賈哲 董海鵬 韓婷 徐文娟 李春帥 劉夢(mèng)楠 林青華 趙崇軍 徐新房 李向日

檳榔是棕櫚科植物檳榔ArecacatechuL.的干燥成熟種子，始載于晉代李當(dāng)之《藥錄》，在中國有一千多年的藥用歷史。功效為殺蟲，消積，行氣，利水，截瘧[1]。檳榔幼果為食用檳榔，皮殼一起嚼食，食用后讓人有醉酒的感覺，使兩頰發(fā)紅、心跳加快。機(jī)體出現(xiàn)以上反應(yīng)與檳榔中的生物堿類成分有關(guān)。兩種檳榔各自所含的多種生物堿中，含量最高且起關(guān)鍵作用的都是檳榔堿(arecoline)[2-4]，且前期研究發(fā)現(xiàn)食用檳榔中的檳榔堿含量明顯低于藥用檳榔[5]，血清代謝組學(xué)發(fā)現(xiàn)藥用檳榔水煎液具有一定的心臟毒性[6-7]。檳榔堿可興奮M-膽堿受體，引起腺體分泌增加，也可興奮N-膽堿受體，表現(xiàn)為興奮骨骼肌、神經(jīng)節(jié)及頸動(dòng)脈等，還具有增加腸蠕動(dòng)，抑菌、驅(qū)蟲作用[8]。針對(duì)檳榔堿的毒性報(bào)道多集中在致口腔粘膜下纖維性變[9-13]、生殖系統(tǒng)[14-15]、神經(jīng)系統(tǒng)[16]、肝臟[17]和遺傳毒性[18]等方面，目前未見對(duì)其胚胎發(fā)育及心臟毒性的報(bào)道。檳榔堿性質(zhì)不穩(wěn)定，氫溴酸檳榔堿是其穩(wěn)定存在形式。

斑馬魚與人類具有87%的基因同源性，可被廣泛應(yīng)用于模型構(gòu)建、藥物毒理學(xué)評(píng)價(jià)等[19]研究。其身體透明，具有可識(shí)別的肝臟、心臟等器官，常以有機(jī)整體參與實(shí)驗(yàn)，可以直觀地從整體水平評(píng)價(jià)藥物的毒理作用[20]。發(fā)育中的幼魚組織快速的細(xì)胞分裂和分化，特別容易受到外界有毒物質(zhì)的侵害[21]。

因此本文以氫溴酸檳榔堿為研究對(duì)象，探討氫溴酸檳榔堿對(duì)斑馬魚的胚胎發(fā)育毒性和心臟毒性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

AB系野生型斑馬魚購置于中國科學(xué)院水生生物研究所，養(yǎng)殖于集中式斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)(水溫28.5℃、光照周期為14小時(shí)光照/10小時(shí)黑暗)，每日喂食3次活體豐年蝦。暗周期開始前選擇健康的成年斑馬魚按雌雄比1∶2放入產(chǎn)卵缸內(nèi)，中間放置隔板，于第二天光周期開始后抽去隔板，半小時(shí)后收集魚卵于干凈的培養(yǎng)皿中，胚胎培養(yǎng)液沖洗3遍，在顯微鏡下挑選受精后6小時(shí)且發(fā)育正常的胚胎，一部分作為胚胎發(fā)育毒性的研究對(duì)象；一部分重新放入新的含胚胎培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，28.5℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，相同光照條件下發(fā)育至受精后4天，于受精后3天在體式顯微鏡下挑選出健康的斑馬魚幼魚，作為心臟毒性的研究對(duì)象。

1.2 試劑與儀器

氫溴酸檳榔堿標(biāo)準(zhǔn)品(上海詩丹德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：1344/18868，含量> 99.0%)。NaCl，KCl，Na2HPO4，K2HPO4，MgSO4，CaCl2，NaHCO3，甲基纖維素均為分析純，購置于北京化工廠。

體視顯微鏡(Stemi508，卡爾·蔡司股份公司)；TE-2000-S光學(xué)倒置顯微鏡(NIKON)；斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)(北京愛生生物科技有限公司)；細(xì)胞移液器(10 μL、200 μL、1 mL和5 mL，Eppendorf)；電子分析天平(METTLER TOLEDO)；斑馬魚心跳血流觀測(cè)軟件(MicroZebralab, Viewpoint)；Image J V1.8.0軟件(National Institutes of Health)。

1.3 樣品制備

斑馬魚胚胎培養(yǎng)液：按照Zebrafish Book標(biāo)準(zhǔn)配制NaCl 0.137 mol/L，KCl 5.4 mol/L，Na2HPO40.25 mol/L，K2HPO40.44 mol/L，CaCl21.3 mol/L，MgSO41.0 mol/L，NaHCO34.2 mol/L的水溶液。

氫溴酸檳榔堿儲(chǔ)備液：精密稱取25 mg，置于50 mL容量瓶中，加斑馬魚胚胎培養(yǎng)液至刻度，搖勻，即得儲(chǔ)備液500 μg/mL。

3%甲基纖維素固定液：將400 mL斑馬魚胚胎培養(yǎng)液置于燒杯中，水浴加熱到70℃，邊攪拌邊加入12 g甲基纖維素，逐漸形成一種淤漿，攪拌后將該淤漿置于冰箱冷卻過夜，即得。

1.4 氫溴酸檳榔堿對(duì)胚胎發(fā)育的毒性研究

1.4.1 藥物暴露 將已挑選好的受精后4小時(shí)的健康胚胎(透明狀受精卵)隨機(jī)轉(zhuǎn)移進(jìn)含有不同濃度(200、300、400、500 μg/mL)氫溴酸檳榔堿的12孔板中，每孔20個(gè)胚胎，每組設(shè)置4孔重復(fù)。28.5℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24小時(shí)更換氫溴酸檳榔堿樣品溶液1次并移除死亡的胚胎，以保證溶液中各參數(shù)穩(wěn)定。取不同親本的胚胎重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.4.2 氫溴酸檳榔堿對(duì)不同發(fā)育階段斑馬魚胚胎發(fā)育表型影響的觀測(cè) 以培養(yǎng)液中發(fā)育的胚胎為對(duì)照組，通過倒置光學(xué)顯微鏡于受精后24、48和72小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)觀察藥物暴露后胚胎的發(fā)育情況與形態(tài)變化，并拍照記錄。胚胎的發(fā)育情況與形態(tài)變化主要關(guān)注各時(shí)間點(diǎn)魚體長度、畸形情況和各臟器是否異常及隨暴露時(shí)間的延長以上各指標(biāo)的變化。

1.4.3 受精后24小時(shí)斑馬魚胚胎自主抽動(dòng)的測(cè)定 記錄受精后24小時(shí)每個(gè)濃度下1分鐘內(nèi)胚胎的自主抽動(dòng)次數(shù)，每個(gè)孔取15枚胚胎進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.4.4 受精后48小時(shí)斑馬魚胚胎心率的測(cè)定 記錄受精后48小時(shí)每個(gè)濃度下胚胎10秒內(nèi)心臟跳動(dòng)次數(shù)，每個(gè)孔取15枚胚胎進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.4.5 受精后48、72小時(shí)斑馬魚胚胎孵化率的測(cè)定 統(tǒng)計(jì)不同濃度氫溴酸檳榔堿暴露組中斑馬魚胚胎的孵化率(孵化率=已孵化胚胎/總胚胎個(gè)數(shù)×100%)。由于胚胎在受精后48小時(shí)開始孵化，直到受精后96小時(shí)完成孵化，因此，分別選擇受精后48和72小時(shí)統(tǒng)計(jì)胚胎的孵化率。

1.5 氫溴酸檳榔堿對(duì)心臟的毒性研究

1.5.1 藥物暴露 隨機(jī)選取受精后4天的斑馬魚幼魚于12孔板中，分別暴露于不同濃度(25、50、100 μg/mL)的氫溴酸檳榔堿中24小時(shí)，每孔20尾，每組設(shè)置4孔重復(fù)。同時(shí)，以正常的斑馬魚胚胎培養(yǎng)液為對(duì)照組。整個(gè)暴露過程在28.5℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行，且整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5.2 心率、血流指標(biāo)評(píng)價(jià) 計(jì)算斑馬魚幼魚心率前，將斑馬魚幼魚從培養(yǎng)箱中取出放置在室溫下30分鐘以適應(yīng)環(huán)境溫度。不同濃度藥物暴露組和對(duì)照組中每孔隨機(jī)選擇15只斑馬魚幼魚，將其固定于3%甲基纖維素中。用發(fā)針調(diào)整斑馬魚的體位，使其兩眼盡量重合，頭部與尾部保持在同一水平面上。在體視顯微鏡下，找到斑馬魚的心臟，在心臟跳動(dòng)清晰可見時(shí)，計(jì)數(shù)每分鐘的心跳次數(shù)，每只斑馬魚計(jì)數(shù)3次。同時(shí)，在斑馬魚心跳血流觀測(cè)軟件上截取水平且圖象清晰的血管區(qū)域，設(shè)置60秒錄制時(shí)間，通過計(jì)算該設(shè)定時(shí)間內(nèi)的像素變化，計(jì)算血流量及血流速。

1.5.3 表型分析評(píng)價(jià) 不同濃度藥物暴露組和對(duì)照組中每孔隨機(jī)選擇15只斑馬魚幼魚，將其固定于3%甲基纖維素中。用發(fā)針調(diào)整斑馬魚的體位，使其兩眼盡量重合，頭部與尾部保持在同一水平面上。在顯微鏡下觀察并拍照，用Image J V1.8.0軟件測(cè)算各組斑馬魚靜脈竇(sinus venosus，SV)-動(dòng)脈球(bulbus arteriosus，BA)即SV-BA間距，每只斑馬魚重復(fù)測(cè)量3次。

1.5.4 病理組織學(xué)評(píng)價(jià) 在實(shí)驗(yàn)暴露終點(diǎn)，使用斑馬魚胚胎培養(yǎng)液將不同濃度氫溴酸檳榔堿暴露組中的斑馬魚幼魚沖洗三次，轉(zhuǎn)移到干凈的含4%多聚甲醛的1.5 mL離心管中，室溫保存。在乙醇中逐步脫水，石蠟包埋，切成4～5 μm的薄片后進(jìn)行HE染色，在顯微鏡下觀察以確認(rèn)不同濃度氫溴酸檳榔堿暴露處理對(duì)斑馬魚心臟組織病理學(xué)的改變。

1.6 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 氫溴酸檳榔堿對(duì)胚胎發(fā)育的毒性研究

2.1.1 氫溴酸檳榔堿對(duì)不同發(fā)育階段斑馬魚胚胎發(fā)育表型的影響 與對(duì)照組胚胎比較，不同濃度氫溴酸檳榔堿暴露組的受精后24小時(shí)的胚胎未見明顯異常；受精后48小時(shí)的幼魚均見魚體短小，心囊水腫，心包出血，卵黃囊水腫，脊柱彎曲，尾巴變形，眼部及魚體黑色素沉積減少，同時(shí)均存在不出膜的情況，且給藥濃度越高，表現(xiàn)越顯著；受精后72小時(shí)均見魚體短小，明顯心囊及卵黃囊水腫，脊柱彎曲，尾部畸變，眼部黑色素沉積減少，且給藥濃度越高，毒性表現(xiàn)越顯著，同時(shí)均存在幼魚游泳緩慢的情況。見圖1。

注：紅色箭頭表示心囊水腫；白色箭頭表示卵黃囊水腫；黑色箭頭表示脊柱彎曲；白色虛線區(qū)域表示尾部畸變。圖1 對(duì)照組和氫溴酸檳榔堿不同濃度組斑馬魚幼魚在不同時(shí)間點(diǎn)的發(fā)育形態(tài)(×40)

2.1.2 受精后24小時(shí)斑馬魚胚胎自主抽動(dòng)的測(cè)定 由表1可知，不同濃度氫溴酸檳榔堿暴露組與對(duì)照組之間具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。隨著氫溴酸檳榔堿濃度的升高，斑馬魚胚胎自主抽動(dòng)次數(shù)增加，呈濃度依賴性。

表1 氫溴酸檳榔堿對(duì)受精后24小時(shí)的斑馬魚胚胎自主抽動(dòng)次數(shù)的影響

2.1.3 受精后48小時(shí)斑馬魚胚胎心率的測(cè)定 由表2可知，除200 μg/mL濃度組之外，其他濃度氫溴酸檳榔堿暴露組均與對(duì)照組之間具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。隨著氫溴酸檳榔堿濃度的升高，斑馬魚胚胎心率減緩，呈濃度依賴性。

表2 氫溴酸檳榔堿對(duì)受精后48小時(shí)的斑馬魚胚胎心臟跳動(dòng)次數(shù)的影響

2.1.4 受精后48、72小時(shí)斑馬魚胚胎孵化率的測(cè)定 由表3可知，對(duì)于受精后48和72小時(shí)斑馬魚胚胎的孵化率，不同濃度氫溴酸檳榔堿暴露組與對(duì)照組之間具有顯著性差異(P<0.01)。隨著氫溴酸檳榔堿濃度的升高，受精后48和72小時(shí)的斑馬魚胚胎孵化率均降低，且呈濃度依賴性。

表3 氫溴酸檳榔堿對(duì)受精后48和72小時(shí)的斑馬魚胚胎孵化率的影響

2.2 氫溴酸檳榔堿對(duì)心臟的毒性研究

2.2.1 心率、血流指標(biāo)評(píng)價(jià) 由表4可知，與對(duì)照組比較，100 μg/mL濃度組的斑馬魚心率、血流量和平均血流速三項(xiàng)指標(biāo)均有顯著性差異(P<0.05)。其他濃度暴露組的心率呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，血流量和平均血流速呈現(xiàn)減少的趨勢(shì)，且均呈濃度依賴性。見表4。

表4 氫溴酸檳榔堿各濃度組的斑馬魚幼魚心率、血流量和平均血流速(n=4)

2.2.2 表型分析評(píng)價(jià) 與對(duì)照組相比，50 μg/mL濃度組出現(xiàn)尾巴彎曲，心臟部位未見明顯異常；100 μg/mL濃度組出現(xiàn)明顯的體長縮短，心囊水腫，卵黃囊水腫等現(xiàn)象。見圖2。

藥物暴露24小時(shí)后各組斑馬魚幼魚的SV-BA間距見表5。由表5可知， 與對(duì)照組比較， 25 μg/mL濃度組的斑馬魚SV-BA間距無顯著性差異(P>0.05)；50和100 μg/mL濃度組有顯著性差異。組間數(shù)據(jù)差異隨著氫溴酸檳榔堿暴露濃度的增加而增加。

表5 氫溴酸檳榔堿各濃度組的斑馬魚SV-BA距離

2.2.3 病理組織學(xué)評(píng)價(jià) 通過光學(xué)顯微鏡拍照發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，50、100 μg/mL濃度組的斑馬魚心臟結(jié)構(gòu)改變，形成細(xì)小型的管狀心臟，心房心室管腔面積明顯縮小，心肌壁變薄、心肌細(xì)胞數(shù)量減少。見圖3。

注：黑色箭頭表示心囊水腫；白色虛線區(qū)域表示尾部畸變；紅色雙向箭頭表示SV-BA距離。圖2 對(duì)照組和氫溴酸檳榔堿不同濃度組斑馬魚幼魚的表型觀察(×40, ×100)

注：紅色箭頭表示心臟區(qū)域；紅色實(shí)線區(qū)域表示心房心室管腔面積。圖3 氫溴酸檳榔堿各濃度給藥組的斑馬魚心臟組織病理切片(×100, ×400)

3 討論

受精后24小時(shí)為斑馬魚發(fā)育過程中的咽囊期，該時(shí)期主要特點(diǎn)為：視網(wǎng)膜和皮膚早期色素沉著，中鰭折疊，卵黃血紅細(xì)胞出現(xiàn)，心臟開始搏動(dòng)[22]。與對(duì)照組比較，不同濃度氫溴酸檳榔堿暴露的受精后24小時(shí)胚胎未見明顯異常，分析原因可能是卵膜能夠阻止一部分化合物與胚胎接觸，對(duì)胚胎具有一定的保護(hù)作用。胚胎發(fā)育至受精后24小時(shí)尾部表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抽動(dòng)。自主抽動(dòng)是斑馬魚運(yùn)動(dòng)神經(jīng)系統(tǒng)未發(fā)育完全的表現(xiàn)，不受機(jī)體控制，由其運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元調(diào)控，隨著發(fā)育過程中神經(jīng)系統(tǒng)的完善而逐漸減弱。氫溴酸檳榔堿雖未對(duì)胚胎的形態(tài)發(fā)育造成影響，但在某種程度上能夠影響胚胎的運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)或者神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育，使得氫溴酸檳榔堿各濃度暴露組的胚胎活動(dòng)遠(yuǎn)強(qiáng)于對(duì)照組。

受精后48小時(shí)為斑馬魚發(fā)育過程中的孵化期(長胸鰭)，該時(shí)期主要特點(diǎn)為：出膜成為幼魚，開始長胸鰭，背上位靜息，卵黃變細(xì)，視網(wǎng)膜上虹膜色素細(xì)胞豐富，頭部顯著黃色[22]。與對(duì)照組比較，不同濃度氫溴酸檳榔堿暴露的受精后48小時(shí)的斑馬魚幼魚的形態(tài)發(fā)育過程出現(xiàn)較為明顯的毒性反應(yīng)，且呈濃度依賴性。斑馬魚胚胎在受精后48小時(shí)心臟已基本發(fā)育完全，即出現(xiàn)規(guī)律的心跳，此后心率基本趨于穩(wěn)定，因此心率為胚胎毒性測(cè)試實(shí)驗(yàn)中一個(gè)非常重要的亞致死毒理學(xué)指標(biāo)。結(jié)果表明氫溴酸檳榔堿導(dǎo)致斑馬魚胚胎心率明顯降低，且呈劑量—毒性效應(yīng)關(guān)系；受精后48小時(shí)胚胎進(jìn)入孵化期，此時(shí)的孵化率結(jié)果發(fā)現(xiàn)氫溴酸檳榔堿可干擾胚胎的正常孵化。

受精后72小時(shí)為斑馬魚發(fā)育過程中的孵化期(突口)，該時(shí)期主要特點(diǎn)為：寬口突出于眼前方，虹膜色素細(xì)胞出現(xiàn)于卵黃帶且覆蓋眼部一半，背部黃色與頭部色調(diào)一致[22]。不同濃度氫溴酸檳榔堿暴露的受精后72小時(shí)的斑馬魚幼魚的形態(tài)發(fā)育過程出現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng)，且呈濃度依賴性。受精后72小時(shí)大部分胚胎孵化完全，此時(shí)的孵化率結(jié)果表明氫溴酸檳榔堿會(huì)干擾胚胎的正常孵化，且濃度越高，孵化率下降越明顯，出膜時(shí)間延遲，發(fā)育停滯，并出現(xiàn)多種嚴(yán)重的畸形。胚胎孵化過程需要消化絨毛膜的酶和機(jī)械力的共同作用。脊柱彎曲主要由于肌肉組織損壞，包括肌肉細(xì)胞壞死以及肌纖維受損，還與鈣離子通道紊亂、脊柱骨原件自身發(fā)生畸形有關(guān)。氫溴酸檳榔堿對(duì)中樞神經(jīng)存在擬膽堿作用，抑制乙酰膽堿介導(dǎo)的效應(yīng)，如抑制骨骼肌收縮等作用機(jī)制可能是孵化率降低和魚體畸形的主要原因。

心臟是胚胎發(fā)育過程中最早發(fā)生并發(fā)揮功能的器官，心率是心臟功能正常與否最直觀的反映。正常斑馬魚幼魚的心率一般在120次/分鐘左右，本研究中對(duì)照組幼魚的心率為120.60±1.38次/分鐘，因此可排除試驗(yàn)中外界環(huán)境和遺傳因素對(duì)斑馬魚心率的影響。與對(duì)照組比較，氫溴酸檳榔堿可明顯提高幼魚的心率。血流量也是毒理研究領(lǐng)域中的一個(gè)非常有價(jià)值的參數(shù)。某些心臟問題由于病因的不同，是無法通過心率來測(cè)定的，需要通過血流量或血流速檢測(cè)才能確定。與對(duì)照組比較，氫溴酸檳榔堿可使幼魚的血流量和平均血流速呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。由于斑馬魚透明，通過顯微鏡可以清晰觀察斑馬魚心臟形態(tài)，斑馬魚心臟的發(fā)育基本在受精后48小時(shí)之內(nèi)完成。受精后30小時(shí)已經(jīng)形成具有完全功能的心室和心房，受精后36小時(shí)心臟發(fā)生環(huán)化，環(huán)化的結(jié)果是心房和心室有部分的重疊，心室在心房的右前側(cè)。靜脈竇(血液進(jìn)入斑馬魚心房，SV)和動(dòng)脈球(血液流出斑馬魚心室，BV)之間的距離將會(huì)發(fā)生改變。兩者之間的大小即SV-BA間距，是評(píng)價(jià)心臟環(huán)化是否正常的指標(biāo)之一，測(cè)量靜脈竇和動(dòng)脈球的間距可用來量化藥物對(duì)斑馬魚心臟毒性影響的程度[23]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氫溴酸檳榔堿可以引起斑馬魚心臟結(jié)構(gòu)的變化，同時(shí)改變斑馬魚幼魚的SV-BA間距，具有心臟毒性。

綜上所述，氫溴酸檳榔堿對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育過程及心臟具有毒性作用，為綜合評(píng)價(jià)檳榔的毒性提供了研究思路，但其更為深入的毒性機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究與實(shí)踐，以期提高檳榔臨床使用和日常食用的安全性。