徐紹偉 林鳳 徐正國(guó) 李斌 裴為華 李忠奎 李紅麗 王巖

摘要 為了研究生物菌劑對(duì)煙田土壤理化性質(zhì)和土壤細(xì)菌群落的影響，在煙田施用不同微生物組合菌劑，利用高通量基因測(cè)序檢測(cè)分析不同生長(zhǎng)期土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，檢測(cè)土壤理化性質(zhì)，分析其變化和相關(guān)性。結(jié)果表明，菌劑可以使土壤pH提高0.44，復(fù)合菌劑能增加土壤細(xì)菌的多樣性，改變土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，施用菌劑處理與對(duì)照之間差異較大。鞘氨醇單孢菌屬和節(jié)桿菌屬含量在施用菌劑的處理土壤中最高，可提高土壤氮素轉(zhuǎn)化和作物的抗病性。有機(jī)質(zhì)、速效鉀、pH和含水率與土壤細(xì)菌極顯著相關(guān)，堿解氮和有效磷為顯著相關(guān)，可通過(guò)調(diào)節(jié)這些因子改變土壤細(xì)菌群落，進(jìn)而改變土壤微環(huán)境，增強(qiáng)作物的抗病性。

關(guān)鍵詞 生物菌劑; 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu);環(huán)境因子;相關(guān)性

中圖分類(lèi)號(hào) S-154.3? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2021）12-0167-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.12.043

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Effects of Biological Agents on Soil Physical and Chemical? Properties and Bacterial Community in Tobacco Field and the Correlation

XU Shao wei1，LIN Feng2，XU Zheng guo1 et al? （1.Sichuan Provincial Tobacco Company Liangshan Company Dechang Branch，Dechang，Sichuan?? 615500;2.Dechang County Agriculture and Rural Affairs Bureau，Dechang， Sichuan 615500）

Abstract In order to study the influence of biological agents on soil physical and chemical properties and bacterial community in tobacco field，different microbial combination agents were applied in tobacco field.The changes and correlations of soil physical and chemical properties were analyzed by high throughput gene sequencing.The results showed that the bacteria could improve soil pH by 0.44 ，and the compound bacteria could increase the diversity of soil bacteria and change the structure of soil bacteria community，which was different from the control.Sphingomonas and Arthrobacteria had the highest content in the treatment of applying biological agents，which could improve soil nitrogen transformation and crop disease resistance.Organic matter，available potassium，pH and water content were extremely significant correlated with soil bacteria，and alkaline nitrogen and available phosphorus are significant correlation.Therefore，through adjusting these factors，soil bacterial community could be changed，and then soil microenvironment could be changed and disease resistance of crops can be enhanced.

Key words Biological agents;Bacterial community structure;Environmental factors;Correlation

土壤是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中的養(yǎng)分來(lái)源和重要載體，良好的土壤條件是生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)作物的基礎(chǔ)。但由于近年來(lái)經(jīng)濟(jì)作物如煙草的長(zhǎng)期連作致使煙田出現(xiàn)土壤環(huán)境惡化等問(wèn)題[1]。研究我國(guó)各種土壤25年的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，農(nóng)田土壤發(fā)生不同程度酸化現(xiàn)象高達(dá)90%[2]，土壤pH降低影響相關(guān)微生物的多樣性和酶活性[3]，煙葉中煙堿含量呈增加趨勢(shì)[4]，同時(shí)土壤中鉀、鎂、鈣的有效量下降[5]。煙草健康生長(zhǎng)受不良耕作、施肥和管理等因素的影響，這些因素都會(huì)導(dǎo)致土壤微生態(tài)環(huán)境失衡，土壤調(diào)節(jié)能力降低，最終造成病害的嚴(yán)重發(fā)生[6-10]。

生物防治是利用有益微生物殺滅或降低病原菌的數(shù)量，豐富微生物種群，從而控制植物病害發(fā)生[11-12]。Phae 等[13]將Bacillus NB22菌株的懸浮液撒入有嚴(yán)重病害的土壤中，染病植株的死亡率明顯下降。也可制成生物有機(jī)肥施入土壤中，改善土壤微生物的營(yíng)養(yǎng)，提高土壤微生物的代謝能力，土壤微生物多樣性較高，使土壤微生物群落對(duì)抗病原菌的能力提高，降低發(fā)病率。

目前用于防治土傳病害的菌劑較多，大多關(guān)注菌劑的篩選和作用結(jié)果，而對(duì)土壤微生物和土壤理化性狀的影響關(guān)注較少。筆者利用一種解淀粉芽孢桿菌菌劑和原位土壤中篩選的黑脛病拮抗菌，進(jìn)行不同配比施肥，研究不同生物菌劑防控黑脛病的過(guò)程中對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響，以及環(huán)境因子的變化及其與細(xì)菌的相關(guān)性，為進(jìn)一步采取措施進(jìn)行煙草土傳病害的生態(tài)防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況 試驗(yàn)地位于四川省涼山州會(huì)理縣益門(mén)鎮(zhèn)，26°50′N(xiāo)，102°17′E，海拔1 900 m，年平均氣溫15.3 ℃。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與土壤采集 選取地塊平整的0.2 hm2煙田，均分為4個(gè)處理，每個(gè)處理約0.067 hm2，并設(shè)3次重復(fù)，隨機(jī)排列。H2試驗(yàn)4個(gè)處理分別為處理1（H2-1）：對(duì)照，常規(guī)施肥;處理2（H2-2）：在對(duì)照的基礎(chǔ)上，移栽時(shí)施用225 kg/hm2菌劑1，可穴施，也可澆施，團(tuán)棵期再澆施75 kg/hm2菌劑1;處理3（H2-3）：在對(duì)照基礎(chǔ)上施用 45 kg/hm2菌劑2，團(tuán)棵期澆施45 kg/hm2菌劑2;處理4（H2-4）：處理2和處理3的組合，即移栽時(shí)施用45 kg/hm2菌劑2和225 kg/hm2菌劑1，團(tuán)棵期再澆施75 kg/hm2菌劑1和45 kg/hm2菌劑2。菌劑1是解淀粉芽孢桿菌，菌劑2是生防菌組合，菌劑活菌含量5億/g 以上。供試煙田烤煙品種為云煙87。

在移栽前、煙株團(tuán)棵期、旺長(zhǎng)期和成熟期采集根際土壤土樣，用5點(diǎn)取樣法，去掉煙株根際表層土壤，采5～20 cm耕層土壤，混合后取土樣總量1 kg，每個(gè)處理取3個(gè)平行樣，編號(hào)移栽前YH開(kāi)頭，團(tuán)棵期TH開(kāi)頭，旺長(zhǎng)期WH開(kāi)頭，成熟期CH開(kāi)頭。每個(gè)樣品過(guò)篩除去根等雜質(zhì)后取少量土壤裝入10 mL帶蓋的離心管中，儲(chǔ)存于有冰袋的保溫箱中，帶回實(shí)驗(yàn)室-20 ℃ 保存，并及時(shí)送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行多樣性測(cè)序與分析。取部分土壤風(fēng)干，用于常規(guī)分析。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 微生物多樣性分析。由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司對(duì)樣本土壤微生物進(jìn)行16S/18S多樣性測(cè)序[14]。

1.3.2 土壤養(yǎng)分含量。土壤pH采用電位法測(cè)定，土壤有機(jī)質(zhì)和土壤養(yǎng)分測(cè)定用國(guó)標(biāo)方法[15]。

1.4 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010、SPSS 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。多樣性基因測(cè)序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司信息平臺(tái)相應(yīng)軟件進(jìn)行分析[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)和酶活性

移栽前、團(tuán)棵期和成熟期土壤理化性質(zhì)見(jiàn)表1。從表1可以看出，移栽前堿解氮和有效磷含量最低，有機(jī)質(zhì)含量最高，速效鉀與成熟期差不多。有機(jī)質(zhì)和速效鉀含量在煙株生長(zhǎng)過(guò)程中先降低再升高，堿解氮和有效磷含量先增加成熟期又減少。團(tuán)棵期4個(gè)處理之間，對(duì)照的有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分含量均最高，說(shuō)明加入菌劑后土壤中微生物群落發(fā)生變化，進(jìn)而使養(yǎng)分發(fā)生改變，添加菌劑后土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化為作物容易吸收的成分，作物吸收快，土壤中的養(yǎng)分均比對(duì)照低。成熟期4個(gè)處理之間，有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分均是對(duì)照最少，到煙草成熟期，作物吸收養(yǎng)分的速度大大降低，而微生物持續(xù)轉(zhuǎn)化養(yǎng)分，CH2-4最高，說(shuō)明混合施用菌劑和解淀粉芽孢桿菌的土壤微生物轉(zhuǎn)化速度最高，使土壤有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分較高，對(duì)照與CH2-2之間相差不大，說(shuō)明施用混合生防菌劑2對(duì)土壤有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分的影響較大。

移栽前和成熟期土壤酶活性見(jiàn)表2。由表2可知，酶活性在移栽前均高于成熟期土壤，說(shuō)明移栽前微生物活性比種上煙葉后的成熟期高。成熟期脲酶、過(guò)氧化氫酶和轉(zhuǎn)化酶都是CH2-4最高，CH2-2最低，磷酸酶是CH2-3最高，CH2-2最低，蛋白酶是CH2-2最高，對(duì)照最低，說(shuō)明單獨(dú)施用解淀粉芽孢桿菌菌劑，降低了酶活性，但提高了蛋白酶活性，施用混合生防菌劑2提高了磷酸酶活性，混合施用則大大提高了脲酶和轉(zhuǎn)化酶活性。

2.2 土壤含水率和pH

不同時(shí)期土壤含水率變化見(jiàn)表3。由表3可知，2019年移栽前含水率非常低，試驗(yàn)田移栽前嚴(yán)重干旱，在整個(gè)煙株生長(zhǎng)時(shí)期都沒(méi)有得到改善，含水率都沒(méi)有超過(guò)20%，后期煙草花葉病和氣候斑發(fā)病較高，嚴(yán)重影響煙株的生長(zhǎng)和煙葉質(zhì)量。

試驗(yàn)田土壤pH見(jiàn)圖1。試驗(yàn)田移栽前土壤pH為近中性，種上煙后土壤pH降低較多，移栽前土壤pH為近中性，種上煙后土壤pH先降低后升高。團(tuán)棵期、旺長(zhǎng)期和成熟期其他處理均比對(duì)照高，處理H2-4最高，團(tuán)棵期比對(duì)照高0.32，成熟期比對(duì)照高0.44。說(shuō)明混合施用菌劑1和菌劑2可從團(tuán)棵期開(kāi)始有效提高土壤的pH，一直到煙葉成熟。

2.3 農(nóng)藝性狀 試驗(yàn)田農(nóng)藝性狀見(jiàn)表4。由表4可知，處理H2-4的農(nóng)藝性狀最好，添加單類(lèi)菌劑對(duì)煙葉生長(zhǎng)有一定的作用，2種菌劑復(fù)合施用效果最好。

2.4 微生物基因測(cè)序分析

2.4.1 Alpha多樣性。試驗(yàn)田細(xì)菌多樣性見(jiàn)表5。不同時(shí)期細(xì)菌總數(shù)先增加后降低，團(tuán)棵期最高，成熟期最低，多樣性先降低又稍有增加，都沒(méi)有移栽前高。團(tuán)棵期為T(mén)H2-2細(xì)菌總數(shù)最高，多樣性最低，TH2-3和TH2-4細(xì)菌總數(shù)和多樣性相差不大。旺長(zhǎng)期WH2-4細(xì)菌總數(shù)和多樣性為最高，WH2-3稍低，對(duì)照的多樣性最低。成熟期細(xì)菌總數(shù)和多樣性均是CH2-3最高，CH2-4稍低，CH2-2最低。說(shuō)明種上煙后土壤細(xì)菌有趨于相同性，細(xì)菌多樣性降低。添加菌劑1在團(tuán)棵期使部分細(xì)菌數(shù)量大大增加而減少了多樣性，但添加生物菌劑2后，土壤細(xì)菌均衡變化，細(xì)菌多樣性增加。

2.4.2 微生物群落結(jié)構(gòu)。試驗(yàn)田不同時(shí)期不同處理土壤樣本的細(xì)菌在門(mén)水平和屬水平上的群落結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖2和圖3。從細(xì)菌門(mén)水平群落結(jié)構(gòu)看出，相對(duì)豐度在5%以上的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)有Proteobacteria（變形菌門(mén)）、Actinobacteria（放線菌門(mén)）、Acidobacteria（酸桿菌門(mén)）、Chloroflexi（綠彎菌門(mén)）、Bacteroidetes（擬桿菌門(mén)）和Gemmatimonadetes（芽單孢菌門(mén)）。除TH2-2（占總細(xì)菌含量的82.71%），厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度較高，占總菌數(shù)的13.97%，其余樣本中6個(gè)菌門(mén)占整個(gè)細(xì)菌門(mén)的93%以上。移栽前土壤中放線菌門(mén)和綠彎菌門(mén)相對(duì)豐度分別為38.12%和15.69%，種上煙草后相對(duì)豐度顯著下降，特別是放線菌到成熟期最低，但成熟期中CH2-4最高，團(tuán)棵期和旺長(zhǎng)期則是CH2-3稍高。變形菌門(mén)在移栽前土壤中相對(duì)豐度為22.82%，種上煙后顯著增加，TH2-1增加到52.49%，為團(tuán)棵期最高，也是整個(gè)樣本中最高，旺長(zhǎng)期WH2-4稍高，成熟期還是對(duì)照比其他處理稍高。酸桿菌門(mén)先降低后增加，成熟期CH2-3和CH2-4稍高，CH2-3增加到整個(gè)樣本中最高達(dá)14.15%。擬桿菌門(mén)種上煙草后顯著增加，特別是團(tuán)棵期對(duì)照增加了近3倍，后3個(gè)時(shí)期都是CH2-4中相對(duì)豐度最高。芽單孢菌門(mén)種上煙后逐漸增加。

從土壤細(xì)菌在屬水平上的群落結(jié)構(gòu)可以看出，相對(duì)豐度在前6的細(xì)菌為Sphingomonas（鞘氨醇單孢菌屬）、Arthrobacter（節(jié)桿菌屬）、norank_c_Subgroup_6、unclassified_f_Rhizobiaceae（根瘤菌科未分類(lèi)菌屬）、norank_f_Roseiflexaceae、norank_f_Gemmatimonadaceae（芽單孢菌科未命名菌屬）。其中鞘氨醇單孢菌屬移栽前相對(duì)豐度僅為1.42%，種上煙后顯著增加，到成熟期CH2-2增加到最大為27.96%，對(duì)照最低，該菌是土壤有益菌，提高土壤氮素轉(zhuǎn)化和作物抵抗不良環(huán)境的能力，

施用菌劑利于土壤向健康轉(zhuǎn)化，與李忠奎等[16]研究結(jié)果一致。節(jié)桿菌屬移栽前相對(duì)豐度最高為14.37%，種上煙后顯著降低，旺長(zhǎng)期稍有增加成熟期又降低，團(tuán)棵期和旺長(zhǎng)期均為H2-3最高，成熟期CH2-4最高。norank_f_Roseiflexaceae在移栽前相對(duì)豐度高，種上煙后減少，CH2-2和CH2-4在成熟期相對(duì)豐度較高。norank_c_Subgroup_6和norank_f_Gemmatimonadaceae（芽單孢菌科未命名菌屬）種上煙后先降低后增加，norank_c_Subgroup_6在CH2-2和CH2-3增加多，芽單孢菌科未命名菌屬在WH2-2相對(duì)豐度較高。unclassified_f_Rhizobiaceae（根瘤菌科未分類(lèi)菌屬）在種上煙后先增加又降低，TH2-3和WH2-4相對(duì)豐度較高。這些菌屬的變化說(shuō)明施加解淀粉芽孢桿菌對(duì)有益菌的生長(zhǎng)有利，施用生防菌劑有利于調(diào)節(jié)細(xì)菌群落。

2.4.3 Beta多樣性分析。

土壤樣本細(xì)菌在OTU水平上的主坐標(biāo)分析（PCoA）見(jiàn)圖4。從圖4可以看出，不同時(shí)期土壤樣本之間有差異，特別是移栽前土壤樣本微生物與種上煙后的土壤樣本差異較大。移栽前樣本與其他樣本之間相距較遠(yuǎn)，說(shuō)明他們之間的細(xì)菌群落差異較大，團(tuán)棵期的TH2-4與其余3個(gè)樣本之間差異較大，旺長(zhǎng)期和成熟期相差較近，其中旺長(zhǎng)期的WH2-2與其余3個(gè)樣本之間差異較大，WH2-3和WH2-4相差較近，成熟期對(duì)照CH2-1與另外3個(gè)樣本相差較遠(yuǎn)，其余3個(gè)樣本相差較近，幾乎重疊在一起，說(shuō)明這3個(gè)樣本的細(xì)菌群落非常相似，而與對(duì)照之間有一定的差異。

2.4.4 微生物群落與環(huán)境因子關(guān)聯(lián)分析。

RDA/CCA分析是主要用來(lái)反映菌群與環(huán)境因子之間的關(guān)系，可以檢測(cè)環(huán)境因子、樣品、菌群三者之間的關(guān)系或者兩兩之間的關(guān)系。對(duì)試驗(yàn)田土壤樣本細(xì)菌菌群豐度與土壤性質(zhì)指標(biāo)做冗余分析（Redundancy analysis，RDA）。土壤理化性主要有pH、含水率（MC）、有機(jī)質(zhì)（OM）、堿解氮（AN）、速效磷（AP）、速效鉀（AK），分析結(jié)果見(jiàn)圖5。

從圖5可以看出，第一主軸RDA1解釋所有變量的84.11%，第二主軸RDA2解釋所有變量的7.18%，共解釋物種和環(huán)境因子總方差的91.29%。OM（r=0.942 3）、AN（r=-0.748 9）、AP（r=-0.945 3）、AK（r=0.972 7）、pH（r=-0.868 1）、MC（r=-0.986 7）都與第一主軸相關(guān)，其中AN、AP為顯著相關(guān)，其余因子為極顯著相關(guān)，放線菌門(mén)和綠彎菌門(mén)與第一主軸正相關(guān)，變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和芽單孢菌門(mén)與第一主軸負(fù)相關(guān)，酸桿菌門(mén)與第二主軸正相關(guān)。AK和OM與放線菌極顯著正相關(guān)，特別是速效鉀與放線菌幾乎重疊，與綠彎菌門(mén)正相關(guān)，其余因子與變形菌門(mén)、芽單孢菌門(mén)和擬桿菌門(mén)正相關(guān)，有效磷與擬桿菌門(mén)極顯著正相關(guān)，二者箭頭方向幾乎重疊。從環(huán)境因子與樣本之間的關(guān)系可以看出，移栽前樣本受速效鉀和有機(jī)質(zhì)的影響較大，其余因子則對(duì)成熟期樣本影響較大。

3 結(jié)論

施用生物菌劑各處理pH比對(duì)照稍有增加，混合施用處理的最高，成熟期比對(duì)照高0.44。單獨(dú)施用解淀粉芽孢桿菌促進(jìn)了某些細(xì)菌的生長(zhǎng)，總數(shù)增加但多樣性減少，施用生防菌劑可增加土壤細(xì)菌的多樣性。

土壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)有Proteobacteria（變形菌門(mén)）、Actinobacteria（放線菌門(mén)）、Acidobacteria（酸桿菌門(mén)）、Chloroflexi（綠彎菌門(mén)）、Bacteroidetes（擬桿菌門(mén)）和Gemmatimonadetes（芽單孢菌門(mén)），與李忠奎等[16]研究一致。菌門(mén)的變化說(shuō)明施加解淀粉芽孢桿菌對(duì)有益菌的生長(zhǎng)有利，施用生物有機(jī)肥對(duì)一些菌屬的調(diào)節(jié)有利。Beta多樣性分析說(shuō)明施用生物菌劑影響土壤細(xì)菌群落，特別是到成熟期，對(duì)照與處理間的細(xì)菌群落差異較大。

不同時(shí)期有顯著差異的有變形菌門(mén)、綠彎菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)，有顯著差異的菌屬有鞘氨醇單孢菌屬、節(jié)桿菌屬、弗拉托氏菌屬、鏈霉菌屬。環(huán)境因子分析表明AN、AP為顯著相關(guān)因子，OM、AK、pH、MC為極顯著相關(guān)因子，對(duì)土壤細(xì)菌群落的影響較大，調(diào)節(jié)這些因子可以調(diào)節(jié)土壤細(xì)菌群落，從而改善土壤微環(huán)境，達(dá)到防治土傳病害發(fā)生的目的。

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