王科峰,崔 喆,曹景愷,王曉輝

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院寶山分院/上海市寶山區(qū)大場(chǎng)醫(yī)院普外科，上海 200444; 2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院普外科，上海 200120

直腸癌是消化道常見(jiàn)腫瘤之一，發(fā)生于乙狀結(jié)腸與直腸交界處至齒狀線之間，臨床多行根治性手術(shù)切除以改善患者預(yù)后。晚期直腸癌患者由于病情惡化，腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移、侵襲等，預(yù)后情況往往較早期患者差。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶2(GPX2)又稱為胃腸特異性谷胱甘肽過(guò)氧化酶，是一種含硒蛋白，主要表達(dá)于胃腸道系統(tǒng)，具有抗炎抗氧化損傷的作用[1]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，GPX2在多種腫瘤中高表達(dá)，尤其是炎癥誘發(fā)的腫瘤中，可能起到促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制凋亡等作用[2-3]。關(guān)于GPX2在直腸癌中的表達(dá)關(guān)系近年來(lái)國(guó)內(nèi)外少見(jiàn)報(bào)道。核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)結(jié)構(gòu)中包含亮氨酸拉鏈，在調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原中發(fā)揮重要作用[4-5]。早期研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中Hmox1/Nrf2 mRNA水平的比值可能作為大腸癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)因子，提示Nrf2基因可能參與大腸癌的發(fā)生、發(fā)展[6]。而Nrf2蛋白在直腸癌中的表達(dá)情況不甚明確?；诖?，本研究通過(guò)檢測(cè)直腸癌患者腫瘤組織中GPX2、Nrf2蛋白表達(dá)情況，分析其不同表達(dá)水平與患者生存的關(guān)系，初步探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年1月至2017年6月于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院及上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院寶山分院腫瘤科行手術(shù)切除治療的直腸癌患者病理組織標(biāo)本80份，以術(shù)中所取癌旁(距腫瘤病灶>5 cm)正常直腸黏膜組織標(biāo)本57份為對(duì)照，所有組織標(biāo)本均用4%中性甲醛固定，常規(guī)脫水，采用石蠟包埋。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)接受根治術(shù)治療；(2)術(shù)前未接受放、化療或其他抗腫瘤藥物治療；(3)臨床資料和隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他惡性腫瘤患者；(2)合并急慢性感染性疾病者；(3)合并免疫系統(tǒng)疾病患者。所有患者及家屬均自愿簽署知情同意書(shū)，本研究獲得本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2數(shù)據(jù)庫(kù)分析 Ualcan(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)是一個(gè)可全面分析癌癥組學(xué)的網(wǎng)站，其中TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)可實(shí)現(xiàn)相關(guān)基因/靶標(biāo)分析和可視化?；谠摂?shù)據(jù)庫(kù)，本研究分析GPX2、Nrf2基因在直腸癌組織和正常直腸黏膜組織中的表達(dá)。

1.3方法 使用兔抗人多克隆抗體GPX2(美國(guó)Sigma公司)，一抗工作濃度為1∶500；兔抗人多克隆抗體Nrf2，稀釋濃度為1∶200。將組織以4 μm連續(xù)切片，充分烘烤后采用免疫組化法檢測(cè)直腸癌組織和正常直腸黏膜組織GPX2、Nrf2蛋白的表達(dá)情況。標(biāo)本檢測(cè)均由檢驗(yàn)科兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)生進(jìn)行操作，免疫組化Envision染色法按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。利用磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。

用半定量方法對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行判定。隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野進(jìn)行染色結(jié)果評(píng)分，取平均值。評(píng)分方法如下，(1)依據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分：細(xì)胞不著色記為0分，淡黃色記1分，黃色或黃棕色記2分，棕褐色或深褐色記3分；(2)依據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比進(jìn)行評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞<5%記為0分，陽(yáng)性細(xì)胞占5%～25%記1分，>25%～50%記2分，陽(yáng)性細(xì)胞>50%記3分。將細(xì)胞染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比評(píng)分的乘積作為最終得分，若最終得分≥2分，判定為表達(dá)陽(yáng)性(+)，<2分為表達(dá)陰性(-)；同時(shí)將得分≥3分定義為高表達(dá)，<3分定義為低表達(dá)。

1.4隨訪觀察 所有患者均進(jìn)行電話隨訪或門(mén)診隨訪，第1～2年每3個(gè)月進(jìn)行一次隨訪，第3年每6個(gè)月進(jìn)行一次隨訪。隨訪時(shí)間從術(shù)后開(kāi)始，截止日期為2020年6月，隨訪時(shí)間為10～42個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為27個(gè)月。分析不同GPX2、Nrf2蛋白表達(dá)水平直腸癌患者的生存情況。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的錄入與分析。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)或百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；生存分析采用Kaplan-Meier法，組間生存曲線差異用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)(Log-Rank test)；多因素Cox回歸分析影響直腸癌患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1GPX2、Nrf2基因在直腸癌組織和正常直腸黏膜組織中的表達(dá)差異 比較TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中166份直腸癌組織標(biāo)本和10份正常直腸黏膜組織標(biāo)本中GPX2、Nrf2基因的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，GPX2基因在直腸癌組織和正常直腸黏膜組織中表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Nrf2基因表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2GPX2、Nrf2蛋白在直腸癌組織和正常直腸黏膜組織中的免疫組化結(jié)果 免疫組化結(jié)果顯示，GPX2、Nrf2蛋白主要定位于直腸癌組織細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，見(jiàn)圖1。GPX2、Nrf2蛋白在直腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為67.50%(54/80)、76.25%(61/80)，明顯高于正常直腸黏膜組織中的24.56%(14/57)、31.58%(18/57)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 GPX2、Nrf2蛋白在直腸癌組織和正常直腸黏膜組織中的陽(yáng)性表達(dá)情況[n(%)]

2.3直腸癌組織中GPX2、Nrf2蛋白表達(dá)相關(guān)性 GPX2、Nrf2蛋白在直腸癌組織中共表達(dá)陽(yáng)性46例，共表達(dá)陰性11例，二者表達(dá)存在相關(guān)性(χ2=7.325，P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 直腸癌組織中GPX2、Nrf2表達(dá)相關(guān)性(n)

2.4直腸癌組織中GPX2、Nrf2蛋白表達(dá)情況與患者特征之間的關(guān)系 GPX2、Nrf2蛋白表達(dá)情況在不同年齡、性別、腫瘤大小直腸癌患者之間，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，在不同腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移直腸癌患者之間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 直腸癌組織中GPX2、Nrf2蛋白表達(dá)情況與患者特征之間的關(guān)系(n)

續(xù)表3 直腸癌組織中GPX2、Nrf2蛋白表達(dá)情況與患者特征之間的關(guān)系(n)

注：A表示GPX2在直腸癌組織中高表達(dá)；B表示GPX2在正常直腸黏膜組織中低表達(dá)；C表示Nrf2在直腸癌組織中高表達(dá)；D表示Nrf2在正常直腸黏膜組織中低表達(dá)。

2.5GPX2、Nrf2蛋白表達(dá)情況與直腸癌患者術(shù)后3年生存情況的關(guān)系 直腸癌組織中GPX2蛋白高表達(dá)組和低表達(dá)者3年累積生存率分別為31.92%、45.54%，經(jīng)Log-Rank比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.429，P=0.035)；Nrf2蛋白高表達(dá)者和低表達(dá)者3年累積生存率分別為26.93%、51.27%，經(jīng)Log-Rank比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.822，P=0.009)，見(jiàn)圖2、3。

圖2 GPX2蛋白表達(dá)與直腸癌患者3年累積生存率的關(guān)系

2.6影響直腸癌患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析 多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，GPX2蛋白高表達(dá)、Nrf2蛋白高表達(dá)、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響直腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見(jiàn)表4。

圖3 Nrf2蛋白表達(dá)與直腸癌患者3年累積生存率的關(guān)系

表4 影響直腸癌患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析

3 討 論

GPX2是一種含硒酶，屬于谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPX)家族，是谷胱甘肽氧化還原系統(tǒng)的關(guān)鍵酶。目前已知GPX家族有8個(gè)亞型(GPX1～GPX8)，其中在人類中表達(dá)的有5種，分別為GPX1、GPX2、GPX3、GPX4、GPX6，且均是含硒蛋白[7-8]。研究表明，硒具有抗氧化、抗衰老、提高機(jī)體免疫力和預(yù)防地方性疾病等作用，硒主要以硒蛋白的方式發(fā)揮生物學(xué)功能，因此，GPX2在抗氧化損傷、抗炎等方面的研究已較為普遍[9-10]。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)GPX2在腫瘤中也發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，利用硒增強(qiáng)飼糧喂養(yǎng)慢性結(jié)腸炎小鼠可增加結(jié)腸組織中GPX2表達(dá)，從而降低氧化應(yīng)激作用，使小鼠免于罹患慢性炎癥引起的結(jié)腸癌[11]。EMMINK等[12]研究發(fā)現(xiàn)，GPX2沉默可導(dǎo)致結(jié)直腸癌細(xì)胞中自由基氧的積累，增加細(xì)胞凋亡，降低克隆形成和轉(zhuǎn)移能力，而GPX2過(guò)表達(dá)則有利于細(xì)胞對(duì)自由基氧的清除，有利于細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)，促進(jìn)克隆形成和轉(zhuǎn)移能力。本研究免疫組化結(jié)果顯示，GPX2蛋白在直腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于正常直腸黏膜組織，與TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中GPX2基因表達(dá)趨勢(shì)一致；進(jìn)一步分析直腸癌患者特征發(fā)現(xiàn)，GPX2蛋白表達(dá)水平在不同腫瘤分化程度、不同TNM分期、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的直腸癌患者之間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示GPX2蛋白高表達(dá)與腫瘤惡性進(jìn)展有關(guān)，推測(cè)GPX2蛋白高表達(dá)可能有利于腫瘤細(xì)胞應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激，使得直腸癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲能力增強(qiáng)，從而促進(jìn)疾病發(fā)展。生存分析結(jié)果顯示，GPX2蛋白高表達(dá)患者3年累積生存率與GPX2蛋白低表達(dá)患者相比明顯降低，提示GPX2蛋白高表達(dá)與直腸癌患者預(yù)后不良有關(guān)。另外，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)GPX2通過(guò)Wnt通路介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[13]，然而該通路是否在直腸癌中發(fā)揮調(diào)控作用有待進(jìn)一步細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究。

Nrf2屬于堿性亮氨酸拉鏈(bZIP)家族，作為轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)控抗氧化應(yīng)激反應(yīng)元件(ARE)、GPX2等抗氧化蛋白的表達(dá)[14]。研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2結(jié)構(gòu)中包含7個(gè)高度保守的多肽域，其中Neh2是與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Keap1)結(jié)合的結(jié)構(gòu)域[15]。研究發(fā)現(xiàn)，癌細(xì)胞中Nrf2的異常激活是通過(guò)Keap1或Nrf2基因的體細(xì)胞突變及其他破壞Keap1與Nrf2結(jié)合的機(jī)制發(fā)生的[16]。Nrf2是細(xì)胞抗氧化反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子，已有研究證實(shí)正常細(xì)胞中Nrf2缺失所致氧化應(yīng)激過(guò)分激活可導(dǎo)致DNA損傷突變，增加腫瘤發(fā)生及惡化風(fēng)險(xiǎn)[17]，然而Nrf2蛋白在腫瘤中表達(dá)上調(diào)，亦可提高癌細(xì)胞的抗氧化和解毒能力，賦予腫瘤細(xì)胞快速增殖生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、侵襲等致癌活性，對(duì)荷瘤宿主產(chǎn)生不利影響[18-19]。國(guó)內(nèi)學(xué)者靳倩倩等[20]研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2蛋白在結(jié)直腸癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁組織，且Ⅲ～Ⅳ期患者Nrf2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于Ⅰ～Ⅱ期，說(shuō)明Nrf2蛋白參與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展。本研究免疫組化結(jié)果顯示，Nrf2蛋白在直腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于正常直腸黏膜組織，與TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中趨勢(shì)不一致，可能是因?yàn)榛蚺c蛋白水平存在一定差異。另外，Nrf2蛋白表達(dá)水平與直腸癌患者腫瘤分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示Nrf2蛋白可能通過(guò)調(diào)控腫瘤細(xì)胞氧化應(yīng)激及炎癥作用影響癌癥發(fā)展。本研究還發(fā)現(xiàn)，直腸癌組織中GPX2與Nrf2蛋白表達(dá)具有一定的相關(guān)性，提示GPX2、Nrf2蛋白在直腸癌可能共同作用參與調(diào)控直腸癌的發(fā)生、發(fā)展，Nrf2蛋白可調(diào)控GPX2蛋白表達(dá)，二者在直腸癌中的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。生存分析結(jié)果顯示，Nrf2高表達(dá)患者3年累積生存率明顯低于低表達(dá)患者，表明Nrf2蛋白與直腸癌患者預(yù)后不良有關(guān)。進(jìn)一步Cox回歸分析結(jié)果顯示，GPX2蛋白高表達(dá)、Nrf2蛋白高表達(dá)、TNM分期Ⅲ～Ⅳ、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響直腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示GPX2蛋白高表達(dá)、Nrf2蛋白高表達(dá)患者預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)增高，GPX2、Nrf2蛋白可能成為臨床治療直腸癌的潛在靶點(diǎn)。

綜上所述，直腸癌組織中GPX2、Nrf2蛋白呈高表達(dá)，GPX2、Nrf2蛋白高表達(dá)患者3年累積生存率較低表達(dá)患者短，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，GPX2與Nrf2蛋白水平有一定相關(guān)性，推測(cè)Nrf2可能調(diào)控GPX2表達(dá)，共同通過(guò)氧化應(yīng)激途徑影響直腸癌的發(fā)展，進(jìn)而影響患者預(yù)后，然而具體作用機(jī)制有待更深入研究。