張敏 劉惠娟 王永福 石巖

摘要 摘要[目的]建立一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定淫羊藿中6種黃酮類成分的方法，并對(duì)甘肅地區(qū)的21批藥材進(jìn)行定量分析。[方法]Agilent Zorbax色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為水（A）、乙腈（B），梯度洗脫，流速0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm，進(jìn)樣量10 μL。分別考察不同條件對(duì)相對(duì)校正因子的影響。評(píng)價(jià)一測(cè)多評(píng)法和標(biāo)準(zhǔn)曲線法在含量測(cè)定結(jié)果上的差異。[結(jié)果]建立了以淫羊藿苷為內(nèi)標(biāo)參照物，同時(shí)測(cè)定6種黃酮類成分的一測(cè)多評(píng)法。不同條件下相對(duì)校正因子的RSD小于2.63%。多點(diǎn)矯正-一測(cè)多評(píng)法、斜率矯正-一測(cè)多評(píng)法和標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定21批甘肅地區(qū)淫羊藿樣品含量，其RSD小于3%，無(wú)明顯差異。[結(jié)論]一測(cè)多評(píng)法結(jié)果準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單易行，可用于淫羊藿中黃酮類成分的含量測(cè)定。

關(guān)鍵詞 一測(cè)多評(píng);淫羊藿;黃酮類成分;含量測(cè)定;甘肅地區(qū)

中圖分類號(hào) R-284.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2021）11-0182-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.11.049

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Determination of Flavonoids of Epimedium in Gansu by Quantitative Analysis of Multi-components with a Single Marker（QAMS）

ZHANG Min1， LIU Hui-juan1， WANG Yong-fu2 et al

（1.Gansu Medical College， Pingliang，Gansu 744000;2.Gansu Digital Herbal Testing Center Co.， Ltd.， Dingxi，Gansu 743000）

Abstract [Objective]To establish a method for simultaneous determination of 6 flavonoids in Epimedium by QAMS， and to determine the content of 21 batches of medicinal materials in Gansu Province. [Method]Agilent Zorbax column （4.6 mm×250 mm， 5 μm）， mobile phase were water （A） and acetonitrile （B）， gradient elution， flow rate was 0.8 mL/min， the detection wavelength was set at 270 nm， injection volume 10 μL.The effects of different conditions on relative correction factors were investigated.The difference between the standard curve method and QAMS was evaluated in content determination. [Result] A method was established to determine 6 flavonoids by using icariin as internal reference based on QAMS.The RSD under different conditions was less than 2.63%. The content of 21 batches of Epimedium in Gansu Province was determined by QAMS and standard curve method， the RSD of two sets was less than 3% and there was no significant difference. [Conclusion] QAMS is accurate， easy to operate， and can be used to determine the content of flavonoids in Epimedium.

Key words QAMS;Epimedium;Flavonoids;Content determination;Gansu area

淫羊藿為小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornu Maxim.、箭葉淫羊藿Epimedium sagittatum（Sieb.et Zucc.）Maxim.、柔毛淫羊藿Epimedium pubescens Maxim.或朝鮮淫羊藿Epimedium koreanum Nakai的干燥葉[1]，其基源復(fù)雜、分布廣泛、質(zhì)量差別大[2]。而甘肅地區(qū)的淫羊藿質(zhì)量一直為市場(chǎng)所認(rèn)可[3]。

淫羊藿的主要藥效成分為黃酮類，國(guó)內(nèi)外大量研究都集中在此類成分研究上[4-5]。2015版《中國(guó)藥典》以淫羊藿苷≥0.5%作為含量合格的指標(biāo)，造成市面上多數(shù)藥材質(zhì)量不合格[6]。現(xiàn)代研究表明，淫羊藿中具有生理活性的成分不局限在淫羊藿苷。朝藿定C抗骨質(zhì)疏松效果明顯，寶霍苷I對(duì)鼻咽癌、口腔上皮癌有作用[7-8]。因此，全面考察淫羊藿中黃酮類成分，才能科學(xué)地反映藥材質(zhì)量。

一測(cè)多評(píng)法（QAMS）近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于中藥多種成分的定量分析中[9-11]。該法基于各成分之間的函數(shù)關(guān)系，選擇一種價(jià)廉易得的內(nèi)標(biāo)參照物，同時(shí)測(cè)定其他多種成分，操作成本低，應(yīng)用廣泛[12]。筆者以淫羊藿苷為內(nèi)標(biāo)參照物，分別測(cè)定朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和寶霍苷I的相對(duì)校正因子，考察不同條件下的耐用性，建立一測(cè)多評(píng)法;在此基礎(chǔ)上，采用一測(cè)多評(píng)法和標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量分析甘肅地區(qū)21批淫羊藿樣品，比較測(cè)定結(jié)果的差異，評(píng)價(jià)黃酮類成分的含量，為甘肅地區(qū)淫羊藿質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象。該試驗(yàn)所使用的淫羊藿藥材來(lái)自甘肅數(shù)字本草檢驗(yàn)中心有限公司。經(jīng)甘肅醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)教研室鑒定均為淫羊藿種屬淫羊藿。

1.1.2 主要儀器。高效液相色譜儀為Agilent 1260（配置DAD檢測(cè)器，美國(guó)Agilent公司），Agilent Zorbax色譜柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）;KQ-50DE超聲波提取儀（昆山市超聲儀器有限公司）;CAP225D電子天平（十萬(wàn)分之一，德國(guó)Sartorial公司）;超純水系統(tǒng)（Merck Millipore公司）。

1.1.3

主要試劑。乙腈、甲醇為色譜純，德國(guó)Merck公司;乙醇為分析純，南京奧佳化工有限公司;朝藿定A1（批號(hào)P02J9S64790）、朝藿定A（批號(hào)P02J9F64787）、朝藿定B（批號(hào)P02J9A64781）、朝藿定C（批號(hào)P02J9D65890）、淫羊藿苷（批號(hào)T05D9B76755）、寶霍苷Ⅰ（批號(hào)T05S65007）為對(duì)照品，上海葉源生物科技有限公司，純度均在98%以上。

1.2 方法

1.2.1

對(duì)照品溶液的制備。分別精密稱取朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷和寶霍苷Ⅰ適量，加甲醇制成混合對(duì)照品溶液，相應(yīng)的濃度為51.50、107.03、250.10、257.54、309.04和10.82 μg/mL。

1.2.2

供試品溶液的制備。取淫羊藿粉末（過(guò)3號(hào)篩）約0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇20 mL，精密稱取重量，超聲處理30 min，放冷至室溫。再次稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足失重，搖勻。用0.45 μm微孔有機(jī)濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

1.2.3

色譜分析條件。Agilent Zorbax色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為水（A）、乙腈（B），梯度洗脫（0～25 min，21%～30%B;25～35 min，30%～70%B;35～45 min，70%～90%B;45～50 min，90%B），流速0.8 mL/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm，進(jìn)樣量10 μL。

1.2.4 方法學(xué)考察。

1.2.4.1

線性關(guān)系的考察。取“1.2.1”對(duì)照品溶液制備項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，對(duì)半稀釋法稀釋6次，得到不同濃度的對(duì)照品溶液。按照“1.2.3”色譜條件進(jìn)行測(cè)試，每個(gè)點(diǎn)平行3次。以平均峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、對(duì)照品濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)。精密稱取1號(hào)樣品，按照“1.2.2”供試品溶液制備方法處理。分別在0、2、4、8、12、24、48 h進(jìn)樣分析，記錄朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷和寶霍苷Ⅰ的峰面積，并計(jì)算RSD。

1.2.4.3

精密度試驗(yàn)。取1號(hào)樣品，按照“1.2.2”供試品溶液制備方法處理，“1.2.3”色譜條件分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷和寶霍苷Ⅰ的峰面積，并計(jì)算RSD。

1.2.4.4

重復(fù)性試驗(yàn)。取1號(hào)樣品6份，按照“1.2.2”供試品溶液制備方法處理，“1.2.3”色譜條件分析，計(jì)算朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷和寶霍苷Ⅰ的含量，并計(jì)算RSD。

1.2.4.5

加樣回收試驗(yàn)。精密稱取已知含量淫羊藿樣品6份（1號(hào)樣品），分別加入混合對(duì)照液適量，按照“1.2.2”供試品溶液制備方法處理，“1.2.3”色譜條件分析，測(cè)定朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷和寶霍苷Ⅰ的含量，計(jì)算加樣回收率。

1.2.5 相對(duì)校正因子和相對(duì)保留時(shí)間的計(jì)算。

1.2.5.1

多點(diǎn)矯正法計(jì)算相對(duì)校正因子。取“1.2.4.1”項(xiàng)下的系列混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣分析。以淫羊藿苷為內(nèi)標(biāo)參照物，利用公式fsk=fsfk=As/CsAk/Ck計(jì)算相對(duì)校正因子fsk。其中，As為內(nèi)標(biāo)參照物的峰面積，Cs為內(nèi)標(biāo)參照物的濃度，Ak為被測(cè)物的峰面積，Ck為被測(cè)物的濃度。

1.2.5.2

斜率矯正法計(jì)算相對(duì)校正因子。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算斜率之比，即fsk=αs/αk，其中，αs為內(nèi)標(biāo)參照物的斜率，αk為待測(cè)成分的斜率。

1.2.5.3

相對(duì)保留時(shí)間的計(jì)算。利用公式Rks=tRk/tRs計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間Rks，其中tRk為其他組分保留時(shí)間，tRs為參照物保留時(shí)間。

1.2.6

耐用性考察?？疾?種不同儀器（Agilent1260、島津LC2010A、Waters 2695）、色譜柱（Agilent Zorbax C18色譜柱、島津Wondasil C18色譜柱、Waters SunFire C18色譜柱）、流速（0.8、0.9、1.0 mL/min）、柱溫（25、30、35 ℃）和進(jìn)樣體積（5、10、20 μL）對(duì)相對(duì)校正因子的影響，并計(jì)算不同條件下相對(duì)校正因子RSD。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 對(duì)照品和供試品溶液色譜圖。圖1表明，在“1.2.3”色譜條件下，樣品中各成分的保留時(shí)間與對(duì)照品色譜圖中的一致，分離度大于1.5，滿足要求。說(shuō)明此色譜條件適合測(cè)定淫羊藿中朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷和寶霍苷Ⅰ的含量。

2.1.2 線性關(guān)系的考察。以朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷和寶霍苷Ⅰ的濃度對(duì)峰面積進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程及相關(guān)系數(shù)，結(jié)果如表1所示。表1表明各成分對(duì)照品濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

2.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)。按照“1.2.4.2”方法操作，計(jì)算得出朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷和寶霍苷Ⅰ的峰面積RSD分別為0.77%、1.21%、0.98%、1.06%、0.86%和1.34%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.4 精密度試驗(yàn)。按照“1.2.4.3”方法操作，計(jì)算得出朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶霍苷Ⅰ的峰面積RSD為0.36%、0.21%、0.31%、0.45%、0.28%和0.75%，表明儀器精密度良好。

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn)。按照“1.2.4.4”方法操作，測(cè)得朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶霍苷Ⅰ的含量RSD分別為1.27%、0.95%、1.28%、1.07%、1.34%和1.52%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.1.6 加樣回收試驗(yàn)。按照“1.2.4.5”方法操作，計(jì)算加樣回收率在98.45%～102.33%，RSD均小于3%，說(shuō)明回收率良好，方法可行。

2.2 相對(duì)較正因子和保留時(shí)間的計(jì)算

2.2.1 多點(diǎn)矯正法計(jì)算校正因子。按照“1.2.5.1”方法操作，以淫羊藿苷為參照物，計(jì)算朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和寶霍苷Ⅰ的相對(duì)校正因子fsk值分別為1.416 7、1.327 8、1.257 1、1.226 9、0.687 2，RSD分別為2.86%、2.51%、2.99%、2.66%、1.87%。

2.2.2 斜率矯正法計(jì)算相對(duì)校正因子。按照“1.2.5.2”方法操作，計(jì)算出朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和寶霍苷Ⅰ的相對(duì)校正因子fsk值分別為1.419 7、1.325 2、1.253 3、1.227 6、0.686 7。

2.2.3 相對(duì)保留時(shí)間的計(jì)算。按照“1.2.5.3”方法操作，以淫羊藿苷為內(nèi)標(biāo)參照物，計(jì)算朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和寶霍苷Ⅰ的相對(duì)保留時(shí)間分別為0.81、0.86、0.90、0.94、1.59。

2.3 耐用性考察

按照“1.2.6”方法操作，不同儀器、色譜柱、流速、柱溫、進(jìn)樣體積條件下測(cè)得的相對(duì)校正因子如表2所示。結(jié)果顯示，朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和寶霍苷Ⅰ的RSD分別為0.53%、1.27%、0.60%、0.55%、2.63%，表明方法的耐用性良好。

2.4 含量測(cè)定

取21批甘肅產(chǎn)淫羊藿樣品，按照“1.2.2”方法處理，按“1.2.3”色譜條件進(jìn)行HPLC分析。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法、多點(diǎn)矯正-一測(cè)多評(píng)法（MPC-QAMS）和斜率矯正-一側(cè)多評(píng)法（SC-QAMS）分別計(jì)算6個(gè)黃酮類成分含量，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。結(jié)果顯示三者RSD均小于3%，說(shuō)明3種方法不存在明顯差異。一測(cè)多評(píng)法相比來(lái)說(shuō)操作簡(jiǎn)單、成本低廉，具有優(yōu)勢(shì)。

按照多點(diǎn)矯正-一測(cè)多評(píng)法的含量測(cè)定結(jié)果，計(jì)算21批樣品6個(gè)黃酮類成分總量，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。結(jié)果顯示（表3），甘肅地區(qū)淫羊藿中總黃酮除8號(hào)樣品外，其余均大于1.5%。其中，含量排在前5的淫羊藿依次為11號(hào)、3號(hào)、7號(hào)、12號(hào)、10號(hào)，分別來(lái)自甘肅迭部、甘肅西和縣、甘肅岷縣、甘肅武山縣和甘肅成縣。

3 討論與結(jié)論

該研究以淫羊藿苷為內(nèi)標(biāo)參照物，建立了一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定淫羊藿中6種黃酮類成分的方法。淫羊藿苷在淫羊藿藥材中含量高且穩(wěn)定，對(duì)照品價(jià)廉易得，選為內(nèi)標(biāo)參照物。朝藿定類對(duì)奧沙利鉑損傷的周圍神經(jīng)具有明顯的保護(hù)作用[13]。寶霍苷I是淫羊藿苷在體內(nèi)的水解產(chǎn)物[14]，故選取朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、寶霍苷I作為測(cè)試目標(biāo)。

多點(diǎn)矯正-一測(cè)多評(píng)法和斜率矯正-一測(cè)多評(píng)法二者測(cè)定的相對(duì)校正因子基本一致。前者方法的使用率更高[12]。故該研究采用多點(diǎn)矯正-一測(cè)多評(píng)法進(jìn)行耐用性考察及6個(gè)黃酮類成分的總量計(jì)算。色譜峰定位的常見(jiàn)方法有時(shí)間差法和相對(duì)保留時(shí)間法。時(shí)間差法在不同的儀器和色譜柱上會(huì)有較大的波動(dòng)[15]。相對(duì)保留時(shí)間法適用于定位與參照物性質(zhì)類似的成分。淫羊藿的黃酮類成分是以2-苯基色原酮為母核的衍生物[16]，所以采用其定位色譜峰，效果良好。

甘肅為淫羊藿的重要產(chǎn)區(qū)之一。不同產(chǎn)地的藥材品質(zhì)相差較大。該研究結(jié)果表明，甘肅迭部、甘肅西和縣、甘肅岷縣、甘肅武山縣和甘肅成縣出產(chǎn)的淫羊藿，所測(cè)6個(gè)黃酮類成分的含量總量較高。

參考文獻(xiàn)

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：2015年版 一部[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：327.

[2] 郭寶林，黃文華，孫娥，等.淫羊藿藥材和飲片市場(chǎng)調(diào)查[J].中國(guó)中藥雜志，2010，35（13）：1687-1690.

[3] 裴利寬，黃文華，何天谷，等.中藥淫羊藿主要資源種類藥材質(zhì)量的系統(tǒng)研究[J].中國(guó)中藥雜志，2007，32（21）：2217-2222.

[4] 袁航，曹樹(shù)萍，陳抒云，等.淫羊藿的化學(xué)成分及質(zhì)量控制研究進(jìn)展[J].中草藥，2014，45（24）：3630-3640.

[5] 李艷，于濤，苗明三.淫羊藿的化學(xué)、藥理與臨床應(yīng)用分析[J].中醫(yī)學(xué)報(bào)，2017，32（4）：619-622.

[6] 刁紅雨，孫冬梅，王維禮.51批淫羊藿質(zhì)量分析[J].中國(guó)社區(qū)醫(yī)師，2017，33（12）：20-21，23.

[7] 劉亞林，黃覓，馮晶，等.基于Micro-CT技術(shù)分析淫羊藿苷和朝藿定C對(duì)糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥小鼠骨組織微結(jié)構(gòu)的影響[J].藥物評(píng)價(jià)研究，2020，43（9）：1733-1739.

[8] 林新，李文魁，羅崇念，等.淫羊藿次甙 II 對(duì)三種腫瘤細(xì)胞株增殖的抑制作用[J].中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，1997，11（3）：183.

[9] 王福成，李冬華，郭文賓，等.HPLC-DAD法同時(shí)測(cè)定梔子金花丸中10個(gè)成分的含量[J].藥物分析雜志，2020，40（1）：145-154.

[10] 高喜梅，池玉梅，張?chǎng)?，?指紋圖譜結(jié)合一測(cè)多評(píng)法評(píng)價(jià)酸橙枳實(shí)質(zhì)量的研究[J].中草藥，2020，51（9）：2548-2556.

[11] 張洪坤，郭長(zhǎng)達(dá)，楊美華，等.一測(cè)多評(píng)法測(cè)定白芍中3種芍藥苷類成分的含量[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（15）：211-215，221.

[12] 陳楊，徐光臨，徐德生，等.一測(cè)多評(píng)法在中藥質(zhì)量控制中的應(yīng)用及關(guān)鍵問(wèn)題[J].環(huán)球中醫(yī)藥，2017，10（5）：635-640.

[13] 蘭海，劉欣妍，余玲，等.大孔樹(shù)脂純化淫羊藿中朝藿定與淫羊藿苷工藝研究[J].中草藥，2020，51（17）：4473-4481.

[14] 錢淺，孫娥，樊宏偉，等.羊脂油對(duì)淫羊藿炮制品提取物中寶藿苷Ⅰ在大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)特征的影響[J].中草藥，2012，43（10）：1981-1985.

[15] 張麗先，范毅，魏悅，等.一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定野菊花中12個(gè)成分[J].藥物分析雜志，2020，40（2）：218-226.

[16] 秦偉瀚，陽(yáng)勇，郭延壘，等.基于巫藿苷為主要代謝產(chǎn)物的生源途徑推導(dǎo)及淫羊藿新化合物鑒定分析研究[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2020，32（9）：1529-1538，1575.