王曉磊 高彥彬 張濤靜

足細胞損傷是糖尿病腎病(diabetic kidney disease, DKD)腎纖維化發(fā)生發(fā)展的重要因素之一。轉(zhuǎn)分化作為足細胞損傷的一種重要形式，在與足細胞損傷相關(guān)的疾病進程中發(fā)揮著重要作用。在慢性高血糖等持續(xù)刺激下，足細胞將失去自身成熟細胞的細胞表型標志物(如nephrin)，而間充質(zhì)細胞樣表型標志物，如α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)的表達增多[1-2]。獲得間充質(zhì)細胞表型后的足細胞遷移能力增強，并能夠產(chǎn)生不必要的膠原等纖維蛋白，進而促進腎纖維化的進展[3]。既往研究發(fā)現(xiàn)miRNA-155是腎纖維化的主要致病因子之一，在腎纖維化的進程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[4]。筆者研究團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，中藥芪衛(wèi)顆粒能改善DKD足細胞損傷，起到延緩腎纖維化進展的作用，但其相關(guān)機制尚不清楚[5]。因此，本研究將在以往研究的基礎(chǔ)上，以miRNA-155為切入點，采用體外實驗觀察芪衛(wèi)顆粒對高糖誘導(dǎo)的足細胞轉(zhuǎn)分化及miRNA-155的影響，部分闡明芪衛(wèi)顆粒改善足細胞損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞來源

小鼠腎足細胞株(MCP5)購自北納生物(貨號：BNCC337685)。

1.2 實驗藥物與主要試劑

芪衛(wèi)顆粒(藥物組成：黃芪、鬼箭羽、生地黃、大黃、莪術(shù)，質(zhì)量比例為3∶3∶3∶2∶2)由北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院制劑室制備。

DMEM低糖培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibio公司，兔源多克隆nephrin抗體購自美國Novus Biologicals公司(貨號：NBP1-77303)，兔源多克隆α-SMA抗體購自美國Abcam公司(貨號：ab5694)，miRNA-155 inhibitor試劑盒套裝購自廣州銳博生物(貨號：miR20000165-1-5)，CCK-8法細胞增殖檢測試劑盒購自南京凱基生物(貨號：KGA317)。

1.3 含藥血清的制備

選取雄性SPF級SD大鼠20只(體重為180±20 g)，隨機分為芪衛(wèi)顆粒組和空白對照組(分別用于制備含藥血清及空白血清)2個組，每組10只。其中芪衛(wèi)顆粒組大鼠予芪衛(wèi)顆粒生藥量20 g/(kg·d)灌胃(依照前期動物實驗劑量[6])，空白對照組給予等體積蒸餾水灌胃，每天一次，連續(xù)灌胃7天，于第7天灌胃結(jié)束后2小時經(jīng)大鼠腹主動脈取血，每只大鼠取血量8～10 mL，室溫靜置并離心取血清，經(jīng)56℃水浴滅活后于-80 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 足細胞培養(yǎng)及分組

在含5%的CO2培養(yǎng)箱中用DMEM低糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清及10 U/mL γ-干擾素)培養(yǎng)足細胞，33 ℃環(huán)境下誘導(dǎo)細胞增殖，37 ℃環(huán)境下誘導(dǎo)細胞分化(不含γ-干擾素)。將處于對數(shù)期分化成熟的足細胞用于實驗。細胞共分為4個組：正常組，高糖組，芪衛(wèi)顆粒組和miRNA-155基因敲減組。其中正常組予2.5%空白血清+DMEM低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，高糖組予2.5%空白血清+DMEM高糖培養(yǎng)基(葡萄糖濃度為30 mmol/L，下同)培養(yǎng)，芪衛(wèi)顆粒組予2.5%含藥血清+DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，miRNA-155基因敲減組先予miRNA-155 inhibitor轉(zhuǎn)染足細胞敲減miRNA-155(具體操作依照miRNA-155 inhibitor試劑盒說明書)，再予2.5%空白血清+DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。各組細胞干預(yù)48小時，隨后收集細胞進行相關(guān)檢測。

1.5 觀察指標及采用的檢測方法

CCK-8方法檢測各組細胞活力。將足細胞接種至96孔板中，每孔體積100微升，同時設(shè)置5個復(fù)孔，按上述分組培養(yǎng)24小時后加入10微升 CCK-8反應(yīng)液，于37 ℃烘箱反應(yīng)1小時后，采用酶標儀檢測波長為450 納米的OD值并計算細胞活力(實驗組OD值/正常組OD值×100 %)，同樣方法依次檢測培養(yǎng)48小時及72小時的細胞活力值。

實時熒光定量PCR(real time PCR， RT-PCR)方法檢測足細胞nephrin基因、α-SMA基因和miRNA-155基因的表達水平。提取各組實驗細胞總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄并上機后，根據(jù)得到的熒光信號計算Ct值及基因的相對表達量。Nephrin基因和α-SMA基因以GAPDH基因作為對照基因，miRNA-155基因以U6基因作為對照基因，每個實驗獨立重復(fù)3次。檢測指標引物序列見表1。

表1 足細胞檢測相關(guān)指標引物序列

蛋白質(zhì)印跡法檢測足細胞nephrin蛋白及α-SMA的蛋白表達水平。提取總蛋白，經(jīng)BCA試劑盒進行濃度測定后，對蛋白進行電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉等處理，隨后4℃環(huán)境中孵育一抗過夜，第二天37℃環(huán)境中封閉1小時，并孵育二抗，最后經(jīng)顯影獲得目的條帶，并分析蛋白相對表達量，每組實驗獨立進行3次。一抗稀釋比例為：nephrin(1∶1000)，α-SMA(1∶1000)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 芪衛(wèi)顆粒含藥血清對細胞活力的影響

不同組別足細胞干預(yù)24小時、48小時、72小時的OD值結(jié)果如表2所示：隨著時間延長，各組細胞的OD值呈下降趨勢。在同一孵育時間里，高糖組足細胞OD值較正常組明顯下降(P<0.05)，而與高糖組相比，芪衛(wèi)顆粒組和miRNA-155基因敲減組足細胞OD值有所增加(P<0.05)。提示高糖環(huán)境下培養(yǎng)的足細胞的細胞活力顯著下降，經(jīng)芪衛(wèi)顆粒干預(yù)或敲減miRNA-155處理后細胞活力能明顯升高。72小時正常組足細胞OD值較24小時組及48小時組有明顯下降，后續(xù)實驗均采用48小時組。

表2 不同時間點各組足細胞OD值的比較

2.2 芪衛(wèi)顆粒含藥血清對足細胞轉(zhuǎn)分化基因表達相關(guān)指標的影響

各組細胞轉(zhuǎn)分化相關(guān)指標nephrin基因和α-SMA基因的表達水平，結(jié)果如表3所示：與正常組足細胞相比，高糖組細胞nephrin的基因表達水平明顯下降(P<0.05)，而α-SMA的基因表達水平明顯升高(P<0.05)；與高糖組細胞相比，芪衛(wèi)顆粒組和miRNA-155基因敲減組足細胞nephrin的基因表達水平明顯有所上調(diào)(P<0.05)，而α-SMA的基因表達水平明顯下調(diào)(P<0.05)。

表3 各組足細胞轉(zhuǎn)分化相關(guān)指標的基因相對表達水平比較

2.3 芪衛(wèi)顆粒含藥血清對足細胞轉(zhuǎn)分化蛋白表達相關(guān)指標的影響

各組細胞轉(zhuǎn)分化蛋白表達相關(guān)指標nephrin蛋白和α-SMA蛋白的結(jié)果如表4所示：相較于正常組足細胞，高糖組細胞nephrin的蛋白表達水平明顯下降(P<0.05)，α-SMA的蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)；而與高糖組相比，芪衛(wèi)顆粒組和miRNA-155基因敲減組足細胞nephrin的蛋白表達水平明顯上調(diào)(P<0.05)，α-SMA的蛋白表達水平明顯下調(diào)(P<0.05)。

表4 各組足細胞轉(zhuǎn)分化相關(guān)指標的蛋白相對表達水平比較

2.4 芪衛(wèi)顆粒含藥血清對足細胞miRNA-155基因表達的影響

各組細胞干預(yù)48小時后，miRNA-155的基因表達水平結(jié)果如表5所示：與正常組細胞相比，高糖組細胞miRNA-155的基因表達水平明顯升高(P<0.05)；而與高糖組相比，芪衛(wèi)顆粒組細胞miRNA-155的基因表達水平明顯下調(diào)(P<0.05)，miRNA-155基因敲減組足細胞中miRNA-155的基因表達水平處于較低表達水平。

表5 各組足細胞中miRNA-155基因的相對表達水平比較

3 討論

足細胞損傷是導(dǎo)致DKD發(fā)生發(fā)展的重要因素，其損傷形式包括細胞轉(zhuǎn)分化、細胞肥大、細胞凋亡等，其中轉(zhuǎn)分化可于足細胞損傷早期出現(xiàn)，因此，早期抑制轉(zhuǎn)分化，阻止足細胞發(fā)生脫落及凋亡，對于延緩DKD的病程進展起著重要作用[1]。

miRNA是一類長度為22～25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA分子，通過特異性結(jié)合靶基因的3′-UTR發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用[7]。研究發(fā)現(xiàn)miRNA在DKD足細胞損傷中發(fā)揮著重要作用。如抑制miRNA-21的表達水平可以可以減輕DKD大鼠炎癥反應(yīng)，其機制是通過提高靶向基因TIMP3的表達水平來減輕足細胞凋亡實現(xiàn)的[8]；抑制miRNA-217的表達能減輕高糖環(huán)境介導(dǎo)的足細胞損傷和胰島素抵抗，其機制是通過上調(diào)miRNA-27靶基因PTEN的表達水平來增強自噬水平實現(xiàn)的[9]；miR-377通過與長鏈非編碼RNA TUG1內(nèi)源性競爭結(jié)合靶基因PPARγ來促進DKD小鼠外基質(zhì)積聚，促進DKD病程進展，增加長鏈非編碼RNA TUG1的表達或者抑制miRNA-377的表達可以抑制DKD病程進展[10]。新近的一些研究表明在DKD中，miRNAs參與了細胞轉(zhuǎn)分化，如miRNA-21通過促進腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化加重DKD腎纖維化進展[11]，而miRNA-93通過抑制腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化延緩DKD腎纖維化進程[12]等。先前研究發(fā)現(xiàn)抑制miRNA-155可以改善TGF-β1誘導(dǎo)的足細胞凋亡[13]，但miRNA-155是否參與足細胞轉(zhuǎn)分化仍未可知。

基于中醫(yī)絡(luò)病理論，筆者認為腎絡(luò)的病變是貫穿于DKD始終的病理基礎(chǔ)，本病的病機早期以氣陰兩虛、腎絡(luò)瘀滯為主[14]。芪衛(wèi)顆粒是根據(jù)該病機研制的中藥新藥，其功效是益氣養(yǎng)陰，化瘀通絡(luò)。前期臨床研究表明芪衛(wèi)顆粒能明顯降低早期DKD患者的尿蛋白水平、延緩腎功能[15-16]。該藥的前期基礎(chǔ)研究表明其能夠抑制DKD大鼠腎小球系膜基質(zhì)增生[17]，上調(diào)nephrin蛋白表達，改善足細胞足突融合[5]。但其相關(guān)機制仍需闡明。

筆者團隊在前期工作基礎(chǔ)上，提出并驗證了如下設(shè)想：芪衛(wèi)顆?？梢酝ㄟ^調(diào)控足細胞miRNA-155的表達水平來改善足細胞轉(zhuǎn)分化。本研究采用高糖刺激構(gòu)建足細胞轉(zhuǎn)分化模型，以miRNA-155為研究切入點，觀察芪衛(wèi)顆粒對足細胞轉(zhuǎn)分化和miRNA-155的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境下足細胞中miRNA-155的表達水平明顯升高，轉(zhuǎn)分化相關(guān)指標nephrin的基因及蛋白表達水平明顯下降，α-SMA基因及蛋白表達水平明顯升高，提示高糖促進了足細胞轉(zhuǎn)分化。經(jīng)藥物干預(yù)后，足細胞nephrin的蛋白和基因表達水平明顯升高，α-SMA的基因和蛋白表達水平明顯降低，且細胞活力明顯升高，提示中藥芪衛(wèi)顆粒能夠抑制足細胞轉(zhuǎn)分化。miRNA-155基因敲減組足細胞轉(zhuǎn)分化水平亦有所減輕(nephrin的表達水平明顯升高，α-SMA的表達水平明顯降低)，提示抑制miRNA-155的表達能改善足細胞轉(zhuǎn)分化。另外，與高糖組相比較，芪衛(wèi)顆粒干預(yù)后的足細胞miRNA-155的表達水平明顯下降，提示芪衛(wèi)顆粒能抑制高糖環(huán)境下足細胞中miRNA-155的表達水平。芪衛(wèi)顆粒對高糖環(huán)境下足細胞轉(zhuǎn)分化的作用效果與敲減miRNA-155的作用效果相似，故認為芪衛(wèi)顆?？梢酝ㄟ^抑制miRNA-155減輕高糖誘導(dǎo)的足細胞轉(zhuǎn)分化。但miR-155是否通過調(diào)控其相關(guān)靶基因表達水平促進足細胞轉(zhuǎn)分化，及芪衛(wèi)顆粒如何抑制足細胞中miRNA-155的表達，這些機制需要進一步深入探討。

綜上所述，芪衛(wèi)顆粒能夠明顯減輕高糖誘導(dǎo)的足細胞轉(zhuǎn)分化，其部分機制是通過抑制miRNA-155的表達水平實現(xiàn)的。