盧聰 史平玲 楊琪翔 宋昊 李苗 張貝貝 宋宗明

河南大學(xué)人民醫(yī)院 河南省人民醫(yī)院眼科 河南省立眼科醫(yī)院 河南省眼科研究所，鄭州 450003

持續(xù)的視網(wǎng)膜缺血、缺氧會(huì)造成組織細(xì)胞損傷，引起細(xì)胞凋亡或壞死，進(jìn)而導(dǎo)致糖尿病視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞和早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變等疾病的發(fā)生和發(fā)展，造成嚴(yán)重的視力損害[1]。研究表明，缺氧能夠引起視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細(xì)胞以及視網(wǎng)膜血管功能的紊亂，在缺氧環(huán)境中RPE細(xì)胞會(huì)持續(xù)表達(dá)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)[2-4]，促使視網(wǎng)膜及脈絡(luò)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞不斷分裂增生，形成異常新生血管，繼而引起視力的不可逆損害。因此，減緩甚至阻止視網(wǎng)膜缺血缺氧進(jìn)程變得尤為重要。低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factors-1α，HIF-1α)是一種重要的核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在缺氧條件下被激活，并誘導(dǎo)包括VEGF在內(nèi)的多種基因產(chǎn)物的表達(dá)[5]。RPE細(xì)胞位于神經(jīng)視網(wǎng)膜外的色素細(xì)胞層，與上層視網(wǎng)膜感光細(xì)胞和下層脈絡(luò)膜緊密相連并滋養(yǎng)視網(wǎng)膜感光細(xì)胞，在缺血或低氧狀態(tài)下極易受到影響并造成損傷[2,6-7]。深入探討低氧誘導(dǎo)RPE細(xì)胞損傷的分子機(jī)制有助于相關(guān)疾病的早期防治，改善患者預(yù)后。轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)又稱RNA測序(RNA sequencing，RNA-seq)，具有高通量、全方位、快速獲取轉(zhuǎn)錄本的特點(diǎn)[8-9]。用于定量基因在細(xì)胞、組織、器官乃至整個(gè)機(jī)體中的表達(dá)異質(zhì)性，在破譯基因組結(jié)構(gòu)和功能、識(shí)別細(xì)胞生物系統(tǒng)下的遺傳網(wǎng)絡(luò)、建立應(yīng)對(duì)疾病、病原體的分子生物標(biāo)志物等方面發(fā)揮著重要作用[10-12]。生物信息學(xué)技術(shù)是采用計(jì)算機(jī)技術(shù)結(jié)合信息論方法對(duì)蛋白質(zhì)、核酸信息進(jìn)行采集、存儲(chǔ)、傳遞以及分析的科學(xué)，通過數(shù)據(jù)庫建設(shè)、序列分析、結(jié)構(gòu)分析與功能預(yù)測、大規(guī)模功能表達(dá)譜分析、代謝網(wǎng)絡(luò)建模分析等，整合數(shù)據(jù)量巨大的核酸、蛋白質(zhì)信息，使之成為具有明確生物學(xué)意義的生物信息[13-14]。本實(shí)驗(yàn)擬通過RNA-seq及生物信息學(xué)技術(shù)分析低氧與常氧處理下的ARPE-19細(xì)胞基因表達(dá)譜變化，探討低氧誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞損傷發(fā)生和發(fā)展可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞來源 ARPE-19細(xì)胞購自美國ATCC公司。

1.1.2主要試劑及儀器 胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(11011-8611，浙江天杭生物科技股份有限公司)；DMEM-F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶-EDTA溶液(北京索萊寶科技有限公司)；Trizol?試劑(美國Thermo Fisher公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒TB Green?premix Ex TaqTMⅡ試劑(日本Takara Biotechnology公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物(上海生工生物工程股份有限公司)；細(xì)胞活力(活死細(xì)胞染色)檢測試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)。細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher公司)；Stepone Plus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)；熒光顯微鏡(德國Carl Zeiss公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將保存于液氮中的ARPE-19細(xì)胞置于37 ℃恒溫水浴鍋中解凍復(fù)蘇，待細(xì)胞融化后快速轉(zhuǎn)移至含體積分?jǐn)?shù)10% FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基15 ml的離心管中混勻，室溫下156×g離心5 min，棄上清，用1 ml培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞沉淀，吹打均勻后將細(xì)胞置于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每瓶中加入3～4 ml培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。待ARPE-19細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%進(jìn)行傳代培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)基，使用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)清洗2次。每瓶加入1 ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%的胰蛋白酶-EDTA消化液，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱消化2 min取出。每瓶加入1 ml DMEM-F12培養(yǎng)基終止胰蛋白酶消化，轉(zhuǎn)移至15 ml離心管，156×g離心5 min，棄上清液。加入DMEM-F12培養(yǎng)基吹勻，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以2×107/皿細(xì)胞的密度將ARPE-19細(xì)胞接種至直徑10 cm培養(yǎng)皿中，并置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，待細(xì)胞貼壁生長后將細(xì)胞分為常氧對(duì)照組和低氧處理組，分別置于體積分?jǐn)?shù)21%和1% O2的三氣培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)8、24、48和72 h，收集細(xì)胞，以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2RNA-seq及生物信息學(xué)分析 低氧處理組與常氧對(duì)照組各設(shè)6個(gè)細(xì)胞生物學(xué)重復(fù)樣本，于處理后8 h和24 h各組各收集3個(gè)細(xì)胞樣本，使用2 ml/皿Trizol?試劑進(jìn)行處理，每個(gè)樣品取1 ml送至武漢華大醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所提取總RNA，通過Fragment Analyzer進(jìn)行濃度和質(zhì)量檢測，質(zhì)量合格的RNA使用BGISEQ-500平臺(tái)進(jìn)行RNA-seq，測序長度為SE50，絕大多數(shù)轉(zhuǎn)錄本被完整覆蓋，同時(shí)reads均勻分布在轉(zhuǎn)錄本的各個(gè)區(qū)域。原始數(shù)據(jù)(raw reads)以FASTQ格式記錄，經(jīng)Trimmomatic軟件過濾掉包含接頭的reads(接頭污染)、未知堿基N含量大于5%的reads(N表示無法確定的堿基信息)、低質(zhì)量reads(質(zhì)量值Q<10的堿基數(shù)占整個(gè)reads總堿基的比例大于20%以上的reads)，得到高質(zhì)量clean reads，以保證結(jié)果的可靠性。使用HISAT將clean reads比對(duì)到參考基因組序列，使用Bowtie2將clean reads比對(duì)到參考基因序列，使用標(biāo)準(zhǔn)化算法FPKM(fragments per kilo-base per million mapped fragments)，即每百萬個(gè)片段中比對(duì)上某轉(zhuǎn)錄本每千堿基長度的片段數(shù)目作為基因表達(dá)水平的衡量指標(biāo)。本研究將|log2FC|≥1、P≤0.05的基因作為篩選差異表達(dá)基因(differentially expressed genes，DEGs)的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)DEGs進(jìn)行生物信息學(xué)分析。用火山圖描繪低氧刺激ARPE-19細(xì)胞8 h和24 h后DEGs的分布情況。使用R語言中的pheatmap包對(duì)DEGs進(jìn)行基因間與樣本間的聚類熱圖分析。每列代表1個(gè)樣品，每行代表1個(gè)轉(zhuǎn)錄本，顏色越紅表達(dá)量越高，顏色越綠表達(dá)量越低。采用Dr.TOM系統(tǒng)對(duì)DEGs進(jìn)行基因本體論(Gene Ontology，GO)功能注釋分析及京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)信號(hào)通路富集分析，篩選出參與調(diào)控低氧反應(yīng)的信號(hào)通路，采用String數(shù)據(jù)庫和Cytoscape軟件構(gòu)建ARPE-19細(xì)胞處理24 h后DEGs的蛋白-蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)圖，尋找參與低氧反應(yīng)的功能性靶基因。連線代表基因間的調(diào)控關(guān)系。顏色越亮、圖標(biāo)越大代表該基因在網(wǎng)絡(luò)中與其他基因關(guān)系越密切，功能越重要。

表1 2個(gè)組DEGs引物序列Table 1 Primer sequence of DEGs in the two groups基因 NM.序列號(hào)引物序列(5’-3’)log2FCDEPP1NM_145980.2正向:GTGAGGTCTATATCTCGACTGGC反向:ACTGAAACGTGCGGTGATGT1.574349NPPBNM_008726.6正向:TGGAAACGTCCGGGTTACAG反向:CTGATCCGGTCCATCTTCCT1.419870PDZK1NM_002614.4正向:CATGATCCTGACCGTCGGAAA反向:TGCTCACTGGACCTGAAACTG1.452112HILPDANM_001193365.1正向:AAGCATGTGTTGAACCTCTACC反向:TGTGTTGGCTAGTTGGCTTCT1.397986NDRG1NM_001135242.2正向:CTCCTGCAAGAGTTTGATGTCC反向:TCATGCCGATGTCATGGTAGG1.260060RORCNM_005060.4正向:CTGGGCATGTCCCGAGATG反向:GAGGGGTCTTGACCACTGG1.836842TCEA3NM_003196.3正向:CCCCAAAACACCTAGCAGC反向:CTTCATGTCCGTGCTCTTGAG1.230815TFRCNM_011638.4正向:GGCTACTTGGGCTATTGTAAAGG反向:CAGTTTCTCCGACAACTTTCTCT-2.138634NQO1NM_000903.3正向:GAAGAGCACTGATCGTACTGGC反向:GGATACTGAAAGTTCGCAGGG-1.101194 注:DEGs:差異表達(dá)基因;FC:倍數(shù)變化 Note:DEGs:differentially expressed genes;FC:fold change

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測與低氧相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平 將1.2.1中收集的ARPE-19細(xì)胞使用Trizol法提取細(xì)胞的總RNA，經(jīng)Thermo SPECTRONIC 200分光光度計(jì)檢測其濃度和吸光度(A)值。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR定量VEGF、HIF-1α mRNA表達(dá)量，預(yù)實(shí)驗(yàn)以對(duì)低氧刺激較為敏感的VEGF和HIF-1α在mRNA水平上發(fā)生的變化為條件篩選合適時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行RNA-seq。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)中不同時(shí)間點(diǎn)mRNA表達(dá)量的差異結(jié)果并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[4,15-16]，選擇mRNA表達(dá)差異較大的8 h、24 h這2個(gè)時(shí)間點(diǎn)，收集樣本后進(jìn)行RNA-seq。根據(jù)測序結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道，篩選DEGs中可能與低氧相關(guān)的9個(gè)基因DEPP1、NPPB、PDZK1、HILPDA、TCEA3、NDRG1、RORC、TFRC和NQO1，驗(yàn)證高通量測序結(jié)果的準(zhǔn)確性。設(shè)計(jì)9個(gè)基因的正向引物和反向引物(表1)，以β-actin為內(nèi)參基因。使用TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)；用于定量的反應(yīng)體系包括TB Green?Premix Ex Taq Ⅱ 10.0 μl，ROX reference Dye 0.4 μl，正向引物和反向引物各2.0 μl，cDNA模板5.6 μl，共20.0 μl。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火，延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；同一樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔。采用2-△△CT法計(jì)算各個(gè)基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.4細(xì)胞活性熒光染色檢測低氧環(huán)境下細(xì)胞生存狀態(tài) 取處于對(duì)數(shù)生長期的ARPE-19細(xì)胞，接種至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔2×104個(gè)細(xì)胞，置于37 ℃、5% CO2、1% O2培養(yǎng)箱孵育8、24、48、72 h后，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，使用細(xì)胞活力檢測試劑盒按照說明書向孔內(nèi)加入檢測試劑進(jìn)行染色，使用ImageJ軟件分析及熒光顯微鏡成像觀察低氧處理后不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的生存狀態(tài)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。本研究中計(jì)量資料數(shù)據(jù)經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗(yàn)證實(shí)呈正態(tài)分布，以mean±SD表示。常氧對(duì)照組與低氧處理組不同時(shí)間點(diǎn)VEGF、HIF-1α和DEGs mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2個(gè)組不同時(shí)間點(diǎn)ARPE-19細(xì)胞中VEGF、HIF-1α mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

低氧處理組8、24、48、72 h VEGF和低氧處理組8、24、48 h HIF-1α mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于常氧對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；2個(gè)組VEGF和HIF-1α mRNA相對(duì)表達(dá)量在24 h時(shí)差異最大，其次是8 h(表2)。本實(shí)驗(yàn)選擇8 h、24 h作為低氧處理時(shí)間，處理后收集樣本進(jìn)行RNA-seq。

表2 2個(gè)組ARPE-19細(xì)胞處理后不同時(shí)間點(diǎn)VEGF和HIF-1α mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較(mean±SD)Table 2 Comparison of the relative mRNA expression levels of VEGF and HIF-1α in ARPE-19 cells after treatment at different time points between the two groups (mean±SD)組別樣本量不同時(shí)間點(diǎn)VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量8h24h48h72h常氧對(duì)照組31.00±0.141.00±0.121.00±0.121.00±0.08低氧處理組32.06±0.072.49±0.101.47±0.091.29±0.10t值11.7217.515.643.85P值<0.01<0.01<0.010.02組別樣本量不同時(shí)間點(diǎn)HIF-1α mRNA相對(duì)表達(dá)量8h24h48h72h常氧對(duì)照組31.00±0.111.00±0.161.00±0.061.00±0.05低氧處理組31.96±0.152.00±0.071.53±0.131.20±0.11t值8.749.936.552.70P值<0.01<0.01<0.01>0.05 注:(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)) VEGF:血管內(nèi)皮生長因子;HIF-1α:低氧誘導(dǎo)因子-1α Note:(Independent-samples t test) VEGF:vascular endothelial growth factor;HIF-1α:hypoxia-inducible factors-1α

2.2 2個(gè)組ARPE-19細(xì)胞處理8 h、24 h后樣品測序數(shù)據(jù)

常氧、低氧處理ARPE-19細(xì)胞8 h、24 h后測序共得到12組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，原始數(shù)據(jù)過濾掉測序接頭序列、未知堿基序列、低質(zhì)量序列后得到高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)clean reads(表3)。

表3 2個(gè)組ARPE-19細(xì)胞處理8h、24h后樣品測序數(shù)據(jù)過濾后的reads質(zhì)量統(tǒng)計(jì)Table 3 Quality statistics of filtered reads from the sequencing data after 8-hour and 24-hour treatment of ARPE-19 cells in the two groups樣本名稱過濾后readsreads數(shù)目(M)Q20(%)Q30(%)8h 常氧組122.8498.7895.188h 常氧組222.8498.7395.018h 常氧組322.8498.7895.328h 低氧組122.8898.8695.498h 低氧組222.8298.7695.158h 低氧組322.8798.7595.1424h常氧組125.1298.0093.9524h常氧組225.9597.6993.1724h常氧組325.9597.9093.7624h低氧組125.9597.8493.6124h低氧組223.9397.8093.5524h低氧組325.9497.7993.44 注:Q20為過濾后質(zhì)量不低于20的堿基比例,Q30為過濾后質(zhì)量不低于30的堿基比例 Note:Q20 was the ratio of bases with a quality of no less than 20 after fil-tration,and Q30 was the ratio of bases with a quality of no less than 30 after filtration

2.3 2個(gè)組ARPE-19細(xì)胞處理8 h、24 h后DEGs分析

低氧處理8 h和24 h后顯著DEGs中有9個(gè)相同基因(圖1)。低氧刺激ARPE-19細(xì)胞8 h和24 h后DEGs的分布情況見圖2。低氧處理8 h，低氧處理組與常氧對(duì)照組間相比共篩選出62個(gè)DEGs，其中顯著上調(diào)基因45個(gè)，顯著下調(diào)基因17個(gè)。低氧處理24 h，2個(gè)組間共篩選出255個(gè)顯著DEGs，其中顯著上調(diào)基因228個(gè)，顯著下調(diào)基因27個(gè)。

圖1 2個(gè)組ARPE-19細(xì)胞處理8 h、24 h后DEGs Venn圖 紫色表示處理8 h后顯著DEGs的基因個(gè)數(shù)；黃色表示處理24 h后顯著DEGs的基因個(gè)數(shù)；灰色表示處理8 h和24 h顯著DEGs中相同的基因個(gè)數(shù)

圖2 2個(gè)組ARPE-19細(xì)胞處理8 h、24 h后DEGs火山圖 A：低氧處理8 h DEGs火山圖 B：低氧處理24 h DEGs火山圖 FC：倍數(shù)變化；DEGs：差異表達(dá)基因

2.4 2個(gè)組ARPE-19細(xì)胞處理8 h、24 h后DEGs的聚類熱圖分析

每組3個(gè)生物學(xué)樣本重復(fù)性較好，同組樣本間具有較高的相關(guān)性，2個(gè)組各時(shí)間點(diǎn)在整體基因表達(dá)方面存在明顯差異(圖3)。

圖3 2個(gè)組ARPE-19細(xì)胞低氧處理8 h、24 h后DEGs聚類熱圖分析 每列代表1個(gè)樣品，每行代表1個(gè)轉(zhuǎn)錄本，顏色越紅則表達(dá)量越高，顏色越綠則表達(dá)量越低，2個(gè)組在整體基因表達(dá)方面存在明顯差異 A：低氧處理8 h DEGs聚類熱圖 B：低氧處理24 h DEGs聚類熱圖

2.5 2個(gè)組ARPE-19細(xì)胞處理8 h、24 h后DEGs的GO功能注釋分析

低氧處理8 h后2個(gè)組DEGs沒有顯著富集GO功能進(jìn)程，處理24 h后2個(gè)組DEGs經(jīng)過GO功能富集分析在25個(gè)生物學(xué)進(jìn)程條目、17個(gè)細(xì)胞組分條目、11個(gè)分子功能條目(P≤0.05)。對(duì)所有DEGs進(jìn)行GO功能注釋，結(jié)果顯示在生物學(xué)過程中前20個(gè)富集的條目功能主要為蛋白質(zhì)降解、核苷酸生物合成、超氧化物自由基清除、肌動(dòng)蛋白纖維及物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等進(jìn)程；在分子功能中，整合與催化活性條目富集程度最高；在細(xì)胞組分本體中，細(xì)胞條目富集程度最高(圖4)。

圖4 2個(gè)組ARPE-19細(xì)胞處理24 h后DEGs的GO功能富集分析圖 柱狀圖代表顯著富集的GO條目(P≤0.05)，折線代表該條目包含的基因個(gè)數(shù) A：GO功能分析 B：GO生物學(xué)進(jìn)程分析

2.6 2個(gè)組ARPE-19細(xì)胞處理8 h、24 h后DEGs的KEGG通路富集分析

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，低氧處理8 h后2個(gè)組間DEGs沒有KEGG顯著富集通路，處理24 h后2個(gè)組間DEGs篩選出17條KEGG顯著富集通路(P≤0.05)，主要富集在PI3K-Akt、cGMP-PKG信號(hào)通路以及其他與代謝、細(xì)胞周期、細(xì)胞生長和細(xì)胞凋亡、鐵死亡密切相關(guān)的信號(hào)通路(圖5)。

圖5 2個(gè)組ARPE-19細(xì)胞處理24 h后DEGs的KEGG通路富集分析 柱狀圖為顯著富集的KEGG通路條目(P≤0.05)；折線圖為富集KEGG通路靶基因個(gè)數(shù) 圖6 低氧處理ARPE-19細(xì)胞24 h后DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)圖 網(wǎng)絡(luò)圖中的連線代表基因間的調(diào)控關(guān)系，顏色越亮、圖標(biāo)越大代表該基因在網(wǎng)絡(luò)中與其他基因關(guān)系越密切，功能越重要

2.7 2個(gè)組ARPE-19細(xì)胞處理24 h后DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)分析

低氧處理ARPE-19細(xì)胞24 h后篩選到的DEGs通過String平臺(tái)得到關(guān)鍵基因HPCA、MT3和NOS3，所對(duì)應(yīng)的靶蛋白海馬素鈣結(jié)合蛋白(hippocalcin，HPCA)、金屬硫蛋白3(metallothionein，MT3)、一氧化氮合酶3(nutric oxide synthase，NOS3)可能是網(wǎng)絡(luò)中最重要的靶點(diǎn)蛋白(圖6)。

2.8 低氧處理ARPE-19細(xì)胞24 h后與低氧相關(guān)的DEGs的驗(yàn)證

低氧處理ARPE-19細(xì)胞24 h后，DEPP1、NPPB、PDZK1、HILPDA、TCEA3、NDRG1和RORC的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)，TFRC、NQO1的mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)(表4)，與測序結(jié)果變化一致。

表4 2個(gè)組ARPE-19細(xì)胞處理24h后DEGs mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較(mean±SD)Table 4 Comparison of relative mRNA expression levels of DEGs in ARPE-19 cells after 24-hour treatment between the two groups (mean±SD)組別樣本量各基因mRNA相對(duì)表達(dá)量DEPP1NPPBPDZK1HILPDANDRG1TCEA3RORCTFRCNQO1常氧對(duì)照組31.00±0.071.00±0.211.00±0.301.00±0.061.00±0.191.00±0.041.00±0.171.00±0.131.00±0.10低氧處理組37.95±0.454.05±0.322.97±0.272.36±0.331.79±0.031.53±0.204.13±0.590.29±0.010.27±0.03t值26.1913.51 8.39 6.95 7.15 4.42 8.84 9.13 7.62P值<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01<0.05<0.01<0.01<0.01 注:(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)) DEGs:差異表達(dá)基因 Note:(Independent-samples t test) DEGs:differentially expressed genes

2.9 低氧處理ARPE-19細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)活性熒光染色細(xì)胞狀態(tài)變化

低氧處理ARPE-19細(xì)胞8 h、24 h后，細(xì)胞形態(tài)均正常，生長狀態(tài)較好，未出現(xiàn)死亡細(xì)胞，低氧處理48 h后ARPE-19細(xì)胞出現(xiàn)死亡，低氧處理72 h后死亡細(xì)胞數(shù)量增加(圖7)。

圖7 低氧誘導(dǎo)后不同時(shí)間點(diǎn)ARPE-19細(xì)胞活性熒光染色(×200，標(biāo)尺=100 μm) 8 h、24 h時(shí)，細(xì)胞無死亡；48 h后細(xì)胞出現(xiàn)死亡；72 h后死亡細(xì)胞數(shù)量顯著增加 藍(lán)色熒光為Hochest33342標(biāo)記細(xì)胞核；紅色熒光為PI標(biāo)記已破膜的死細(xì)胞；綠色熒光為Calcein-AM標(biāo)記具有細(xì)胞活性的細(xì)胞

3 討論

缺血、缺氧影響視網(wǎng)膜疾病的發(fā)生和發(fā)展，是許多眼病共同的病理特征[17-18]。在細(xì)胞水平上，缺血、缺氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷包括線粒體酶活性降低、鈣穩(wěn)態(tài)損傷、能量衰竭和缺氧引起的氧化應(yīng)激[1]。因此，針對(duì)低氧誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的研究對(duì)于恢復(fù)正常的視網(wǎng)膜環(huán)境、干預(yù)和防止視網(wǎng)膜不可逆損傷至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)采用RNA-seq和生物信息學(xué)分析方法研究低氧誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞損傷的分子機(jī)制，為研究缺血、缺氧性視網(wǎng)膜疾病的病理過程提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

近年來隨著RNA-seq的迅速發(fā)展，其被廣泛地應(yīng)用于基因表達(dá)及調(diào)控的研究中[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，cGMP-PKG信號(hào)通路在低氧條件下參與細(xì)胞活化及抗氧化反應(yīng)，對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)作用。研究表明，NO-cGMP-PKG通路的激活被認(rèn)為是抑制細(xì)胞凋亡的重要途徑[21]；PI3K-Akt是HIF-1α的主要上游調(diào)控因子之一，在低氧損傷進(jìn)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[22]。低氧環(huán)境下，PI3K-Akt信號(hào)通路被激活，通過活化生存相關(guān)的蛋白和失活凋亡相關(guān)的蛋白調(diào)節(jié)HIF-1α的表達(dá)來發(fā)揮功能[23-24]，HIF-1α又可進(jìn)一步調(diào)控下游VEGF變化，促進(jìn)缺血適應(yīng)[4,25]。研究表明，通過PI3K/Akt通路可減弱氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷[26]。VEGF是一種重要的生長因子，與細(xì)胞和新生血管生長密切相關(guān)[3]。HIF-1α作為適應(yīng)缺氧反應(yīng)的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，缺氧條件下其表達(dá)量升高，能夠激活多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄、增加蛋白產(chǎn)物氧輸送、促進(jìn)代謝進(jìn)程以適應(yīng)低氧環(huán)境。HIF-1α和VEGF均為PI3K-Akt低氧相關(guān)信號(hào)通路的下游因子[23]，低氧可激活PI3K-Akt通路，VEGF和HIF-1α mRNA高表達(dá)是低氧誘導(dǎo)細(xì)胞損傷模型建立的關(guān)鍵指標(biāo)。

本研究進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)了處于核心位置的關(guān)鍵基因HPCA、MT3和NOS3，其中HPCA基因編碼的蛋白質(zhì)是視網(wǎng)膜和大腦中發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)元特異性鈣結(jié)合蛋白家族成員，在光感受器細(xì)胞中以鈣敏感方式調(diào)節(jié)光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。而低氧環(huán)境下，細(xì)胞內(nèi)的鈣穩(wěn)態(tài)極易被破壞，因此HPCA基因的表達(dá)易受缺氧的影響[27]；MT3基因在缺氧環(huán)境中易被誘導(dǎo)而表達(dá)升高，參與細(xì)胞抗氧化應(yīng)激和凋亡，該基因表達(dá)的蛋白可保護(hù)細(xì)胞免受低氧損傷[28]；NOS3基因主要參與精氨酸和脯氨酸的代謝及氧化應(yīng)激，可以促進(jìn)NO的產(chǎn)生，通過cGMP介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與血管平滑肌松弛過程，在缺血、缺氧時(shí)，通過調(diào)節(jié)活性氮與活性氧來減少細(xì)胞因缺血受到的損傷[29]。這些基因的功能主要與應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激相關(guān)。

本研究中低氧處理8 h與24 h測序重合的9個(gè)基因中，除TFRC、RORC基因可能參與低氧反應(yīng)，其余基因有關(guān)低氧方面的研究較少，與低氧誘導(dǎo)細(xì)胞損傷、代謝進(jìn)程等無明顯直接關(guān)系，因此本研究中選擇可能與低氧相關(guān)的基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與測序結(jié)果一致。其中黃體酮誘導(dǎo)的蛻膜蛋白由DEPP1基因編碼，參與低氧反應(yīng)與自噬等細(xì)胞途徑的激活，其表達(dá)受氧化應(yīng)激調(diào)控[30]；RORC基因可有效抑制HIF-1α的活性，并調(diào)控其轉(zhuǎn)錄表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的增生[31]；NDRG1在缺氧條件下表達(dá)明顯上調(diào)，在調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增生、凋亡、血管生成、腫瘤進(jìn)展方面發(fā)揮重要作用[32]；HILPDA是一種與缺氧誘導(dǎo)脂滴形成相關(guān)的基因，參與肝細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞等脂質(zhì)代謝進(jìn)程[33]；NPPB、PDZK1和TCEA3也多參與代謝、細(xì)胞的生長與分化等進(jìn)程。TFRC是參與鐵代謝的關(guān)鍵因子[34]，參與鐵死亡過程，低氧環(huán)境下TFRC mRNA的表達(dá)受HIF-1α的調(diào)節(jié)。因此進(jìn)一步研究鐵死亡信號(hào)通路在低氧誘導(dǎo)細(xì)胞損傷中的作用，將成為我們后續(xù)研究的重點(diǎn)之一。

本實(shí)驗(yàn)不僅在分子水平上進(jìn)行驗(yàn)證，還對(duì)低氧處理后ARPE-19細(xì)胞狀態(tài)的變化進(jìn)行表型研究。本實(shí)驗(yàn)推測，24～48 h的細(xì)胞可能處于對(duì)數(shù)生長期，此時(shí)細(xì)胞增生較多，密度增加；隨著缺氧時(shí)間的延長，細(xì)胞活力逐漸下降，至48 h出現(xiàn)細(xì)胞死亡，此時(shí)細(xì)胞增生能力也逐漸降低，細(xì)胞密度緩慢增加。本實(shí)驗(yàn)方案起始狀態(tài)細(xì)胞密度為2×104個(gè)/孔，相對(duì)較少。隨著觀察時(shí)間的延長，細(xì)胞會(huì)有不同程度的增生。此時(shí)會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞活性減弱，密度增加的現(xiàn)象。

本研究方法學(xué)的局限性：(1)缺血、缺氧性視網(wǎng)膜疾病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)環(huán)境及培養(yǎng)條件不能完全模擬體內(nèi)缺氧情況，還需通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證；(2)采用生物信息學(xué)方法分析低氧相關(guān)基因及信號(hào)通路的改變，但未對(duì)這些基因及信號(hào)通路做更深入的研究，仍需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探索。

綜上所述，本研究推測cGMP-PKG、PI3K-Akt、細(xì)胞凋亡、鐵死亡信號(hào)通路參與了ARPE-19細(xì)胞的低氧反應(yīng)，DEPP1、NPPB、PDZK1、HILDA、TCEA3、NDRG1、RORC、TFRC和NQO1基因可能在ARPE-19細(xì)胞應(yīng)對(duì)低氧損傷中起到關(guān)鍵作用。HPCA、MT3和NOS3基因可作為研究缺血、缺氧相關(guān)眼底病的潛在功能性靶基因。這些通路及基因與缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷有一定相關(guān)性，在視網(wǎng)膜缺血、缺氧疾病的病理過程中發(fā)揮重要作用，有望成為治療缺血、缺氧性視網(wǎng)膜疾病的新靶點(diǎn)。

利益沖突所有作者均聲明不存在任何利益沖突