張鵬 鞏新民 李玉燕 王懷娜 包丹丹 祝永華 郭龍宗

摘? 要：霉菌毒素目前常用的檢測(cè)方法有薄層層析法（TLC）、色譜法、質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、免疫化學(xué)檢測(cè)法等。各種檢測(cè)方法的靈敏度、準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性、檢測(cè)環(huán)境、操作難易程度、設(shè)備和費(fèi)用的局限應(yīng)用領(lǐng)域有較大的差異。本實(shí)驗(yàn)室采用高效液相色譜（HPLC-MS/MS）、橫向流動(dòng)免疫技術(shù)（LFD）、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）三種方法測(cè)定玉米基質(zhì)定值質(zhì)控品A、B、C樣品的嘔吐毒素、黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮三種毒素的含量，評(píng)估空白樣品和定值質(zhì)控品的檢測(cè)結(jié)果和回收率，根據(jù)臨床應(yīng)用，比較三種不同的霉菌毒素檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)。準(zhǔn)確度評(píng)估結(jié)果顯示：HPLC-MS/MS法>ELISA法>LFD法，但三種方法都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，實(shí)際生產(chǎn)可以靈活選擇使用。

關(guān)鍵詞：霉菌毒素; 色譜法;橫向流動(dòng)免疫技術(shù);酶聯(lián)免疫吸附法

中圖分類(lèi)號(hào)：S856.9? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B? ? ? ? 文章編號(hào)：1673-1085（2021）5-0005-05

霉菌毒素是指霉菌在寄生物質(zhì)上進(jìn)行生命活動(dòng)所產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物，常見(jiàn)的寄生物質(zhì)包括食品或農(nóng)作物等。這些有毒物質(zhì)被人和動(dòng)物攝入體內(nèi)后，會(huì)引起肝臟、腎臟、生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、被皮系統(tǒng)等各器官機(jī)能障礙，甚至危及生命。霉菌毒素廣泛存在于自然界中，種類(lèi)繁多，常見(jiàn)的有黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素、T-2毒素等。因霉菌毒素污染給食品加業(yè)、畜禽養(yǎng)殖業(yè)、飼料加工業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因此霉菌毒素污染問(wèn)題已經(jīng)被現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)者以及食品加工業(yè)高度重視，各種霉菌毒素的檢測(cè)技術(shù)及檢測(cè)試劑應(yīng)運(yùn)而生。目前常用的霉菌毒素檢測(cè)方法有薄層層析法（TLC）、色譜法（薄層色譜TLC、氣相色譜GC、高效液相色譜HPLC）、質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（氣質(zhì)聯(lián)用CG-MS、液質(zhì)聯(lián)用HPLC-MS/MS）、免疫化學(xué)檢測(cè)法（橫向流動(dòng)免疫技術(shù)LFD、膠體金免疫層析法、酶聯(lián)免疫吸附法ELISA）等。本實(shí)驗(yàn)室采用臨床常用的三種檢測(cè)方法測(cè)定玉米基質(zhì)A、B、C樣品的嘔吐毒素、黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮三種毒素的含量，比較三種不同的霉菌毒素檢測(cè)方法的結(jié)果差異，總結(jié)與探討霉菌毒素檢測(cè)方法在各領(lǐng)域應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)和劣勢(shì)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 玉米基質(zhì)樣品? 待檢樣品為玉米基質(zhì)A、B、C 3份，其中A為空白樣品（<10ppb），B、C為定

值的質(zhì)控樣品。B樣品嘔吐毒素的真實(shí)值為（0.705±0.055） ppb，玉米赤霉烯酮的真實(shí)值為（125±15） ppb，黃曲霉毒素B1的真實(shí)值為（13.5±1.5） ppb;C樣品嘔吐毒素的真實(shí)值為（1.41±0.11） ppb，玉米赤霉烯酮的真實(shí)值為（250±30） ppb，黃曲霉毒素B1的真實(shí)值為（27±3） ppb。

1.1.2? 主要試劑? 選取2個(gè)品牌的3個(gè)品項(xiàng)的ELISA

檢測(cè)試劑盒（嘔吐毒素ELISA檢測(cè)試劑盒、玉米赤霉烯酮ELISA檢測(cè)試劑盒、黃曲霉毒素B1 ELISA檢測(cè)試劑盒），2個(gè)品牌的3個(gè)品項(xiàng)的LFD快速定量檢測(cè)條（嘔吐毒素LFD快速定量檢測(cè)條、玉米赤霉烯酮LFD快速定量檢測(cè)條、黃曲霉毒素B1 LFD快速定量檢測(cè)條），多功能凈化柱、色譜級(jí)甲醇、色譜級(jí)乙腈、正己烷、乙酸、三氟乙酸、霉菌毒素標(biāo)準(zhǔn)液等。

1.1.3? 主要儀器? MK3酶標(biāo)儀（美ThermoFisher公司），LFD快速定量檢測(cè)條配套檢測(cè)儀，液相質(zhì)譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（型號(hào)1290/6460，美國(guó)Agilent公司），電子天平，粉碎機(jī)，離心機(jī)，水浴鍋等。

1.2? 方法? 檢測(cè)方法為色譜法（HPLC-MS/MS）、

酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、橫向流動(dòng)免疫技術(shù)（LFD）。霉菌毒素檢測(cè)樣品的預(yù)處理及實(shí)驗(yàn)分析嚴(yán)格按照試劑盒和儀器的操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，完成A、B、C三份待檢樣品的含量測(cè)定并計(jì)算檢測(cè)結(jié)果和回收率。實(shí)驗(yàn)依據(jù)GB/T27404-2008實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)附錄F（資料性附錄）檢測(cè)方法確認(rèn)的技術(shù)要求，回收率參考范圍見(jiàn)表1。

2? 結(jié)果

2.1? B樣品和C樣品嘔吐毒素（DON）檢測(cè)數(shù)據(jù)

結(jié)果? 本次實(shí)驗(yàn)對(duì)B樣品和C樣品中的嘔吐毒素

（DON）采用3種方法進(jìn)行88次檢測(cè)，其中采用LFD方法進(jìn)行22次檢測(cè)，合格率為36.4%（8/22）;采用ELISA方法進(jìn)行62次檢測(cè)，合格率為69.4%（43/62）;HPLC-MS/MS方法進(jìn)行4次檢測(cè)，合格率為100%（4/4）。

檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2? B樣品和C樣品玉米赤霉烯酮（ZEN）檢測(cè)數(shù)

據(jù)結(jié)果? B樣品和C樣品玉米赤霉烯酮（ZEN）采用3種方法進(jìn)行73次檢測(cè)，其中采用LFD方法進(jìn)行15次檢測(cè)，合格率為53.3%（8/15）;采用ELISA方法進(jìn)行51次檢測(cè)，合格率為64.7%（33/51）;HPLC-MS/MS方法進(jìn)行7次檢測(cè)，合格率為71.4%（5/7）。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.2? B樣品和C樣品玉米赤霉烯酮（ZEN）檢測(cè)數(shù)

據(jù)結(jié)果? B樣品和C樣品玉米赤霉烯酮（ZEN）采用3種方法進(jìn)行73次檢測(cè)，其中采用LFD方法進(jìn)行15次檢測(cè)，合格率為53.3%（8/15）;采用ELISA方法進(jìn)行51次檢測(cè)，合格率為64.7%（33/51）;HPLC-MS/MS方法進(jìn)行7次檢測(cè)，合格率為71.4%（5/7）。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.3? B樣品和C樣品黃曲霉毒素B1檢測(cè)數(shù)據(jù)結(jié)果

B樣品和C樣品黃曲霉毒素B1采用3種方法進(jìn)行73次檢測(cè)，其中采用LFD方法進(jìn)行16次檢測(cè)，合格率為56.3%（9/16）;采用ELISA方法進(jìn)行51次檢測(cè)，合格率為72.5%（37/51）;HPLC-MS/MS方法進(jìn)行6次檢測(cè)，合格率為83.3%（5/6）。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3。

3? 討論

從B、C兩份玉米基質(zhì)樣品的檢測(cè)結(jié)果我們可以得出，HPLC-MS/MS法準(zhǔn)確度高，穩(wěn)定性和重復(fù)性高，能夠檢出飼料及食品中少量的霉菌毒素，很少出現(xiàn)假陽(yáng)性，是比較理想的一種霉菌毒素檢測(cè)方法;但由于此方法所用儀器耗材昂貴，對(duì)操作人員的技術(shù)要求較高，檢測(cè)方法及樣品前處理相對(duì)繁瑣，操作難度較大，檢測(cè)結(jié)果相對(duì)滯后，并未在畜禽養(yǎng)殖及飼料加工企業(yè)中廣泛應(yīng)用，多應(yīng)用于一些專(zhuān)業(yè)的檢測(cè)機(jī)構(gòu)以及科研領(lǐng)域。

ELISA方法的準(zhǔn)確度略低于色譜法，其優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、干擾小、安全性高、污染少、成本低、快速定量檢測(cè)，而且對(duì)樣品純度要求不高，無(wú)需貴重儀器;其缺點(diǎn)是ELISA試劑盒容易受溫度、試劑盒品牌、酶標(biāo)儀的靈敏度影響，導(dǎo)致穩(wěn)定性和可重復(fù)性略差，本方法適用于飼料廠、糧食粗加工、養(yǎng)殖場(chǎng)對(duì)飼料原料的篩選及成品飼料的霉菌毒素含量檢測(cè)。

LFD的方法簡(jiǎn)便快速，無(wú)需復(fù)雜的設(shè)備、攜帶方便，適用于飼料生產(chǎn)及糧食粗加工現(xiàn)場(chǎng)，對(duì)操作人員的專(zhuān)業(yè)知識(shí)要求不高，準(zhǔn)確度略低于色譜法和ELISA法。此方法適用于飼料廠、糧食粗加工廠對(duì)原料及糧食的初篩，必要的時(shí)候采用色譜法或ELISA法對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)。

在人類(lèi)對(duì)食品安全意識(shí)和動(dòng)物福利意識(shí)不斷提高的當(dāng)下，霉菌毒素的檢測(cè)在糧食加工企業(yè)、飼料廠及養(yǎng)殖企業(yè)也得到高度重視。因此，實(shí)驗(yàn)室無(wú)論采用哪種檢測(cè)方法，在首次采用方法前都要對(duì)分析方法的適用性、準(zhǔn)確度、檢出限和定量限、線性及校準(zhǔn)、回收率、穩(wěn)定性、測(cè)量的不確定性進(jìn)行評(píng)估和驗(yàn)證，根據(jù)實(shí)際需要選擇一套簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，保證檢測(cè)結(jié)果有科學(xué)依據(jù)以及準(zhǔn)確、可靠、可行。

Application of different detection methods of mycotoxin in feed production*

ZHANG Peng ，GONG Xinmin， LI Yuyan， WANG huaina，BAO Dandan，ZHU Yonghua** ，GUO Longzong**

（Shandong Yisheng Animal and Poultry Breeding Company，Shandong Yantai 264680，China）

Abstract： Thin layer chromatography （TLC）， chromatography， mass spectrometry and immunochemistry are commonly used to detect mycotoxins now. There are great differences in sensitivity， accuracy， stability， detection environment， operation difficulty， equipment and cost of various detection methods. The contents of vomit toxin， aflatoxin B1 and zearalenone in samples A， B and C were determined by high performance liquid chromatography （HPLC-MS / MS）， LFD and ELISA. The detection results and recovery rates of blank samples and quality control samples were evaluated. The advantages and disadvantages of three different mycotoxin detection methods were compared. The accuracy evaluation results showed that： HPLC-MS / MS > ELISA > LFD method， but the three methods have their own advantages and disadvantages， and can be flexibly used in actual production.

Keywords：Mycotoxin;Chromatography; Cross flow immunoassay; Enzyme linked immunosorbent assay.