吳應碧,鄭 艷,余 林,賈燁菻,應麗娟,楊婷婷,徐金艷,李福平

四川大學華西第二醫(yī)院生殖男科/出生缺陷與相關婦兒疾病教育部重點實驗室，四川成都 610066

目前生育率下降已經成為一個大趨勢[1-2]，全世界不孕不育發(fā)病率為8%～12%，由男性因素導致的不育占40%～50%[3-4]。精液分析為評估男性生育力最基本的檢測項目，在男性不育的診斷、治療和科研中具有極其重要的作用[5]。精液分析與其他檢驗項目比較，精液標本黏稠度高、非勻質性且其檢測是在運動狀態(tài)下進行，導致精液分析檢測結果變異系數(CV)較其他檢驗項目大，實驗室間的精液檢測結果可比性差[6-9]。室間質量評價可增加精液分析實驗室間結果的可比性，但目前國內精液分析室間質量評價整體開展較差，國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心室間質量評價項目中無精液分析項目，部分地區(qū)如廣東省[6]進行了精液分析室間質量評價的初步探索，但還未形成有效的方案，國內精液分析室間質量評價整體需要加強。目前四川地區(qū)精液分析整體現狀發(fā)展滯后，實驗室間結果可比性差[10]，缺乏室間質量評價。所以，本研究擬在四川地區(qū)開展精液分析的室間質量評價活動，探索建立四川地區(qū)精液分析室間質量評價體系，分析各實驗室間精液分析結果的差異，為提高四川地區(qū)整體精液分析結果的準確性及可比性提供依據。

1 資料與方法

1.1參與室間質量評價單位 四川地區(qū)共17家實驗室參與本次室間質量評價，涵蓋四川地區(qū)6個市(成都市、綿陽市、攀枝花市、遂寧市、雅安市及達州市)，其中包括9家檢驗科、5家生殖中心及3家男科實驗室。

1.2質控品標本來源 用于室間質量評價的精液標本在四川省人類精子庫收集。在獲得健康志愿者知情同意后收集其精液，志愿者在精液收集前進行乙型肝炎表面抗原、抗丙型肝炎抗體、抗梅毒螺旋體抗體、人類免疫缺陷病毒抗原/抗體檢測，結果均為陰性。

1.3精子濃度質控品的制備 選取精子濃度在(10～100)×106/mL、30 min內液化、黏稠度正常、圓細胞濃度<1.0×106/mL的精液標本，將精液充分混合后，按每毫升精液中加入100 μL 10%(v/v)甲醛溶液充分混勻，分裝于冷凍管中，密封管口，并在冷凍管外壁貼上質控品批號等標識，置于4 ℃冰箱儲存。參照CNAS-GL05做均勻性評價，經ANOVA方差分析樣品內及樣品間無顯著差異，樣品是均勻的。

1.4精子活力質控品的制備 選取兩份不同活力級別的精液標本，采用計算機輔助精子分析系統(tǒng)(CASA)分別錄制數個15 s的視頻，錄制視頻數(即采集視野數)以能評估到至少200個精子為限，計數前向運動精子比例。將兩個標本的所有視頻分別作為精子活力質控品1及活力質控品2。

1.5精子形態(tài)質控品的制備 選取10份濃度>15×106/mL的精液標本制作10張形態(tài)涂片，經改良巴氏染色后，1 000倍油鏡下選取精子分布均勻的視野，采用高清攝像頭采集圖片，從上述10張涂片采集的圖片中隨機選取100個頭部和尾部完整的精子并標記編號。

1.6質控品發(fā)放 將精子濃度、活力及形態(tài)質控品統(tǒng)一發(fā)放給參評單位，48 h內按照各自實驗室日常精液分析檢測方法分析質控品，并反饋分析結果。

2 結 果

2.1各參評實驗室一般概況 四川地區(qū)共17家實驗室參與本次室間質量評價，其中15家(88.24%)實驗室反饋了檢測結果，包括7家檢驗科、5家生殖中心及3家男科實驗室。其中15家反饋精子濃度檢測結果，14家反饋精子活力及精子形態(tài)檢測結果。

2.2實驗室檢測方法比較 各實驗室中濃度檢測使用最多的方法為CASA檢測，活力檢測使用最多的方法為人工檢測，形態(tài)檢測全為人工檢測，見表1。

表1 實驗室檢測方法及計數板類型結果比較[n/n(%)]

2.3實驗室使用計數板類型比較 15家實驗室中8家(53.33%)使用計數板類型為Makler計數板，各1家(6.67%)分別使用Macro計數板、精子計數池、紅寶石計數板及牛鮑計數板，3家(20.00%)使用計數板類型不清楚。

2.4實驗室精子濃度結果比較 15家實驗室精子濃度質控品檢測結果的CV值為29.84%，將濃度檢測方法分為CASA方法及其他(人工和全自動)方法，CASA方法CV值(23.96%)低于其他方法CV值(43.16%)。將檢測濃度使用計數板深度分為10 μm及非10 μm(3家100 μm、1家20 μm、1家15 μm)，10 μm的計數板濃度檢測結果CV值(24.82%)明顯低于非10 μm濃度檢測結果CV值(42.66%)，見表2。

表2 15家實驗室精子濃度結果比較

2.5實驗室精子活力結果比較 14家實驗室中，活力質控品1和2的前向運動精子比例的CV值分別為18.30%及12.97%，將活力檢測方法分為人工方法及CASA方法，CASA方法檢測前向運動精子的CV值明顯低于人工方法，見表3。

表3 參評實驗室前向運動精子結果比較

2.6實驗室精子形態(tài)結果比較 14家實驗室中，正常精子形態(tài)百分比的CV值較高，為72.13%。在對100個精子的形態(tài)評估中，僅有34.00%(34/100)的正?；虍惓＞铀袑嶒炇以u估結果一致，68.00%(68/100)的精子評估結果不一致。異常形態(tài)精子中，過量殘留胞漿的CV值最高(96.71%)，見表4。頭部缺陷精子中空泡異常的CV值最高，為65.32%，頸部和中段缺陷中彎曲缺陷的CV值最高，為139.45%，主段缺陷中卷尾缺陷的CV值最高，為115.45%，見表5。

表4 參評實驗室精子形態(tài)質控品評估結果比較

表5 參評實驗室精子形態(tài)不同部位異常結果比較

3 討 論

本次室間質量評價的質控品均在各參評實驗室進行檢測，且均由從事精液分析的技術人員按照日常分析方式進行檢測，可反映該實驗室實際精液分析水平。本次室間質量評價活動雖涵蓋四川地區(qū)6個市，但僅15家實驗室反饋了檢測結果，因此該結果僅反映部分四川地區(qū)醫(yī)療單位精液分析室間質量評價水平。本研究為首次在四川地區(qū)開展精液分析的室間質量評價活動，雖參評實驗室規(guī)模不大，但在此次組織開展室間質量評價活動中，累積了如何組織參評實驗室、如何制訂參評項目及如何制備與分發(fā)質控品等方面的經驗，為后續(xù)大規(guī)模推動四川地區(qū)精液分析室間質量評價活動打下基礎。

此次15家反饋了檢測結果的單位中有7家(46.67%)在檢驗科進行精液分析，有文獻提到，多數檢驗科精液分析是按照《全國臨床檢驗規(guī)程》標準進行[11]，但《全國臨床檢驗規(guī)程》中精液分析的項目、檢測方法及參考值更新較慢，與世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的精液分析標準有差異。目前全國推薦精液分析參考標準使用《WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen》第5版[12](以下簡稱WHO第5版)，因為該手冊詳細介紹了精液分析不同項目的具體操作、方法、儀器、參考值及質量控制措施等。

此次室間質量評價15家實驗室精子濃度質控品檢測結果的CV值較高(29.84%)。國內外文獻報道的精子濃度檢測結果CV值也較高，比利時[13]文獻中CV值為19.2%，國內廣東省[6]文獻中CV值為34.09%，意大利[9]文獻中的CV值分別為46.65%、59.03%和75.14%。分析精子濃度檢測結果的CV值高于其他檢驗項目的原因可能為各實驗室參考標準、使用方法及操作等不一致，如加樣前混勻次數及混勻方式不一致。15家實驗室中使用CASA方法檢測精子濃度的CV值為23.96%，低于其他方法檢測的CV值(43.16%)。對于精子濃度和活力分析，CASA結果較人工分析方法更客觀準確，但不同的CASA分析儀器由于其分析原理不同、幀率不同、配備的精子計數池深度不同，結果會有很大差異[14-15]，仍需注意使用和評估各類型的CASA。不同計數板深度對精液分析結果也會產生影響，精子計數板深度與前向運動精子呈負相關，精子計數板深度與濃度結果呈正相關[16-17]。CASA計數精子時建議使用深度為10 μm的計數板，目的是確保精子既形成單層分布又能自由活動，從而保證視野內所有的精子都能被軟件捕捉識別。

活力質控品1和2前向運動精子比例的CV值分別為18.30%和12.97%，均小于20%，較濃度及形態(tài)的CV值低，這一結果可能是由于活力質控品為視頻，不需要各實驗室分析前進行任何處理，從而降低了檢測的誤差和CV值。CASA檢測前向運動精子比例的CV值明顯低于人工方法，提示CASA較人工方法分析更客觀，有更低的變異性。

本研究中，正常精子形態(tài)百分比的CV值為72.13%，國內廣東省文獻中精子形態(tài)的CV值為62.01%[6]，比利時[13]及意大利[9]文獻中的CV值分別為79.4%及80%，精子形態(tài)的CV值遠高于濃度及前向運動精子比例的CV值，分析原因可能主要為：(1)不同實驗室參考標準不一致，在WHO的連續(xù)幾個版本中，評估標準的變化及臨界值的變化造成檢測人員對精子形態(tài)理解不一致；(2)由于14家實驗室全部采用人工方法進行形態(tài)分析，人為主觀意識強，缺乏客觀性，同一實驗室不同人員對同一精子的認識均存在差異，對處于臨界形態(tài)的精子，同一技術人員兩次分析也可能存在不一致結果等。FILIMBERTI等[9]文獻中對參評實驗室進行形態(tài)教學課程后，形態(tài)CV值較教學前明顯下降，證實了形態(tài)教學課程的重要性。

在異常精子形態(tài)中，頭部缺陷較其他缺陷CV值低，過量殘留胞漿CV最高，為96.71%。頭部缺陷中空泡異常的CV值最高(65.32%)，頸部和中段缺陷中頸部彎曲缺陷CV值最高(139.45%)，主段缺陷中卷尾缺陷CV值最高(115.45%)，考慮原因首先可能為多數實驗室更關注頭部缺陷，尤其注重頭部缺陷中精子外形及頂體大小的缺陷，而對其他缺陷類型(如空泡及彎曲等)關注及認識較少。其次，WHO第5版中對不同缺陷未給出具體定義，如卷尾的尾部需要卷曲到什么程度才能判斷為卷尾，是否需要>360°才判斷為卷尾；頸部彎曲未定義具體彎曲角度等，致使各實驗室對精子形態(tài)有不同的理解及判斷標準等。

綜上所述，四川地區(qū)精液分析室間質量評價中，前向運動精子比例CV值最低，其次為濃度CV值，正常精子形態(tài)百分比CV值最高。為使四川地區(qū)不同實驗室精液分析結果具有可比性，建議采取如下措施：首先建議各實驗室采用WHO第5版作為實驗室精液分析參考標準，參考該標準并結合實驗室實際情況選擇適合的方法和儀器設備，建立標準化操作程序，對于主觀性強的精子形態(tài)分析可首先做好實驗室內部人員比對，如采取共同閱片統(tǒng)一認識等方法。筆者希望通過本研究摸索建立精液分析的室間質量評價體系，推進各實驗室精液分析技術的標準化操作及室內質量控制，提高四川地區(qū)各實驗室檢測水平，建立四川地區(qū)精液分析室間質評體系，最終達到實驗室間精液分析結果互認。