楊 坤 劉小帥 李天才 向成權(quán) 趙宇航 饒 強 宋昭彬,

(1. 西華師范大學(xué)生態(tài)研究院, 南充 637002; 2. 四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院四川省瀕危野生動物保護生物學(xué)重點實驗室,成都 610065; 3. 雅礱江流域水電開發(fā)有限公司, 成都 610051; 4. 四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室, 成都 610065)

鱸鯉(Percocypris pingi)隸屬鯉形目、鯉科、鱸鯉屬, 俗稱花鯉、江鯉等, 在岷江、雅礱江和金沙江下段等水系均有分布, 是產(chǎn)區(qū)的重要經(jīng)濟魚類[1]。由于受水利水電工程修建和過度捕撈等影響, 鱸鯉的野生資源明顯衰退[2], 已被列為四川省重點保護魚類及《中國生物多樣性紅色名錄——脊椎動物卷》瀕危物種[3]。為保護和恢復(fù)野外的鱸鯉資源, 在大渡河、雅礱江及金沙江等水域陸續(xù)開展了人工增殖放流。選用合適的方法標記放流魚類,是評價放流效果、監(jiān)測人工增殖放流是否達到預(yù)期效果的重要途徑之一, 但國內(nèi)相關(guān)研究較為薄弱[4], 對于鱸鯉放流更是如此。因而, 迫切需要尋找合適的方法標記放流的鱸鯉。

我國鱸鯉人工增殖放流主要由分布各地的魚類增殖放流站采用當年繁殖、當年或次年放流的方式實施, 放流魚苗規(guī)格小(以全長4—10 cm為主),放流規(guī)模較大(萬尾以上)。切鰭、T型標志、CWT金屬線碼標志、PIT電子標志及DNA分子標記等魚類標記/標志方法, 由于要求魚體規(guī)格大、損傷魚體、價格較高或技術(shù)復(fù)雜等諸多因素, 均不適宜當前鱸鯉的人工增殖放流方式。耳石(Otolith)是真骨魚類內(nèi)耳中以碳酸鈣為主要組分的礦化結(jié)構(gòu), 其結(jié)構(gòu)和組成非常穩(wěn)定, 在整個生活史中不會被破壞或重吸收, 對魚類經(jīng)歷的某些生理和環(huán)境條件(特別是水溫)變化較為敏感且具有一定的規(guī)律性, 因此可以作為一種良好的標記載體[5—7]。熱標記(Thermal marking)和熒光標記(Fluorescent marking)是標記魚類耳石的常用方法, 已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于大規(guī)模標記早期生長階段的魚類[8,9]。一些學(xué)者研究了短須裂腹魚(Schizothorax wangchiachii)[10]、長薄鰍(Leptobotia elongata)[11]、重口裂腹魚(Schizothorax davidi)[12]和胭脂魚(Myxocyprinus asiaticus)[13]等魚類耳石標記, 表現(xiàn)出很好的應(yīng)用前景。本研究基于鱸鯉人工增殖放流的現(xiàn)實需求, 探討鱸鯉早期魚苗(仔魚期和稚魚期)耳石熱標記和熒光標記的可行性, 并嘗試將這2種標記方法結(jié)合使用, 以期為鱸鯉大規(guī)模標記、人工放流群體跟蹤及放流效果評估提供參考。

1 材料與方法

1.1 魚苗來源與管理

鱸鯉仔魚由雅礱江錦屏·官地水電站魚類增殖放流站人工繁育, 本研究的實驗亦在該站完成。為確保日齡和規(guī)格基本一致, 仔魚為一對雌雄親魚的受精卵孵化。仔魚暫養(yǎng)在直徑為1 m的圓柱形不透明玻璃缸中, 保持不間斷微流水和增氧。每天8:00、12:00、16:00和20:00各投喂浮性微顆粒飼料1次; 每天吸取污物1次, 換水約1/3; 每2天徹底換水1次并清洗水槽; 每天8:00、14:00和20:00測量水溫并記錄。

1.2 耳石熱標記

水溫控制使用一個自制的水溫控制系統(tǒng)控制熱標記所需的水溫。該系統(tǒng)每個標記單元由1個室內(nèi)水泥魚池、2個鋼化塑料水箱(水箱a規(guī)格長100 cm×寬80 cm×高80 cm、水箱b規(guī)格長50 cm×寬40 cm×高40 cm)和2個恒溫電加熱棒(電氣參數(shù):控溫20—34℃, 50—60 Hz, 220—240 V, 300 W)組成。加熱棒分別置于2個水箱中, 設(shè)置相同的溫度。魚池高于地面約1 m, 用于沉淀水中的泥沙, 提供“低溫水”。水源來自附近一條長年不斷流的小溪, 溪水在鱸鯉繁殖季節(jié)(每年4—5月份)的溫度7—9℃, 魚池水溫可維持在9—10℃。水箱a用于提供“高溫水”, 水箱b用于盛裝待標記的魚苗。在熱標記實驗中, 當需要高溫水時, 直接開啟水箱b中的加熱棒(設(shè)置溫度21℃)。當需要低溫水時, 先關(guān)閉水箱b中的加熱棒, 然后放掉大約70%的高溫水, 再緩慢(約30min)加入魚池中的低溫水。在高溫水飼養(yǎng)期間, 使用一個100 W白熾燈提供光照; 每隔6h投喂1次標記中的魚苗; 投喂結(jié)束1h后, 清除殘餌及糞便, 并使用水箱a中的高溫水換掉水箱b中約70%的水。在低溫水飼養(yǎng)期間, 不提供光照, 不投喂。實驗通過高低溫交替, 模擬晝夜交替。實驗期間保持不間斷增氧(溶氧7—8 mg/L)。

熱標記方案隨機選取20日齡鱸鯉1200尾,平均分成4組, 使用上述水溫控制系統(tǒng)實施熱標記,將魚苗在高溫水和低溫水中循環(huán)飼養(yǎng), 高溫期水溫(20.8±0.3)℃, 低溫期(10.8±1.2)℃, 水溫波動周期方案見表1。在實驗結(jié)束時, 每組隨機挑選50尾魚苗,保存在99.7%的乙醇中, 以待摘取耳石。

表1 鱸鯉仔魚耳石熱標記方案Tab. 1 Experimental design of otolith thermal marking for larval P. pingi

1.3 耳石熒光標記

熒光染料使用的熒光染料為茜素絡(luò)合物(Alizarin complexone, AC)和茜素紅(Alizarin red S,ARS), 均為分析純粉劑, 由德國Ruibio生產(chǎn), 合肥博美生物科技有限責任公司分裝。根據(jù)實驗方案, 用澄清48h以上的溪水配制成相應(yīng)濃度的熒光染料溶液。

標記方案當完成耳石熱標記后的鱸鯉仔魚生長至35日齡時[全長(21.30±0.45) mm], 從熱標記組1中隨機選取80尾, 從熱標記組2中隨機選取100尾。暫養(yǎng)24h后, 使用AC溶液或ARS溶液浸泡魚體,浸泡時間為24h。45日齡時[全長(28.56±1.03) mm],使用相同條件重復(fù)標記1次。具體標記方案見表2。在實驗期間, 魚苗飼養(yǎng)在21.5 cm(長)×13.5 cm(寬)×6.5 cm(高)的白色塑料水槽中, 貯水(或熒光染料溶液)1 L; 每天8:00、12:00和16:00, 各投喂1次浮性微顆粒飼料(熒光染料溶液浸泡時不投喂); 每天吸取污物1次并換水約1/3, 每2天徹底換水1次并清洗水槽; 保持不間斷增氧; 水溫19.5—21℃。每次熒光染料浸泡結(jié)束后, 將水槽清洗干凈并換上清潔的水, 24h后統(tǒng)計死亡率。第二次標記結(jié)束10d后,將魚體全部保存在99.7%的乙醇中。

表2 鱸鯉耳石熒光標記方案Tab. 2 Experimental design of otolith fluorescent immersion marking for P. pingi

1.4 耳石的摘取與標記檢測

耳石摘取在解剖鏡下, 用解剖針剖開鱸鯉頭骨, 取出3對耳石(微耳石、矢耳石和星耳石), 依次用清水、無水酒精清洗、晾干, 再用中性樹膠封于載玻片上, 于無塵干燥處晾干, 最后貼上標簽。

耳石熱標記檢測使用Olympus BX53顯微鏡和Q-Imaging Retiga 4000R組成的照相系統(tǒng), 在可見光下檢測耳石的熱標記輪紋并拍照。采用宋昭彬[14]的方法測量微耳石輪紋寬度。

耳石熒光標記檢測在Olympus BX40熒光顯微鏡下, 使用10×物鏡, 分別在可見光和綠光(WG)兩種激發(fā)光下檢測耳石的熒光標記。根據(jù)Yang等[11]的方法將熒光標記質(zhì)量分為6個等級:0. 熒光下不能看到標記; 1. 熒光下能看到微弱的標記;2. 熒光下能較容易地看到標記; 3. 熒光下能看到非常明顯甚至耀眼的標記; 4. 熒光下能看到明顯的標記, 普通可見光下也能看到標記; 5. 熒光下能看到明顯的標記, 普通可見光下也能看到非常明顯的標記。當標記質(zhì)量 ≥ 3時, 被稱之為優(yōu)質(zhì)標記。優(yōu)質(zhì)標記的熒光顏色橘紅色或鮮紅色, 色澤飽滿光亮,能夠被快速的讀取到。檢測分2次獨立進行, 當2次結(jié)果出現(xiàn)不一致時, 再進行第3次檢測, 以確定一個唯一的檢測結(jié)果。使用顯微鏡連接的Q-Imaging MicroPublisher 5.0 RTV CCD拍照。

1.5 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)使用Excel 2016初步整理后, 再使用SPSS 19.0對熱標記輪紋寬度進行單因素方差分析(事后檢驗采用S-N-K), 對熒光標記質(zhì)量進行多因素方差分析(事后檢驗采用LSD)。

2 結(jié)果

2.1 耳石熱標記

鱸鯉微耳石形態(tài)規(guī)則, 輪紋最為明顯, 矢耳石和星耳石輪紋則不易辨別; 在高溫水飼養(yǎng)期間, 微耳石上沉積寬而透明的明帶, 低溫期間形成窄而暗的暗帶; 在不同的水溫波動模式之間, 微耳石輪紋增長的寬度和數(shù)量存在差異(圖1)。高溫期持續(xù)時間不同, 微耳石輪紋的寬度差異極顯著(One-way-ANOVA: S-N-K,P<0.01; 表3), 輪紋寬度(Increment width of lapilli,IW)與高溫水飼養(yǎng)持續(xù)時間(T)呈顯著線性關(guān)系, 回歸方程是IW=0.16462+0.24762T(n=450,R2=0.91865,P<0.01)。

圖1 鱸鯉微耳石上的熱標記Fig. 1 Lapillus of P. pingi larvae, showing the thermal marks

表3 鱸鯉仔魚微耳石熱標記輪的寬度Tab. 3 Increment widths of thermal marks on lapilli of P. pingi

2.2 AC熒光標記

在綠光下, AC重復(fù)標記的耳石均能觀察到2個橘紅色的標記環(huán)(圖2); 在同樣的標記條件下, 微耳石的標記質(zhì)量最高, 矢耳石次之, 星耳石標記質(zhì)量較低且不穩(wěn)定(圖3); 在可見光下, 能觀察到微耳石上的熱標記特征輪紋(圖2)。方差分析(Three-way-ANOVA: 只考慮主效應(yīng), 事后檢驗LSD)顯示, 標記質(zhì)量受AC濃度影響顯著(P<0.05), 微耳石、矢耳石和星耳石間的標記質(zhì)量差異顯著(P<0.05), 不過, 標記質(zhì)量受鱸鯉全長的影響不顯著(P=0.217; 表4)。在首次標記時, 與對照組相比, AC標記的鱸鯉死亡率極低。再次標記時, 則沒有出現(xiàn)死亡(表5)。

表4 AC標記鱸鯉的標記質(zhì)量方差分析Tab. 4 The results of ANOVA test on mark quality of P. pingi marked by AC

表5 AC標記鱸鯉的死亡率Tab. 5 Mortality of P. pingi marked by AC (%)

圖2 AC標記的鱸鯉微耳石Fig. 2 Lapillus of P. pingi marked by AC

2.3 ARS熒光標記

在綠光下, ARS重復(fù)標記的耳石均能觀察到兩個橘紅色標記環(huán)(圖4); 在同樣的標記條件下, 微耳石、矢耳石和星耳石的標記質(zhì)量都很高, 均≥4(圖3);在可見光下, 能觀察到微耳石上的熱標記特征輪紋(圖4)。方差分析(Three-way-ANOVA: 只考慮主效應(yīng), 事后檢驗LSD)結(jié)果顯示, 標記質(zhì)量受全長和ARS濃度影響不顯著(P>0.05), 微耳石、矢耳石和星耳石間的標記質(zhì)量差異顯著(P<0.05; 表6)。

表6 ARS標記鱸鯉的標記質(zhì)量方差分析Tab. 6 The results of ANOVA test on mark quality of P. pingi marked by ARS

圖3 AC和ARS標記鱸鯉的標記質(zhì)量Fig. 3 Mark quality of P. pingi marked by AC and ARS

圖4 ARS標記的鱸鯉微耳石Fig. 4 Photographs of lapullus of P. pingi marked by ARS

在首次標記時, 與對照組相比, ARS標記的鱸鯉死亡率極低。重復(fù)標記時, 使用200 mg/L濃度的組出現(xiàn)了高達75%的死亡率, 其他濃度組則沒有出現(xiàn)死亡(表7)。

表7 ARS標記鱸鯉的死亡率Tab. 7 Motalities of P. pingi marked by ARS (%)

3 討論

3.1 鱸鯉耳石標記的合適條件

魚類耳石標記的安全性是人們非常關(guān)注的問題。熱標記通過人為調(diào)控胚胎或仔魚飼養(yǎng)水體在“高溫”和“低溫”之間周期性地交替來實現(xiàn)[15]?！案邷亍焙汀暗蜏亍辈粌H要在魚類正常承受范圍之內(nèi), 而且其差值及處理時間也要合適[15,16]。在一般情況下, 高低溫之差不低于2℃, 處理時間4h以上, 耳石上就能形成較為明顯的輪紋[15]。在自然水域中, 由于早期生活史階段往往經(jīng)歷著水溫晝夜劇烈變化等惡劣的水文條件, 魚類自身應(yīng)已經(jīng)具備相應(yīng)的抵御能力[17]。在本研究中, 標記的高低溫之差達10℃,魚苗游動、攝食等活動正常, 也沒有死亡發(fā)生, 微耳石上形成的輪紋非常規(guī)律且清晰。不過, 僅僅形成清晰的輪紋還不夠, 熱標記輪紋還必須與自然形成的輪紋區(qū)別明顯。在實際觀察中發(fā)現(xiàn), 高溫期12h形成的輪紋, 容易與自然水溫波動形成的輪紋混淆, 24h以上的高溫期處理形成的輪紋更寬則不易混淆, 也更容易在顯微鏡下快速識別。但高溫處理時間越長, 則越容易因溫度異常波動形成非目的輪紋, 不利于標記識別。根據(jù)本研究的結(jié)果, 熱標記鱸鯉的高溫期處理時長以24—72h為宜。

人們對耳石標記技術(shù)的擔憂主要源于熒光標記。研究表明, 熒光染料對魚體有一定毒性,在浸泡過程中魚體會出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng), 造成機體損傷, 甚至死亡[18—20]。熒光染料對魚體造成的機體損傷(尤其是死亡率), 受熒光染料的種類、濃度、浸泡時間、魚類種類和魚體規(guī)格等多種因素的影響, 但標記質(zhì)量也同時受到這些因素的影響[9]。在一般情況下, 標記造成的死亡率和標記質(zhì)量隨著熒光染料溶液濃度的增加和浸泡時間的延長而上升, 隨著魚體規(guī)格的增長而降低[11]。本研究結(jié)果也基本與此相符。因而, 熒光標記在早期生長階段標記質(zhì)量最佳,但此時魚體也最為脆弱, 需謹慎地選擇標記條件,以減少魚體損傷。

在本研究中, 用AC和ARS首次標記鱸鯉時, 均出現(xiàn)不同程度死亡, 意外的是對照組死亡率也很高。檢查死亡魚體發(fā)現(xiàn)了大量斜管蟲, 寄生蟲會造成魚體抵抗力下降, 這可能是各組死亡率異常升高的真正原因。因此, 本研究認為溶液濃度不高于200 mg/L、浸泡時間不高于24h時, AC和ARS對鱸鯉早期魚苗影響較小, 標記質(zhì)量也很高。在稀有鯽(Gobiocypris rarus)[21]、胭脂魚[13]、滇池金線鲃(Sinocyclocheilus grahami)[22]和唐魚(Tanichthys albonubes)[23]等魚類的標記研究中, 較為安全的標記濃度多為50—150 mg/L?；魜斫璠20]在研究ARS標記中華倒刺鲃幼魚時發(fā)現(xiàn), 低濃度的ARS會激活機體抗氧化防御系統(tǒng), 對魚體造成的損傷能夠得到很快恢復(fù), 濃度過高則發(fā)生抑制作用且很難恢復(fù)。在本研究中, 使用相同的條件于10d后再次標記鱸鯉時(魚體已更為健壯), ARS溶液濃度200 mg/L的組出現(xiàn)了極高的死亡率。檢查死亡魚體并沒有發(fā)現(xiàn)寄生蟲或其他明顯外部損傷。因此, 本研究認為,200 mg/L的ARS溶液對鱸鯉早期魚苗造成的損傷需要較長時間恢復(fù), 實際應(yīng)用時不應(yīng)高于這個濃度。由于大規(guī)模應(yīng)用時, 魚體規(guī)格和健康程度不可能完全一致, 標記條件適用性必須更為廣泛。結(jié)合短須裂腹魚等魚類的大規(guī)模標記經(jīng)驗[10], 本研究推薦AC或ARS標記鱸鯉早期魚苗的合適條件為: 溶液濃度50—100 mg/L, 浸泡時間24h。這樣既可以保證標記效果, 又不會對魚體造成明顯負面影響。

3.2 ARS和AC在耳石熒光標記中的應(yīng)用前景分析

在本研究中, 使用AC和ARS溶液第一次標記鱸鯉時, 各處理組死亡率都較低(ARS組略高于AC組), 但10d之后再次標記時, AC組均沒有出現(xiàn)死亡, ARS 溶液200 mg/L這組卻出現(xiàn)了75%的死亡率。這表明AC對鱸鯉早期魚苗毒性比ARS低一些。Beckman和Schulz[24]標記白胭脂魚(Catostomus commersoni)和另外2種鯉科魚類(Campostoma anomalum和Phoxinus erythrogaster)也有著相似的結(jié)果。趙亞鵬等[22]對滇池金線鲃的研究卻顯示,ARS組的死亡率明顯低于AC組。ARS和AC在不同魚類中表現(xiàn)出的毒性差異, 可能是物種等因素造成的[9]。不過, 這2種熒光染料在合適的條件下均是相對低毒的。本研究還發(fā)現(xiàn), 在相同的條件下, 3種耳石的標記質(zhì)量存在較大差異, 這可能是ARS和AC兩種熒光物質(zhì)被鱸鯉吸收并沉積在耳石上的速率不同造成的?？傮w上看, ARS標記質(zhì)量明顯比AC高, 均為優(yōu)質(zhì)標記。市場上AC價格較貴, 而ARS則便宜得多, 并且ARS也更易溶解于水中。因此, 使用低濃度的ARS浸泡鱸鯉早期魚苗是更經(jīng)濟和更具應(yīng)用前景的標記方式[9]。

3.3 耳石熱標記和熒光標記的結(jié)合應(yīng)用

耳石熱標記在鮭魚增殖放流中已有二十多年的大規(guī)模應(yīng)用歷史, 發(fā)展出了如莫爾斯碼[25]、條形碼[26]和“RBr”編碼[27]等多種熱標記模式管理方法,實際可用的熱標記模式大約有100種[28]。豐富的標記模式不僅可以滿足區(qū)分不同放流時間、不同放流地點或者不同魚類增殖站等研究需求, 也有助于系統(tǒng)化的魚類標記放流管理。不過, 識別熱標記時需要將耳石精確打磨成薄片。處理大小不一和形態(tài)多樣的耳石不僅非常費時費力, 耳石在打磨時也很容易損壞, 而且識別熱標記時還有著很高的錯誤率[29,30]。Volk等[15]將耳石熱標記識別錯誤分為2個類型, 一是把沒有熱標記的個體識別為有標記, 二是把熱標記模式錯誤歸類, 但卻未給出很好的解決辦法。

熒光標記的實施操作簡單, 標記識別容易, 甚至不需要打磨耳石[10,31]。但是, 熒光標記可供選擇的標記模式很少, 一般只能簡單地增加標記次數(shù)[8]。不過, 標記次數(shù)增加非常有限且存在毒性累積風險。一些學(xué)者曾將熒光標記用于研究魚類耳石增長[32]和日輪確證[33]。從另一個角度看, 這實際上是將熒光標記和熱標記結(jié)合了起來。在本研究中, 先后使用熱標記和熒光標記2種方法標記鱸鯉早期魚苗, 2種標記在耳石上均能清晰識別。2種標記方法共同使用, 識別標記時, 就可以先將3對耳石中的1—2顆用于檢測是否存在熒光標記。當發(fā)現(xiàn)有熒光標記時, 再將其他耳石按熱標記識別的方式處理。這樣不僅有助于減少打磨耳石的工時耗費, 提高工作效率, 還有助于避免把無熱標記個體識別為有標記, 同時還解決了熒光標記模式較少的問題,從而在一定程度上彌補單獨使用一種標記方法的不足。