趙忠福 李曉光 鄒德勛 孫蘭春 姚宏波

1 齊齊哈爾醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院骨外科 （黑龍江 齊齊哈爾 161006）

2 齊齊哈爾醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科 （黑龍江 齊齊哈爾 161006）

3 齊齊哈爾醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院組織胚胎學教研室 （黑龍江 齊齊哈爾 161006）

內(nèi)容提要：目的：闡明細胞炎癥環(huán)境下，銀納米顆粒（AgNP）對人骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSC）增殖和成骨分化的影響及作用機制。方法：150μg/L脂多糖（LPS）建立細胞炎癥模型。在細胞炎癥模型條件下BMSC分為：炎癥對照組、炎癥AgNP組和炎癥Akt抑制劑組。正常環(huán)境下BSMC分為正常對照組和正常AgNP組。各組BMSC均進行21d成骨誘導。再分別以MTT、Western blot檢測各組BMSC增殖吸光度值（A值）和Caspase 3蛋白的表達；ELISA或Western blot檢測各組BMSCs的骨形成蛋白-2（BMP-2）、堿性磷酸酶（ALP）含量或相對表達水平；ELISA檢測各組BMSCs的總超氧化物歧化酶（Total-SOD）和丙二醛（MDA）含量；各組BMSCs均進行茜素紅染色，計算光密度值（OD值）。結(jié)果：相對于正常對照組，正常AgNP組BMSCs的A值明顯升高（P<0.01）；Caspase 3蛋白表達降低（P<0.01）；正常AgNP組BMSCs的BMP-2、ALP、Total-SOD蛋白表達或茜素紅染色OD值均明顯增加（P<0.01），正常AgNP組MDA表達顯著降低（P<0.01）。與炎癥對照組相比，炎癥AgNP組BMSCs的A值明顯提高（P<0.01）；Caspase 3蛋白表達顯著降低（P<0.01）；炎癥AgNP組BMP-2、ALP、Total-SOD表達或茜素紅染色OD值均明顯增加（P<0.01），MDA表達顯著降低（P<0.01）。炎癥Akt抑制劑組的BMP-2、ALP、Total-SOD、MDA表達相對于炎癥AgNP組均呈相反趨勢。結(jié)論：細胞炎癥環(huán)境下，銀納米顆粒通過Akt信號通路提高Total-SOD等抗氧化酶的表達，促進BMSCs增殖和成骨分化。

據(jù)報道，骨關(guān)節(jié)假體、支架材料等骨科植入物感染發(fā)生率至少5.0%[1,2]，骨植入物感染不僅給患者帶來嚴重后果，而且產(chǎn)生高昂的經(jīng)濟負擔[3]。雖然在關(guān)節(jié)假體或骨植入物中添加慶大霉素、萬古霉素等抗生素[4]，但是抗生素嚴重的副作用和細菌耐藥性持續(xù)加劇，生物材料感染率一直居高不下[1,2]。因此，必須建立針對此類生物的充分預防措施。

銀已被用作抗菌劑已有數(shù)百年歷史。銀納米顆粒（Silver nanoparticles，AgNP）穩(wěn)定釋放銀離子。由于Ag2+優(yōu)選結(jié)合至硫、磷等電子供體基團，因此，AgNP能夠與電子傳輸鏈中的含硫代謝酶或與富含磷的DNA相互作用，從而抑制微生物產(chǎn)生或傳遞能量過程[5]。研究發(fā)現(xiàn)，AgNP具有抑制革蘭氏陽性、革蘭氏陰性細菌、真菌和病毒等廣譜抗菌活性[6]，AgNP可被應用于生物材料合成、醫(yī)用材料涂層等領(lǐng)域[7]。

骨髓內(nèi)含有大量骨髓間充質(zhì)干細胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC），BMSC能夠分化為骨或軟骨，BMSCs尚能分化為成骨細胞（Osteoblasts），參與促進骨組織修復和骨折愈合的過程，是硬組織工程研究重要的“種子細胞”[8]。評估細胞炎癥環(huán)境下，AgNP對BMSC增殖、凋亡和成骨分化的影響效果和機制，擴展銀納米顆粒在臨床應用提供理論依據(jù)。

1.資料與方法

1.1 細胞

hBMSCs購自廣州賽業(yè)生物公司。

1.2 主要試劑和儀器

α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清和0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液（Hyclone公司）；10nm銀納米溶液、噻唑藍（MTT）、脂多糖（LPS）、二甲基亞砜、β-甘油磷酸鈉、地塞米松和維生素C（Sigma-Aldrich公司）；Triciribine（Selleck公司）；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒等Western blot試劑（碧云天生物科技公司）；茜素紅染色試劑盒（南京建成試劑公司），人BMP-2、ALP、Total-SOD和MDA的ELISA試劑盒（R&D公司）；小鼠抗人Caspase 3抗體、小鼠抗人BMP-2抗體、小鼠抗人ALP抗體、小鼠抗人GAPDH抗體和辣根過氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）標記的山羊抗小鼠IgG（Abcam公司），增強化學發(fā)光劑（Invitrogen公司）。Spectra Max190酶標儀（Molecular Devices公司）；FACSAria II流式細胞儀（BD公司）；IX53型倒置熒光顯微鏡（Olympus公司）。Tanon 6200發(fā)光成像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)及實驗分組。含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基為BMSC基礎(chǔ)培養(yǎng)基。BMSC基礎(chǔ)培養(yǎng)基含10mmol/L β-甘油磷酸鈉、100μmmol/L地塞米松、0.1mmol/L維生素C則為BMSC成骨培養(yǎng)基。以150μg/L脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）建立細胞炎癥模型。在細胞炎癥模型下培養(yǎng)的BMSCs為炎癥對照組，以5μmol/L AgNP刺激BMSC則為炎癥AgNP組，若添加5μmol/L AgNP和5nmol/L Triciribine則為炎癥Akt抑制劑組。正常培養(yǎng)條件下，無任何刺激培養(yǎng)的BMSCs為正常對照組，以0.01μg/L AgNP處理BMSC則為正常AgNP組。以上各組BMSCs均在37°C，5% CO2下，用BMSC成骨培養(yǎng)基誘導21d。

1.3.2 MTT實驗檢測BMSC吸光度。0.8×104/孔BMSCs加入96孔細胞培養(yǎng)板中，37°C，5% CO2培養(yǎng)12h；按照實驗分組更換BMSC成骨培養(yǎng)基或不同試劑；每孔內(nèi)添加5g/L MTT；37°C，5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)4h，再加入100μL二甲基亞砜，充分震蕩。Spectra Max190酶標儀在490nm波長檢測各組BMSC的吸光度值（Absorbance value，A值）。

1.3.3 Western blot檢測BMSC的Caspase 3、BMP-2、ALP表達。4.0×106各組BMSCs用含1mmol/L苯甲基磺酰氟的RIPA裂解液裂解。4°C，12000r/min離心5min，35μg各組BMSCs蛋白經(jīng)10% SDS-PAGE電泳90min，轉(zhuǎn)至PVDF膜；5%脫脂奶粉封閉60min；分別加入小鼠抗人Caspase 3抗體（1:550）、小鼠抗人BMP-2抗體（1:350）、小鼠抗人ALP抗體（1:500）、小鼠抗人GAPDH抗體（1:800），4°C過夜；加入HRP標記山羊抗小鼠IgG（1:700），室溫孵育60min；增強化學發(fā)光劑顯示蛋白條帶，Tanon 6200發(fā)光成像分析系統(tǒng)顯影。

1.3.4 茜素紅染色檢測BMSC的成骨分化。1.0×106各組BMSCs成骨誘導21d后，0.01mmol/L PBS沖洗3次，每次1min；4%多聚甲醛固定60min，1%茜素紅染色60min，0.01mmol/L PBS漂洗3次，每次1min；IX53顯微鏡觀察各組BMSCs鈣化結(jié)晶的染色效果，Image-Pro Plus 6.0.1圖像軟件分析各組BMSCs的茜素紅染色光密度值（Optical density value，OD）。

1.3.5 酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）檢測Total-SOD、MDA蛋白含量。4.0×106各組BMSCs在37°C，5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)12h，0.01mmol/L PBS清洗3次，每次1min；RIPA裂解液裂解。4°C，10000r/min離心5min，取上清液，人ELISA試劑盒檢測各組BMSCs的Total-SOD、MDA含量[9]。

1.4 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計與分析，計量資料以±s表示，組間比較采用方差分析，兩組間比較采用Q檢驗，P<0.05為差異有顯著性意義。

2.結(jié)果

2.1 AgNP對BMSCs增殖的影響

見圖1。

圖1 各組BMSCs的增殖A值比較（±s，n=15）

2.2 AgNP抑制Caspase 3蛋白表達

見圖2。

圖2 Western blot檢測各組BMSCs的Caspase 3蛋白表達（±s,n=15）

2.3 AgNP促進BMSC茜素紅染色光密度值表達

為了闡明AgNP對BMSC成骨分化的影響，茜素紅染色實驗發(fā)現(xiàn)：茜素紅染色的形態(tài)學實驗提示AgNP能夠促進BMSC分化為成骨細胞（圖3）。

圖3 各組BMSC的茜素紅染色（×100，±s，n=30）

2.4 AgNP對BMP-2、ALP蛋白表達的影響

為了進一步驗證AgNP對BMSC成骨分化的影響，首先檢測成骨特異性蛋白BMP-2、ALP含量（見表1）。接下來，Western blot檢測BMP-2、ALP相對表達情況（圖4）。兩種實驗均證明AgNP促進BMSC分化為成骨細胞，這種促進BMSC分化的作用可被Akt抑制劑阻斷。

表1 各組BMSCs的BMP-2、ALP含量(±s,n=25)

表1 各組BMSCs的BMP-2、ALP含量(±s,n=25)

注：aP<0.01、bP<0.01，與正常對照組比較；cP<0.01、dP<0.01，與正常對照組比較；eP<0.01、fP<0.01，與炎癥對照組比較；gP<0.01、hP<0.01，與炎癥AgNP組比較。

images/BZ_6_1287_1994_2302_2255.png組別 BMP-2(μg/mL) ALP(U/mL)正常對照組 6.751±0.241 7.517±0.455 P P=0.0000 P=0.0000

表2 各組BMSCs的Total-SOD和MDA表達(±s,n=25)

表2 各組BMSCs的Total-SOD和MDA表達(±s,n=25)

注：aP<0.01、bP<0.01，與正常對照組比較；cP<0.01、dP<0.01，與正常對照組比較；eP<0.01、fP<0.01，與炎癥對照組比較；gP<0.01、hP<0.01，與炎癥AgNP組比較。

images/BZ_50_214_1072_1228_1321.png組別 Total-SOD(U/mL) MDA(μg/mL)正常對照組 85.068±1.542 7.095±0.518 P P=0.0000 P=0.0000

圖4 各組BMSC的BMP-2、ALP蛋白表達（±s,n=30）

2.5 AgNP對Total-SOD、MDA蛋白表達的影響

為了進一步驗證AgNP對BMSC影響的分子機制，檢測Total-SOD、MDA氧化酶的表達。結(jié)果提示AgNPC能夠促進BMSC表達Total-SOD，抑制MDA蛋白表達。

3.討論

銀作為非特異性殺菌劑，在治療感染的起著重要作用[10]。銀納米顆粒（AgNP）大小是影響其抗菌活性水平的重要因素[11]。研究顯示，直徑10nm的AgNP有較大的表面積釋放銀離子，殺菌或抑菌效果更顯著，因此本實驗選擇粒徑10nm的AgNP為研究對象。

在細胞炎癥模型下，相對于炎癥對照組，炎癥AgNP組的BMSC增殖A值顯著提高，說明AgNP能夠促進BMSC的增殖活性，其原因可能是由于AgNP具有較好的抗氧化、抑菌，能夠提高細胞內(nèi)抗氧化酶的表達[12]。炎癥AgNP組的Caspase 3蛋白表達降低也間接驗證了AgNP對BMSC具有抗氧化，抑制自由基活性的功能[13]。為了驗證我們的分析，本實驗以ELISA實驗證明了炎癥AgNP組Total-SOD蛋白高表達，使BMSC能夠?qū)寡装Y造成的高自由基環(huán)境。

本實驗利用ELISA實驗發(fā)現(xiàn)：與炎癥對照組相比，炎癥AgNP組MDA表達水平下降，再次表明AgNP在抗自由基損傷中起著重要作用。實驗發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，正常AgNP組BMSC的成骨細胞特異性BMP-2、ALP蛋白含量均顯著高表達；細胞炎癥環(huán)境下，相對于炎癥對照組，炎癥AgNP組BMSC的BMP-2、ALP蛋白含量均呈現(xiàn)升高趨勢，這說明正?；蚣毎装Y環(huán)境下，AgNP均能夠促進BMSC成骨分化。與炎癥AgNP組相比，炎癥Akt抑制劑組BMSC的BMP-2、ALP蛋白含量呈低表達，這些研究結(jié)果說明BMSC在AgNP的作用下具有較好的成骨分化能力。

綜上所述，細胞炎癥環(huán)境下，AgNP激活抗氧化酶，促進BMSC增殖和成骨分化，對提高BMSC抗炎反應，加速骨修復具有較好效果。