聶瑞雪，李俊英，苗歡歡，凌 遙，張 浩，吳常信

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院畜禽育種國家工程實驗室，北京 100193）

精液冷凍（Semer Cryopreservation）是指新鮮精液經(jīng)過程序化處理后在液氮或其他冷源的輔助下迅速凝結(jié)的技術(shù)，精液冷凍使精子的生命活動被抑制從而達(dá)到長期保存的目的。精液冷凍保存技術(shù)在家畜生產(chǎn)中迅速發(fā)展，目前奶牛精液冷凍保存應(yīng)用最為廣泛[1]，而豬[2]、綿羊[3]、馬[4]、雞[5]的精液冷凍保存技術(shù)尚未廣泛應(yīng)用，但近年來也取得了一定進(jìn)展。

雞精液冷凍研究最早始于1941 年，Shaffner 等[6]將雞精液于-6℃保存30 s 后進(jìn)行人工授精，成功孵化出1 只雛雞，這是世界上有文獻(xiàn)記載的第一只由冷凍處理后的精液受精孵化而來的雛雞。1949—1951 年，Polge[7-8]團(tuán)隊意外發(fā)現(xiàn)甘油在冷凍條件下（-79℃）對精子有保護(hù)作用，便開始將甘油添加到雞精液稀釋液中，最終成功孵化出35 只雛雞。隨后國內(nèi)外對雞精液稀釋液、冷凍保護(hù)劑、冷凍程序、解凍過程等技術(shù)環(huán)節(jié)展開了諸多研究。

精液冷凍技術(shù)對于家禽生產(chǎn)業(yè)發(fā)展和優(yōu)良種質(zhì)資源保護(hù)至關(guān)重要。隨著高通量測序和芯片技術(shù)的發(fā)展，全基因組選擇（Genome Selection，GS）作為新一代選育技術(shù)已經(jīng)逐漸應(yīng)用到奶牛[9-10]、豬[11]、山羊[12]等家畜的遺傳改良，在雞上的應(yīng)用也開始受到關(guān)注[13-14]。穩(wěn)定、高效的雞精液冷凍保存可以大幅降低GS 中飼養(yǎng)公雞的成本，加快育種進(jìn)展[15]。利用雞精液冷凍技術(shù)還可以建立遺傳資源基因庫，保護(hù)瀕臨滅絕的珍稀禽類以及地方特色禽類品種。

目前，雞精液冷凍保存解凍后的精子活力、受精率、保存時間等指標(biāo)均不理想。雞精液冷凍技術(shù)仍處于研究階段，未能在生產(chǎn)中應(yīng)用[5]，還需結(jié)合其精液特點(diǎn)和精子結(jié)構(gòu)，優(yōu)化冷凍體系，建立一套兼具高受精率和高穩(wěn)定性的冷凍保存程序，為基因組選擇在家禽中的順利應(yīng)用和珍稀禽類遺傳資源的保護(hù)提供保障。本文概述國內(nèi)外關(guān)于雞精液冷凍的最新研究進(jìn)展，分析雞精液冷凍程序中存在的諸多問題，為今后的研究提供參考。

1 雞精子結(jié)構(gòu)和特點(diǎn)

與哺乳動物的精子相比，雞的精子對于低溫冷凍更加敏感。同樣采用人工授精，冷凍雞精液的受精能力顯著低于鮮精液，新鮮精液的受精率可達(dá)90%，而冷凍后精液的受精率僅在55%左右[5,16]。凍融降低雞精子受精能力的原因尚不完全清楚，可能與其獨(dú)特的細(xì)胞形態(tài)和生理特征有關(guān)。

1.1 雞精子的形態(tài)結(jié)構(gòu)易受冷凍損傷 不同物種的精子形態(tài)存在一定差異，但結(jié)構(gòu)上具有共性，均由頭部、頸段和尾部組成。雞精子頭部整體呈長圓柱形，頂端為錐形（圖1）[17-19]。雞精子細(xì)絲狀的尾部由頸段與頭部相連，頭部的寬度與尾部沒有明顯差別，與公牛的精子頭部相比，雞精子頭部的容積更?。▓D2）。在進(jìn)行冷凍操作中，雞精子頭部能夠容納的冷凍保護(hù)劑十分有限，因此冷凍保護(hù)劑對雞精子的保護(hù)效果低于哺乳動物。Villaverde-Morcillo[17]測量了雞精子頭部的尺寸，長度為（13.5±3.5）μm，寬度為（1.3±1.7）μm，雞精子除了頭部以外的長度可達(dá)90 μm[21]。與其他物種相比，雞精子的尾部更長，在冷凍、解凍的過程中更容易受到損傷，尾部斷裂的精子無法進(jìn)行游動，這也是經(jīng)冷凍后解凍的精子受精率低的原因之一[22]。

圖1 顯微鏡下的雞精子[17]（Hemacolor 法染色）

圖2 不同物種的精子示意圖[20]

1.2 雞精子的質(zhì)膜結(jié)構(gòu)易受冷凍損傷 前人[22]研究結(jié)果表明，凍融操作也會導(dǎo)致精子膜結(jié)構(gòu)的損傷，主要表現(xiàn)在精子頸段產(chǎn)生畸形。新鮮雞精液的頸段畸形率只有0.9%，受精率為85.9%，而經(jīng)過低溫冷凍的精子頸段畸形率達(dá)到49.1%，受精率僅有46.8%[23]。Olexikova[24]利用透射電鏡評估新鮮雞精子和冷凍后解凍雞精子的漿膜和頂體外觀，根據(jù)質(zhì)膜的狀態(tài)將精子分為3 個等級（圖3）。一級的精子質(zhì)膜完整且頂體后部稍有腫脹，二級是頂體和頂體后部均出現(xiàn)腫脹，三級的精子質(zhì)膜已經(jīng)完全遭到破壞，頂體與精子頸發(fā)生分離。研究表明，鮮精中有87% 的精子屬于一級，而冷凍后解凍的精子只有約25% 的精子屬于一級、二級和三級的精子占絕大部分[24]。因此，冷凍保存會導(dǎo)致雞精子發(fā)生不同程度的漿膜和頂體損傷，頂體的缺失可能是凍存雞精子受精能力下降的又一主要原因。

圖3 透射電鏡下的雞精子，（a）（b）（c）分別代表一級、二級和三級精子[24]

1.3 雞精子質(zhì)膜結(jié)構(gòu)易受氧化損傷 精液冷凍過程中的凍融操作會改變精子環(huán)境的滲透壓，而精子質(zhì)膜的成分和質(zhì)膜的流動性是適應(yīng)滲透變化必不可少的因素[25-26]。精子質(zhì)膜由脂質(zhì)、膽固醇和蛋白質(zhì)組成，質(zhì)膜中還有很高比例的不飽和脂肪酸（Polyunsaturated Fatty Acid，PUFA）?；钚匝酰≧eactive Oxygen Species，ROS）是組織進(jìn)行正常有氧代謝的天然產(chǎn)物，可以維持細(xì)胞內(nèi)的正常功能。當(dāng)精子受到冷凍保存等外源刺激時，其產(chǎn)生大量的ROS 會誘導(dǎo)質(zhì)膜上的PUFA 發(fā)生過氧化反應(yīng)（Lipid Peroxidation，LPO），從而損傷精子質(zhì)膜[27]。由于雞精子質(zhì)膜的成分特點(diǎn)，與哺乳動物相比雞精子更易發(fā)生LPO，導(dǎo)致精子內(nèi)線粒體膜和細(xì)胞膜的損壞，胞內(nèi)酶滲漏，DΝA 片段損傷，精卵融合困難，最終表現(xiàn)為解凍后精子活力降低，受精率低[28]。為降低ROS對雞精子的冷應(yīng)激，研究人員在精液稀釋中添加超氧化物歧化酶[29]、過氧化氫酶[30]、維生素E[31]、褪黑激素[32]、白藜蘆醇[33]等抗氧化劑來保護(hù)精子，且取得了一定的效果。

精子質(zhì)膜流動性與質(zhì)膜成分有關(guān)，其有助于精子解凍后膜生理狀態(tài)的修復(fù)，是預(yù)測精子耐冷凍能力的可靠指標(biāo)[34]。研究質(zhì)膜流動性的常規(guī)技術(shù)是熒光探針法，將熒光探劑（如1,6 -diphenyl-1,3,5-hexatriene）與細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)合，以形成發(fā)光的絡(luò)合物再進(jìn)行檢測，熒光強(qiáng)度越大，細(xì)胞質(zhì)膜的流動性就越小[34]。Blesbois 等[35]研究表明，測得熒光值越低，雞精子質(zhì)膜的流動性越高，凍后精子畸形或死亡的數(shù)目越少，說明精子質(zhì)膜流動性與精子抗凍相關(guān)，是精子在凍融后恢復(fù)活力并維持受精能力的可靠預(yù)測因子。

2 雞精液冷凍保存優(yōu)化技術(shù)方案研究

針對雞精子特點(diǎn)，結(jié)合精液冷凍環(huán)節(jié)的原理，研究人員在優(yōu)化雞精液冷凍技術(shù)方面積極開展研究，包括冷凍保護(hù)劑種類[36]、冷凍保護(hù)劑濃度優(yōu)化[37]、冷凍速率優(yōu)化[38]、添加抗氧化劑[38]，以及不同的冷凍劑型[39]。筆者整理了近年來關(guān)于雞精液研究的結(jié)果，詳見表1。

表1 近年來關(guān)于雞精液冷凍研究的報道

2.1 雞精液冷凍保護(hù)劑的研究 雞精液冷凍最常用的冷凍保護(hù)劑是甘油和二甲基乙酰胺（DMA）[40]。甘油常用來制作0.25 mL 的細(xì)管凍精，具有易標(biāo)記和管理方便的優(yōu)點(diǎn)，但是甘油具有生殖毒性，在授精之前要通過離心法來降低甘油對精卵結(jié)合的影響[41]。DMA 用來制作凍精顆粒的效果比較好，省去了在人工授精之前離心去掉保護(hù)劑的步驟，但由于顆粒凍精不便于標(biāo)記，不適用于需要區(qū)別雞個體的情況。Wu[37]在研究中同時考慮甘油濃度（2%、4%、6%、8%、11%）和冷凍速率對雞精液受精能力的影響，結(jié)果顯示，凍精細(xì)管距離液氮表面6 cm 時解凍后精子活率最高，各甘油濃度梯度的精子活率分別是57%、70%、70%、82%、82%，說明甘油濃度越高，對精子的保護(hù)效果越好，凍融之后的活率越好；但后續(xù)用清洗-離心法去甘油后進(jìn)行深陰部人工授精，各甘油濃度保護(hù)精液的種蛋受精率分別為34.8%、75.1%、77.6%、70.0%、57.4%，入孵蛋孵化率分別為26.2%、71.4%、73.3%、69.4%、55.6%。這可能是因為高濃度甘油保護(hù)時，脫甘油會對精子造成傷害，少量殘余的甘油會阻礙精子向受精部位游動，從而影響受精率。Wu[37]研究結(jié)果中的77.6%受精率是目前冷凍雞精液達(dá)到的較高水平，但該研究中精液冷凍保存時間較短，人工授精頻率高，且采用深陰部授精，很難在雞生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。

2.2 抗氧化劑的研究 在精液稀釋液中添加抗氧化劑可以防止雞精子遭受氧化損傷。常用于雞精液的抗氧化劑有過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶，以及維生素E、維生素C、褪黑激素、番茄紅素、硒、鋅等[42]。褪黑激素因其對自由基有清除作用被廣泛認(rèn)為是一種有效的抗氧化劑，可以保護(hù)細(xì)胞的完整，維持細(xì)胞功能[43]。Mehaisen[32]將一定濃度的褪黑激素添加到稀釋液中，解凍后的雞精子活率為34.7%，空白對照組為25.3%。Appiah[44]將褪黑激素作為抗氧化劑，結(jié)果顯示解凍后的雞精子活率為39.67%，空白對照組為32.33%。目前的研究結(jié)果還不足以說明褪黑激素對解凍后精子的受精能力有保護(hù)作用，但通過研究可以發(fā)現(xiàn)，褪黑激素可以促進(jìn)自由基在細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)和在線粒體內(nèi)的積累，從而達(dá)到保證膜完整性和線粒體具有活力的目的[44]。線粒體活力正常可以保持能量的正常供應(yīng)，為精子提供解凍后的能量來源。因此褪黑激素對精子細(xì)胞膜的有益作用可以積極地反映在精子功能和活力[45]。

2.3 精液稀釋液的研究 雞精液密度高、黏性大，理想的精液稀釋液可以為精子的代謝活動提供能量，維持pH 和滲透壓的穩(wěn)定，保障精子生命活動的正常進(jìn)行。Thananurak[46]用泰國本地雞作為研究對象，比較了3種雞精液冷凍稀釋液對解凍后精子活率和受精率的影響結(jié)果顯示，采用布盧姆貝格爾稀釋液（BHSV-based Extender）的精子解凍后活率為68.83%，使用Sasaki稀釋液（Sasaki Extender）的解凍后活率為68.50%，TΝC 稀釋液（Thai Νative Chicken Extender，TΝC）的解凍后活率是66.33%，將解凍后精液進(jìn)行人工授精，受精率分別為73.37%、77.27%、90.27%，但該研究中用于人工授精的母雞數(shù)較少（12 只），冷凍保存時間不明確，對于新的稀釋液效果和穩(wěn)定性還有待進(jìn)一步研究。

精液稀釋液還可以承載抗氧化劑和冷凍保護(hù)劑，貝茲維爾稀釋液[47]（Beltsville Extender）和雷克稀釋液[48]（Lake Extender）應(yīng)用較為廣泛，分別添加抗氧化劑蝦青素[47]和谷胱甘肽[48]可以提高精子的抗氧化能力，解凍后的活率分別為68.6%、58.8%。納比稀釋液（Νabi Extender）是一種新型稀釋液，Νabi[49]對比發(fā)現(xiàn)，用納比稀釋液處理的精液解凍后活率為65.4%，效果優(yōu)于傳統(tǒng)的貝茲維爾稀釋液。理想的精液稀釋液會保護(hù)精子免受冷凍損傷和氧化應(yīng)激，保持精子質(zhì)膜的完整性，使精子保持良好的解凍后受精水平。

3 展 望

雞精液冷凍保存對于家禽業(yè)的生產(chǎn)和遺傳多樣性的保存具有至關(guān)重要的意義，但是雞精液冷凍技術(shù)目前不能用于生產(chǎn)實踐。在過去的幾十年里，雞精液冷凍技術(shù)取得了一定的進(jìn)展，但沒有建立一套規(guī)范的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。雞精液進(jìn)行冷凍目的是對精子進(jìn)行長期保存，但目前的研究鮮有對冷凍時間進(jìn)行記錄，對保存時長的研究還不夠重視。未來的研究中應(yīng)該側(cè)重?zé)o毒無害冷凍保護(hù)劑的挖掘，細(xì)化冷凍保護(hù)劑和抗氧化劑對精子不同部位的保護(hù)作用，精子抗凍性的機(jī)制研究，以期得到保護(hù)作用全面、沒有生殖毒性、經(jīng)濟(jì)實用的綜合雞精液稀釋液，從而進(jìn)一度提高雞精液冷凍水平，早日用于生產(chǎn)實踐。