Baicalin+DM組大鼠血糖明顯降低，心臟重量指數(shù)明顯減小，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1、圖1。

A：各組血糖比較；B：各組心臟重量指數(shù)比較;與NC組比較，aP<0.05；與DM組比較，bP<0.05。

表1 各組大鼠血糖、心臟重量指數(shù)比較

2.2各組大鼠心肌組織變化及CVF比較 DM組大鼠心肌纖維排列紊亂，部分肌纖維被藍(lán)染的膠原纖維取代，纖維組織明顯增生；與DM組比較，Baicalin+DM組大鼠心肌纖維排列較規(guī)則，肌纖維變性較輕，纖維組織增生明顯減少。與NC組比較，DM組大鼠CVF明顯升高，與DM組比較，Baicalin+DM組大鼠CVF明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2、3。

A：NC組；B：DM組；C：Baicalin+DM組；D：Baicalin+NC組。

2.3各組大鼠心肌IL-1β、TNF-α、TLR4、p65、collagenⅠ表達(dá)水平比較 與NC組比較，DM組大鼠心肌IL-1β、TNF-α、TLR4、p65、collagenⅠ表達(dá)水平均明顯升高，與DM組比較，Baicalin+DM組大鼠心肌IL-1β、TNF-α、TLR4、p65、collagenⅠ表達(dá)水平均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2，圖4、5。

與NC組比較，aP<0.05；與DM組比較，bP<0.05。

表2 各組大鼠心肌NF-κB p65/β-actin表達(dá)水平比較

A：NC組；B：DM組；C：Baicalin+DM組；D：Baicalin+NC組。

A為IL-1β，B為TNF-α，C為TLR4,D為p65,E為collagenⅠ；與NC組比較，aP<0.05；與DM組比較，bP<0.05。

3 討 論

心肌間質(zhì)纖維化，即膠原纖維大量沉積是高血糖侵害下導(dǎo)致心肌損害的重要病變之一，纖維化增加了心室壁僵硬度，降低了心室順應(yīng)性，導(dǎo)致心功能不全[4]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，終末期心力衰竭患者死亡的主要原因?yàn)樾募￠g質(zhì)纖維化[5]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，DM組大鼠心臟重量指數(shù)明顯增加，心肌纖維排列紊亂，纖維組織增生明顯，膠原纖維增多。心肌collagenⅠ表達(dá)水平明顯增加，印證了在高血糖因素刺激下可導(dǎo)致心肌纖維化，影響心臟功能。

有研究表明，敲除免疫球蛋白樣受體b4的大鼠出現(xiàn)病理性心肌肥大，心肌炎性反應(yīng)增強(qiáng)，心肌纖維化，而NF-κB信號(hào)通路參與了這一病理機(jī)制[6]。在新生大鼠心臟成纖維細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB參與了血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌纖維化，使用 NF-κB抑制蛋白α(IκBα)抑制NF-κB活性可減輕纖維化進(jìn)程[7]。本研究DM組大鼠心肌NF-κB p65蛋白和炎性性別因子--IL-1β、TNF-α表達(dá)水平均明顯升高，collagenⅠ表達(dá)水平也明顯升高，推測(cè)高濃度葡萄糖激活了NF-κB信號(hào)通路，誘導(dǎo)了異常的炎性反應(yīng)，心肌細(xì)胞過表達(dá)炎性性別因子，TNF-α、IL-1β釋放增多，侵害心肌組織。

TLR主要分布在淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血管細(xì)胞表面，TLR有多種亞型，其中TLR4在心臟組織中表達(dá)水平最高，在心肌缺血再灌注損傷中TLR4參與了IL-10基因敲除小鼠心肌纖維化病理機(jī)制[8]。TLR4與配體結(jié)合后先活化IκB激酶，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)NF-κB/IκB復(fù)合物IκB亞基被絲氨酸磷酸化，蛋白酶降解，從而釋放NF-κB二聚體，NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，結(jié)合在NF-κB結(jié)合位點(diǎn)，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄進(jìn)程。激活細(xì)胞核內(nèi)NF-κB，在心肌梗死損傷介導(dǎo)的炎性反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[9]。炎性性別因子主要通過Toll樣受體識(shí)別損傷的相關(guān)分子模式，導(dǎo)致炎性反應(yīng)。TLR4誘發(fā)心肌細(xì)胞免疫反應(yīng)，釋放炎性性別因子，致使細(xì)胞外基質(zhì)沉積，促進(jìn)心肌纖維化病程發(fā)展[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化病變時(shí)機(jī)體血管內(nèi)皮細(xì)胞TLR4蛋白表達(dá)上調(diào)，NF-κB被激活，加劇了動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成，推測(cè)TLR4/NF-κB信號(hào)通路參與了血管的炎性反應(yīng)，介導(dǎo)糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化病理過程[11-12]。本研究結(jié)果顯示，高血糖刺激同樣可誘導(dǎo)NF-κB活化，加重心肌炎性反應(yīng)，同時(shí)本研究Western-blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，DM組大鼠心肌TLR4表達(dá)水平明顯高于NC組，表明高血糖是通過TLR/NF-κB信號(hào)通路導(dǎo)致心肌炎性反應(yīng)增強(qiáng)。

黃芩苷(C21H18O11)是黃芩中主要的黃酮類成分，具有多種藥理作用，如抑菌抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗纖維化、心血管保護(hù)作用等。在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞中黃芩苷調(diào)節(jié)了腺苷酸激活蛋白激酶/轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β/sma和mad的同源蛋白信號(hào)通路，抑制細(xì)胞增殖及膠原合成，降低纖維連接蛋白和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子表達(dá)，可抑制心肌纖維化，預(yù)防心力衰竭[13]。在慢性壓力超負(fù)荷小鼠模型中黃芩苷能減輕因壓力超負(fù)荷引起的心功能障礙和心室重構(gòu)[14]。在腎性高血壓大鼠心肌中黃芩苷可減少心肌細(xì)胞凋亡，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，抑制心肌纖維化，改善心室重構(gòu)[15]。黃芩苷在高血糖誘導(dǎo)心肌纖維化中的作用和分子機(jī)制的研究較少，本研究探討了黃芩苷對(duì)糖尿病心肌纖維化的機(jī)制，結(jié)果顯示，Baicalin+DM組大鼠血糖明顯低于DM組，表明黃芩苷具有降低血糖的作用，且黃芩苷能改善糖尿病大鼠心肌纖維化，Baicalin+DM組大鼠心肌IL-1β、TNF-α、TLR4、p65表達(dá)水平均明顯低于DM組，推測(cè)黃芩苷通過抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路、減少NF-κB的核轉(zhuǎn)位、抑制炎性性別因子釋放而改善心肌纖維化，起到保護(hù)心肌的作用，但黃芩苷調(diào)控TLR4的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。