陳小艷，馬俊兵，王欣欣1,，金木蘭，齊 曼△

(1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，內(nèi)蒙古 包頭 014040；2.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科，內(nèi)蒙古 包頭 014010；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院病理科，北京 010020)

胰腺癌惡性程度較高，病情進展快，患者預(yù)后極差。根據(jù)美國癌癥協(xié)會最新的數(shù)據(jù)，胰腺癌導(dǎo)致的死亡數(shù)排第4位[1]。在英國胰腺癌導(dǎo)致的死亡在男、女性中分別占癌癥相關(guān)死亡人數(shù)的5.6%、5.3%，位于第5位[2]。而在中國雖然胰腺癌導(dǎo)致的相關(guān)死亡并沒有排進前5位，但其導(dǎo)致的死亡在癌癥相關(guān)死亡中占比在過去10年中增加了9.0%，且隨著中國居民生活方式和飲食習慣的改變及人口老齡化的加速，這一比例急劇增長[2-3]。早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和預(yù)后評估對提高患者生存率及延長壽命具有重要意義。

多聚(腺苷二磷酸核糖)聚合酶(PARP)最初被定義為DNA損傷感受器蛋白，識別并結(jié)合DNA損傷缺口，啟動DNA 修復(fù)[4]。PARP14是新近認識的其家族成員之一，作為生物信號傳遞的轉(zhuǎn)錄輔因子及信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子6而被發(fā)現(xiàn)[5-6]。PARP14一般催化單個腺苷二磷酸核糖基化[7]，同時，PARP14也是PARP家族蛋白中宏多聚(腺苷二磷酸核糖)聚合酶子家族中的一員，推測其可調(diào)節(jié)蛋白分子之間的泛素化及腺苷二磷酸聚合酶作用[8]。有研究表明，PARP14在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、信號傳導(dǎo)途徑和肌動蛋白細胞骨架中發(fā)揮作用[6,9]。IANSANTE等[10]發(fā)現(xiàn)，PARP14在肝癌、膠質(zhì)母細胞瘤、胃癌、乳腺癌及肺癌組織均呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，且認識到PARP14-c-JUN 氨基末端激酶-肌肉丙酮酸激酶同工酶2軸可通過瓦伯格效應(yīng)調(diào)節(jié)肝癌細胞凋亡與代謝，提示PARP14可作為肝癌的治療靶標[11]。有研究表明，在胰腺癌細胞系中可能通過高表達PARP14影響核因子κB信號途徑促進κB激酶抑制劑磷酸化和P65核轉(zhuǎn)位[12]；P65入核后啟動白細胞介素-1β(IL-1β)和IL-8等表達，其中IL-1β正反饋作用于腫瘤細胞表面IL-1受體，使腫瘤細胞PARP14繼續(xù)過表達，促進腫瘤細胞生存。NICOLAE等[13]研究表明，PARP14抑制劑可通過阻斷同源重組 DNA修復(fù)和使癌細胞對DNA損傷敏感性增強從而增強化療敏感性。PARP14在人胰腺癌腫瘤組織中具體作用機制的文獻報道較少，因此，深入探討其在人胰腺癌組織標本中的表達及與臨床病理資料的相關(guān)性對胰腺癌的治療和判斷患者預(yù)后是非常有意義的。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2011年1月至2018年12月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院收治的胰腺癌患者手術(shù)切除的胰腺癌組織蠟塊標本229份作為研究對象，患者年齡21～89歲，平均(61.17±10.75)歲。229例患者中臨床資料(包括年齡、性別、腫瘤大小、部位、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)浸潤、遠處轉(zhuǎn)移、臨床分期、吸煙史、糖尿病史、高血壓病史、治療經(jīng)過等)完整114例，且有完整的隨訪信息、明確的死亡時間、終點狀態(tài)、基線糖鏈抗原19-9值等。229例患者術(shù)前均未給予任何抗腫瘤治療。每份組織蠟塊標本均取癌組織及對應(yīng)癌旁組織，病理診斷為胰腺導(dǎo)管腺癌。采用美國癌癥聯(lián)合委員會胰腺癌TNM分期進行臨床分期。本研究程序符合內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院人體實驗委員會制定的道德標準，即2000年第5次修訂的赫爾辛基宣言。

1.2方法

1.2.1組織芯片的制作 收集229例患者的病理資料，由2名病理診斷醫(yī)師重新復(fù)習切片挑選出典型胰腺導(dǎo)管腺癌病理切片，并用記號筆畫圓圈出2個典型病變部位，另標記正常導(dǎo)管、腺泡、胰島部位，挑選出相應(yīng)蠟塊。使用組織芯片儀制備組織芯片，制作組織芯片前按說明書編制好制作程序，再按說明書進行操作，穿刺針直徑1 mm將穿出的供體組織轉(zhuǎn)移到受體蠟塊，制備出組織芯片后進行適當?shù)娜谙?，使組織與蠟較好地結(jié)合。

1.2.2免疫組織化學(xué)(免疫組化)法檢測 采用免疫組化MaxVision 法染色，組織芯片經(jīng)切片、脫蠟、水化、抗原修復(fù)、滴加一抗，PARP(1∶200 稀釋)、P65(1∶200 稀釋)和IL-1β(1∶200 稀釋)一抗4 ℃孵育過夜，滴加二抗，二氨基聯(lián)苯胺顯色，復(fù)染，封固。一抗購自Abcam公司，二抗試劑盒(PV9000)、二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑盒購自北京中杉金橋公司，具體操作按試劑盒說明書進行，免疫組化結(jié)果均經(jīng)2名病理醫(yī)師采用雙盲法診讀。根據(jù)染色程度進行評分：無陽性著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，深棕色為3分。每張切片隨機選取5個高倍視野(400×)，計算每個視野陽性染色腫瘤細胞百分數(shù)，并取平均值進行評分:陽性細胞百分數(shù)小于10%為0分，10%～<25%為1分，25% ～<50%為2分，50%～<75%為3分，75%～100%為4分。2項得分相乘:0分為陰性，1～4分為弱陽性，5～8分為中等陽性，9～12分為強陽性。

2 結(jié) 果

2.1胰腺癌組織與癌旁組織(正常導(dǎo)管)PARP14、p65、IL-1β表達比較及其臨床病理特點的相關(guān)性 胰腺癌組織細胞質(zhì)PARP14、P65、IL-1β表達均明顯高于癌旁組織(正常導(dǎo)管)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1、圖1。胰腺癌組織PARP14、P65、IL-1β強陽性表達陽性率均明顯高于正常導(dǎo)管強陽性表達陽性率，弱陽性表達陽性率均明顯低于正常導(dǎo)管弱陽性表達陽性率。不同分期患者PARP14表達比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；臨床分期3、4期(>2B期)患者強陽性表達陽性率明顯高于1、2期(≤2B期)患者；有高血壓病史患者P65中等陽性以上表達陽性率明顯高于無高血壓病史患者，弱陽性表達陽性率明顯低于無高血壓病史患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。不同年齡、性別、糖鏈抗原19-9水平、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、神經(jīng)浸潤患者PARP14、p65、IL-1β表達比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。胰腺癌組織PARP14表達與P65、IL-1β呈正相關(guān)(r=0.191、0.282，P=0.034、0.002)，P65表達與IL-1β呈正相關(guān)(r=0.333，P=0.001)，PARP14與其他臨床指標無關(guān)。

表1 胰腺癌組織PARP14、P65、IL-1β表達比較[n(%)]

A：PARP14腫瘤細胞質(zhì)強陽性表達；B：P65腫瘤細胞質(zhì)、細胞膜強陽性表達；C：IL-1β腫瘤細胞質(zhì)強陽性表達；D：PARP14癌旁組織(正常導(dǎo)管)弱陽性表達；E：P65癌旁組織(正常導(dǎo)管)弱陽性表達；F：IL-1β癌旁組織(正常導(dǎo)管)弱陽性表達、胰島強陽性表達。

表2 胰腺癌組織PARP14、P65、IL-1β表達與臨床病理特點的相關(guān)性[n(%)]

2.2危險因素分析 單因素logistic回歸明顯分析顯示有神經(jīng)浸潤、遠處轉(zhuǎn)移、吸煙是死亡的危險因素(P<0.05)；多因素logistic回歸明顯分析顯示有神經(jīng)浸潤、表達升高是死亡的獨立危險因素(OR=71.309，95%CI：1.13～4 501.50，P=0.06)，PARP14、P65、IL-1β表達升高均未顯示出是胰腺癌患者死亡的獨立危險因素。114例患者中發(fā)生神經(jīng)浸潤105例(92.1%)，PARP14均呈中等陽性以上表達。

2.3不同陽性程度PARP14、P65、IL-1β患者生存時間比較 PARP14強陽性表達與中等陽性表達患者生存時間分別為17.9、15.7個月，P65、IL-1β強陽性表達患者生存時間(分別為15.8、14.7個月)均短于中等陽性表達患者(分別為20.0、21.4 個月)，不同陽性程度PARP14、P65患者生存時間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；不同陽性程度IL-1β患者生存時間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=8.766,P=0.033)。見圖3。弱陽性、中等陽性、強陽性IL-1β患者生存時間分別為9.8、21.4、14.7個月。

圖3 不同陽性程度IL-1β患者生存時間比較

3 討 論

本研究通過組織芯片和免疫組化檢測了胰腺癌組織PARP14、P65、IL-1β表達均明顯高于正常胰腺組織，且三者呈正相關(guān)。PARP14在胰腺癌中高表達與GEO數(shù)據(jù)庫[11](http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)顯示，PARP14在胰腺癌組織中的表達研究結(jié)果一致。在體外敲降PARP14抑制了腫瘤細胞增殖和增強了吉西他濱抗腫瘤的作用。有研究表明，在胰腺癌細胞系中腫瘤細胞高表達PARP14可能通過影響核因子κB信號途徑促進核因子κB激酶抑制劑磷酸化和P65核轉(zhuǎn)位[12]。但本研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌組織P65均為彌漫細胞質(zhì)、細胞膜強陽性表達，所有患者均未發(fā)現(xiàn)P65細胞核陽性表達。三者之間呈正相關(guān)關(guān)系，推測是否PARP14可能通過其他途徑作用于P65，從而進一步使腫瘤細胞IL-1β表達升高，IL-1β進一步正反饋作用于腫瘤細胞,與腫瘤細胞表面IL-1受體結(jié)合，從而促進腫瘤細胞增殖。

本研究多因素logistic回歸分析顯示，有神經(jīng)浸潤(OR=71.309,95%CI：1.13～4 501.50)是死亡的獨立危險因素，PARP14、P65、IL-1β表達升高均未顯示出是胰腺癌患者死亡的獨立危險因素，且PARP14、P65、IL-1β與是否有神經(jīng)浸潤無關(guān)(P>0.05)。本研究中92.1%的患者發(fā)生神經(jīng)浸潤，PARP14均呈中等陽性以上表達，其之間的關(guān)系值得進一步研究。

本研究生存分析結(jié)果顯示，P65、IL-1β強陽性表達患者生存時間(分別為15.8、14.7個月)均短于中等陽性表達患者(分別為20.0、21.4 個月)，不同陽性程度IL-1β患者生存時間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，弱陽性、中等陽性、強陽性表達IL-1β患者生存時間分別為9.8、21.4、14.7個月。弱陽性表達IL-1β患者生存時間短于中等陽性、強陽性表達患者，可能因為本研究弱陽性表達患者數(shù)較少，尚有待于今后增加患者數(shù)進一步分析。PARP14在腫瘤組織中均呈高表達，PARP14中等陽性表達與強陽性表達患者生存時間分別為15.7、17.9個月，與P65、IL-1β強陽性表達患者生存時間接近，強陽性表達患者生存時間均較短。與GEO、TCGA數(shù)據(jù)庫關(guān)于PARP14表達水平與總生存期顯著相關(guān)、PARP14表達量越高患者預(yù)后越差的結(jié)果相似，與傅躍等[11]研究結(jié)果也類似，提示異常表達PARP14 可能在胰腺癌中發(fā)揮著癌基因作用。

本研究尚存在一定缺陷，采用的是選取胰腺癌組織蠟塊進行組織芯片制作，取材具有一定的局限性，不能充分反映腫瘤細胞的異質(zhì)性，將來應(yīng)進一步研究證實及收集新鮮胰腺癌組織進行檢測以進一步支持本研究結(jié)果，同時，PARP14、P65、IL-1β三者在胰腺癌中的表達及對患者預(yù)后的影響尚值得進一步深入研究其可能的作用機制，以尋找胰腺癌治療及改善患者預(yù)后的靶點。