袁世梅,楊 偉,魏進(jìn)武,廖俐雅,余登瓊,左崇宇,余曉輝,宋 仁,熊中政

重慶市墊江縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶 408300

幽門螺桿菌最初于消化性潰瘍和慢性胃炎患者胃黏膜中發(fā)現(xiàn)，是一種微需氧的革蘭陰性菌。通過(guò)親密接觸、口-口和糞-口等途徑傳播，幽門螺桿菌已成為全球感染范圍最廣的細(xì)菌之一[1]。近年來(lái)大量研究證明，除消化性潰瘍和慢性胃炎外，幽門螺桿菌感染還與胃部腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切[2]。此外，神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)及皮膚、眼科等非消化系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中也可見(jiàn)幽門螺桿菌的介導(dǎo)作用[3-4]。因此，積極治療幽門螺桿菌感染對(duì)保護(hù)患者身體健康具有重要意義。幽門螺桿菌感染的準(zhǔn)確診斷是治療的先決條件，目前臨床幽門螺旋菌感染的診斷常采用14C尿素呼氣試驗(yàn)、內(nèi)鏡及血清學(xué)檢查，但這幾種方法檢測(cè)的準(zhǔn)確性尚達(dá)不到臨床預(yù)期。細(xì)菌培養(yǎng)雖準(zhǔn)確性較高，但檢查周期長(zhǎng)。故本研究擬對(duì)疑似幽門螺旋菌感染患者采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，以探究是否能為臨床篩查提供優(yōu)化方案。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性選擇重慶市墊江縣人民醫(yī)院2018年9月至2020年5月收治的臨床表現(xiàn)為上消化道癥狀患者197例，其中男103例，女94例；年齡23～64歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)有不同程度的反酸、噯氣、用餐后腹痛腹脹等消化道癥狀；(2)接受內(nèi)鏡胃活組織檢查；(3)能明白醫(yī)生指令配合完成檢查。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并內(nèi)鏡檢查禁忌證；(2)肝、膽及胰腺疾病確診；(3)合并胃癌或其他惡性腫瘤；(4)入組前2周內(nèi)有抗菌藥物、抑酸劑、抗凝劑用藥史。本研究符合重慶市墊江縣人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)相關(guān)規(guī)定并獲得開(kāi)展批準(zhǔn)，所有受試者及家屬對(duì)研究流程充分了解并自愿簽署知情同意書。

1.2檢驗(yàn)及判斷方法

1.2.1內(nèi)鏡檢查 受試者受檢前6 h禁食，2 h禁水，給予受試者去泡劑(四川省自貢鴻鶴制藥有限公司)口服，若受試者有需求且無(wú)麻醉禁忌證，在其自愿簽署麻醉告知書后可給予無(wú)痛內(nèi)鏡檢查。所有受試者由具有獨(dú)立操作資質(zhì)的同級(jí)別內(nèi)鏡醫(yī)生進(jìn)行檢查，采用電子放大內(nèi)鏡結(jié)合LUCERA CLV-260內(nèi)鏡系統(tǒng)(OLYMPUS公司)進(jìn)行檢測(cè)。參照內(nèi)鏡檢查標(biāo)準(zhǔn)，打開(kāi)聯(lián)動(dòng)成像模式將內(nèi)視鏡經(jīng)食道放至胃竇，再緩慢退鏡依次觀察胃竇胃體交界處、胃體、胃角和胃底。取受試者胃部發(fā)紅部位及發(fā)黃部位胃黏膜組織，若無(wú)明顯發(fā)紅部位則只取一個(gè)部位的標(biāo)本，每例受試者標(biāo)本分為兩份，妥善封存。借助Pipette取色軟件測(cè)量每例受試者所有取樣周圍5 cm直徑圓圈內(nèi)R、G、B值，再根據(jù)所得的均值計(jì)算R/(G+B)，當(dāng)R/(G+B)≥0.967提示幽門螺桿菌感染陽(yáng)性[5]。

1.2.214C尿素呼氣試驗(yàn) 受試者受檢前2 h禁食，取一粒14C尿素膠囊(深圳市中核海得威生物科技有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20068129，規(guī)格：2.78×10-2MBq(0.75×10-3MCi)/?！?0粒)，受試者溫水送服，靜坐0.5 h后取一加蓋樣品管收集受試者呼氣標(biāo)本，待樣品管中捕集液由紫色變?yōu)闊o(wú)色提示標(biāo)本收集完成。采用幽門螺桿菌測(cè)試儀(深圳海得威公司，型號(hào)：HUBT-20P)檢測(cè)呼氣樣本中每1 mol二氧化碳每分鐘衰變指數(shù)，當(dāng)衰變指數(shù)≥50，則判斷為幽門螺桿菌感染陽(yáng)性[6]。

1.2.3血清學(xué)檢測(cè) 抽取受試者靜脈血4 mL，采用離心機(jī)(湖南長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司，型號(hào)：L535)分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)幽門螺桿菌IgG抗體，試劑盒購(gòu)于美國(guó)PBM公司。當(dāng)IgG抗體滴度≥20 U/mL提示幽門螺桿菌感染陽(yáng)性[7]。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 將受試者胃黏膜組織充分剪碎、研磨，采用RNA提取試劑盒提取標(biāo)本中的總RNA，加入引物，引物序列：上游5′-TCTGTCGCAAGCTGGCATCGT-3′,下游5′-TCCATAACATGCTCTCATCAT-3′。依次經(jīng)預(yù)變性(94 ℃，3 min)、變性(90 ℃，1 min)、退火(65 ℃，1 min)、延伸(68 ℃，1.5 min)處理，重復(fù)退火及延伸操作39次以增加產(chǎn)物量。以GAPDH作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算幽門螺桿菌DNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.5細(xì)菌培養(yǎng) 將受試者胃黏膜組織接種至哥倫比亞血培養(yǎng)基。將培養(yǎng)基置于微需氧環(huán)境中恒溫(37 ℃)培養(yǎng)，4 d后觀察菌落形態(tài)。幽門螺桿菌感染陽(yáng)性表現(xiàn)為：菌落呈細(xì)小針尖樣，部分融合成片，無(wú)色透明，表面濕潤(rùn)且光滑。采用革蘭染液對(duì)菌落染色，油鏡下鏡檢幽門螺桿菌感染陽(yáng)性表現(xiàn)為：顏色呈紅色，形狀呈典型海鶴狀或弧形。本研究將細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果作為檢測(cè)幽門螺桿菌感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)或百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用受試者工作特征(ROC)曲線對(duì)幾種方法的檢驗(yàn)效能進(jìn)行分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1“金標(biāo)準(zhǔn)”檢驗(yàn)結(jié)果 細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果顯示，幽門螺桿菌感染陽(yáng)性受試者129例，陰性68例，陽(yáng)性率為65.48%。

2.2各方法診斷幽門螺桿菌感染的ROC曲線分析 內(nèi)鏡檢查、14C尿素呼氣試驗(yàn)、血清學(xué)檢查、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)幽門螺桿菌感染的ROC曲線下面積依次為0.756、0.838、0.939與0.985，其中PCR的曲線下面積最大。見(jiàn)表1、圖1。

表1 不同檢驗(yàn)方法對(duì)幽門螺桿菌檢驗(yàn)效能比較

圖1 各方法檢測(cè)幽門螺桿菌感染效能的ROC曲線分析

2.3各方法檢驗(yàn)結(jié)果與“金標(biāo)準(zhǔn)”檢驗(yàn)結(jié)果比較 內(nèi)鏡檢查、14C尿素呼氣試驗(yàn)、血清學(xué)檢查、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)幽門螺桿菌感染的靈敏度依次為72.87%、88.37%、90.69%、94.57%，特異度依次為69.12%、72.06%、85.29%、95.59%，準(zhǔn)確率依次為71.57%、82.74%、88.83%、94.92%，其中實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的準(zhǔn)確率明顯高于內(nèi)鏡檢查、14C尿素呼氣試驗(yàn)及血清學(xué)檢查，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=38.512、14.737、4.898,P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 不同檢驗(yàn)方法與細(xì)菌培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果對(duì)比

3 討 論

幽門螺桿菌是最常見(jiàn)的病原菌之一，全球約一半的人口為其感染者。流行病學(xué)顯示，亞洲人群中幽門螺桿菌感染率明顯高于歐美人群，這可能與亞洲家族聚居習(xí)慣及幽門螺桿菌傳染方式有關(guān)。我國(guó)幽門螺桿菌感染人口呈逐年上升趨勢(shì)[8]。全球多個(gè)研究中心均證實(shí)，幽門螺桿菌感染與消化道疾病密切相關(guān)，近年來(lái)證實(shí)，神經(jīng)、血液、心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生與幽門螺桿菌感染有關(guān)[4-9]。準(zhǔn)確診斷幽門螺桿菌感染，對(duì)后期治療及抑制感染的傳播具有積極意義。

目前，臨床診斷幽門螺桿菌感染的常用方法有細(xì)菌培養(yǎng)、內(nèi)鏡檢查、血清學(xué)試驗(yàn)及14C尿素呼氣試驗(yàn)等，前二者屬于侵入性檢測(cè)，后二者屬于非侵入性檢測(cè)。內(nèi)鏡檢測(cè)是指將帶有鏡頭的軟管經(jīng)咽喉置入胃中，該方法可直接觀測(cè)到胃部黏膜狀態(tài)，并根據(jù)黏膜是否異常紅腫這一征象，間接判斷是否有幽門螺桿菌感染[10]。該方法可較快速得出結(jié)論，但對(duì)于部分受檢者較痛苦，且胃部情況觀察及結(jié)果判斷受操作醫(yī)生主觀影響較大，檢查靈敏度及特異度較低。細(xì)菌培養(yǎng)是將受試者胃黏膜標(biāo)本置于微氧恒溫的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中以模擬其在胃內(nèi)的生存環(huán)境，根據(jù)培養(yǎng)菌落的外形特點(diǎn)及革蘭染色結(jié)果對(duì)幽門螺桿菌感染情況進(jìn)行判斷。細(xì)菌培養(yǎng)靈敏度及準(zhǔn)確度均可達(dá)到95%以上[11]。且細(xì)菌培養(yǎng)可用于藥敏檢測(cè)，對(duì)臨床合理選擇抗菌藥物提供依據(jù)[12]。但細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間周期較長(zhǎng)，檢測(cè)過(guò)程中可能因標(biāo)本質(zhì)量不佳、受其他雜菌污染、運(yùn)輸及儲(chǔ)存不當(dāng)而影響檢測(cè)結(jié)果。本研究采用的血清學(xué)檢測(cè)方法為ELISA法，通過(guò)既有特定試劑盒對(duì)受試者血清中的幽門螺桿菌抗體進(jìn)行檢測(cè)，操作較簡(jiǎn)便；但血清學(xué)抗體檢驗(yàn)不能區(qū)分既往感染和現(xiàn)癥感染，故其在臨床中的應(yīng)用受到一定限制[13]。14C尿素呼氣試驗(yàn)憑借其操作簡(jiǎn)便、結(jié)果可靠度較高等特點(diǎn)，成為臨床應(yīng)用最廣泛的幽門螺桿菌感染檢測(cè)方法之一。其操作過(guò)程對(duì)受試者而言痛苦較小，但檢測(cè)過(guò)程中口服的14C膠囊具有放射性，對(duì)幼兒、孕婦及有懷孕計(jì)劃的育齡期受試者并不適用[14]。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)以熒光物質(zhì)作為標(biāo)記，在DNA擴(kuò)增過(guò)程中檢測(cè)每次PCR循環(huán)后目的DNA的表達(dá)量，并通過(guò)特定內(nèi)參定量分析[15]。目前，實(shí)時(shí)熒光定量PCR在臨床已被廣泛應(yīng)用，在肝炎、獲得性免疫缺陷綜合征、禽流感等感染性疾病，地中海貧血等遺傳疾病，腫瘤診斷及胎兒排畸過(guò)程中均有重要意義[16-17]。故而本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)幽門螺桿菌感染情況。本研究結(jié)果顯示，納入的197例具有上消化道癥狀的受試者有129例細(xì)菌培養(yǎng)呈陽(yáng)性，陽(yáng)性率為65.48%。以細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果作為“金標(biāo)準(zhǔn)”，將內(nèi)鏡檢測(cè)、14C尿素呼氣試驗(yàn)、血清學(xué)檢測(cè)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行ROC曲線分析，得出實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的AUC面積最大，為0.985。說(shuō)明其檢測(cè)幽門螺桿菌感染的效能較高。且實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)準(zhǔn)確率、靈敏度及特異度分別為94.92%、94.57%與95.59%，進(jìn)一步說(shuō)明其檢測(cè)幽門螺桿菌感染的效能較高。且本研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)時(shí)間較短，相對(duì)于細(xì)菌培養(yǎng)標(biāo)本要求限制更少，新鮮標(biāo)本及石蠟包埋樣本均可進(jìn)行檢測(cè)。

綜上所述，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)診斷幽門螺桿菌的準(zhǔn)確性及靈敏度較高，有望為臨床幽門螺桿菌感染篩查提供新思路。但本研究納入標(biāo)本較少，后期應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大標(biāo)本量以獲得更準(zhǔn)確的結(jié)果。